其它有用的扩增 指标包括"T时间"和"TArc"。值得注意的是，用于确定TArc值的不同办法采用方向相似 的矢量（即产生仅仅标识为"TArc"的值）和方向相反的矢量（即产生标识为"OTArc"的 值）。还有其它技术牵设作为反应期间信号（优选巧光信号）等于静态阔（例如预定的静 态阔值）时的时间或循环数鉴定循环阔（例如"Ct")值。稍后下文给出运些方法的一般描 述。
[0064]确定T时间估的方法 W65] 简言之，T时间值评估实时扩增反应中指示扩增子生成的特定阔通过时的时间。流 水号60/659, 874的美国专利申请中已经记载了用于计算和使用T时间值的算法（通过援 引收录其公开内容）。依照运种算法，将曲线拟合规程应用于标准化的且经过背景调节的 数据。虽然可采用任何公知的曲线拟合方法学，但是在一个优选实施方案中采用线性最小 二乘（"化S")曲线拟合。只对预定低限和高限之间的一部分数据实施曲线拟合。找到拟 合数据的曲线之后，终极目标是评估与曲线或其投射与预定静态阔值交叉时的点对应的时 间。在一个实施方案中，标准化数据的阔是0. 11。凭经验确定高和低限，该范围上拟合至多 个对照数据集的曲线在与给定阔值有关的时间中展现最小变异性。在一个实施方案中，低 限是0. 04且高限是0. 36。为数据拟合曲线，自低限W下的第一个数据点延伸穿过越过高 限的第一个数据点。接着，确定拟合的斜率是否是统计学显著的。例如，如果一阶系数的P 值小于0.05,那么认为拟合是显著的，并继续处理。否则，停止处理。或者，可W通过R2值 来确定数据的有效性。为拟合的曲线确定线性曲线y=mx+b的斜率m和截距b。凭借该信 息，能确定T时间。
[0066]确定TArc估的方法
[0067] 使用对实时运行曲线进行的基于矢量的分析确定称作"TArc"和"OTArc"的时间 依赖性扩增指标。TArc值鉴定在时间上生长曲线开始弯曲或"曲折"向上的点。可使用运个 确定的点来创建标准曲线或建立与测试样品中分析物多核巧酸的量或浓度有关的扩增反 应参数。最方便的是使用具有在基本上均匀的时间间隔上分布的数据点的生长曲线进行矢 量分析。关于TArc和OTArc值的确定和使用的详细介绍出现于美国专利No. 7, 739, 054 (通 过援引将其收入本文）。
[0068]优洗的系统巧巧备
[0069] 方便地使用计算机或类似处理装置（此后"计算机"）执行本文中公开的方法。在 不同优选实施方案中，可W在如下的计算机的记忆构件中加载或W其它方式保持用于实施 算法的软件或机器可执行指令，该计算机是独立式的或是连接用于监测（优选作为时间的 函数）经历分析的产物的量的装置。在一个高度优选的实施方案中，在如下的计算机的记 忆构件中保持用于执行校准算法的软件，该计算机连接能够作为时间的函数监测反应混合 物中存在的扩增子的量的装置或是该装置的整合部分。
[0070] 用于控制实时扩增装置的控制器系统和/或实时扩增装置的检测系统任一或二 者确实可偶联适当编程的计算机，该计算机发挥依照预编程或用户输入的指令指导运些仪 器操作的功能。计算机优选还能自运些仪器接收数据和信息，并解读、处理和报告此信息给 用户。
[0071] 一般而言，计算机通常包括用于接收用户指令的适宜软件，或是用户输入一套参 数字段的形式，或是预编程指令（例如为多种不同特定操作预编程）的形式。然后软件将 运些指令转变成适宜语言用于指导实时扩增控制器操作W进行期望操作。计算机还能够自 一台或多台系统内包括的传感器/检测仪接收数据，并依照编程解读数据。系统优选包括 将作为时间的函数呈现感兴趣核酸的扩增拷贝的数量（如由检测仪检测的）的生长曲线的 特征与测试样品中存在的感兴趣核酸的拷贝数关联起来的软件。
[0072] 优选地，当用于执行所公开的校准算法的计算机是用于实施和分析实时核酸扩增 反应的设备的整合构件时，设备优选包含溫度控制的溫箱、用于收集信号的检测装置、用于 分析信号的分析装置（例如计算机或处理器）和用于显示由分析装置获得或生成的数据的 输出装置。分析装置可经由本领域知道的输入装置连接溫度控制的溫箱，和/或连接本领 域知道的用于数据显示的输出装置。在一个实施方案中，溫度控制的溫箱能够进行溫度循 环。
[0073] 一般而言，在与所公开的方法联合中有用的用于实施实时核酸扩增的设备的各种 构件会是本领域普通技术人员熟悉的常规构件。用于实施和分析实时核酸扩增的溫度控制 的溫箱可W是常规设计的，能保持多个反应管，或能在标准扩增反应管中的溫度控制块中 或在多孔板的孔中保持多个反应样品。在一个方面，检测系统适合于检测来自一种或多种 巧光标记物的光学信号。可W将检测系统的输出（例如与扩增反应期间生成的那些对应的 信号）供应给计算机进行数据存储和处理。在一个实施方案中，系统检测多种不同类型的 光学信号（诸如多种不同类型的巧光标记物）且具有微量板巧光读数仪的能力。检测系统 优选是含有激发光源（它可W是可见光激光或紫外灯或面素灯）的多路巧光计、用于将激 发光分配给各个反应管及自反应管接收巧光的多路装置、用于通过它们的波长将巧光与激 发光分开的滤光手段、和用于测量巧光强度的检测手段。优选地，溫度控制的溫箱的检测系 统提供宽检测范围，容许巧光团选择的灵活性、高灵敏度和卓越的信噪比。通常将由检测系 统接收的光学信号转变成处理器能处理的信号，W提供用户能在与处理器通讯的用户装置 的显示器上查看的数据。用户装置可包含用户界面，或者可W是带有键盘和视频监测器的 常规商品化计算机系统。用户装置能显示的数据的例子包括扩增曲线图、散布图、针对组装 中的所有管或反应容器及针对使用的所有标记物的样品值屏、光学信号强度屏（例如巧光 信号强度屏）、最终调用结果、文本报告、等等。
[0074] 计算化括序产品
[00巧]本发明的范围内包括可用于实施数据处理方法的基于软件的产品（例如用于指 导计算机执行各个规程步骤的软件的有形体现）。运些包括存储在计算机可读介质（诸如 磁介质、光学介质、"闪光"记忆装置、和计算机网络）上的软件指令。同样，本发明涵盖扩增 核酸、检测核酸扩增产物、和处理结果W指示测试样品中祀的定量结果的系统或设备。虽然 设备的各种构件优选W合作方式发挥功能，但是不要求构件是整合组装的一部分（例如在 一个底盘上）。然而，在一个优选实施方案中，设备的构件彼此连接。"连接"的含义内包括 经有线和无线连接的连接。
[0076] 特别地，包括与扩增核酸并作为循环数或时间的函数监测扩增子合成的装置连接 的计算机的设备或系统落在本发明的范围内，其中计算机编程为执行本文中公开的定量算 法。依照本公开文本的一种例示性系统会包括溫度控制的溫箱和能够监测和区分至少两种 巧光发射波长的巧光计。可使用运些发射来指示祀扩增子合成和1C扩增子合成。
[0077] 单点巧准巧巧巧准规括方俩随化存取巧式
[0078] 使用实时扩增量化测试样品中的祀核酸的现代"随机存取"装置会有利地允许终 端用户上和下仪器循环试剂多次。因此，一个试剂盒的试剂可W在完全使用试剂盒之前加 载/卸载数次。结果是，可能必须再运行校准曲线图（例如每次将试剂盒加载到仪器上时）。 如果每次校准或再校准规程采用两种或更多种校准物的话，会消耗大量的试剂盒资源来提 供随机存取特征。然而，运个过程可W使用本文中公开的固定点办法来简化。
[0079] 在一个优选实施方案中，由测定法制造商建立固定点，然后与试剂盒的购买联合 提供给消费者或终端用户。例如，可W在测定法制造商的场所处的仪器上扩增校准标准品 集合，由此为分析物多核巧酸标准品和1C每一种测定扩增指标。将运些值彼此相除（例如 Ct祀/CtIC)建立比值，它们可W使用电子表单软件绘图。拟合曲线或线至收集的点产生第 一校准曲线图。延伸校准曲线图至比值等于零处的点鉴定可用作固定点的点。更特别地， 可使用输入祀量或浓度会对应于比值零处的外推点作为固定点来绘制相同仪器或甚至不 同仪器上的校准曲线图。换言之，所有使用一种调节校准物绘制的校准曲线图会共享该同 一固定点。
[0080] 在一个不同优选实施方案，要用于内部校准调节的固定点可W由终端用户仅使用 本地仪器来制备。例如，运可W牵设确定预期产生比值零的分析物多核巧酸标准品的输入 量或浓度。当然，运会需要额外的努力，至少最初在终端用户的部分上。或许平衡运一点是 创建对特定仪器特异性的参照曲线的可能好处。
[0081] 在某些实施方案中，可W由终端用户在第一次使用试剂盒时在本地仪器上建立常 规校准曲线图。运可W牵设实施两个校准反应。可W测定两种校准物中祀和1C扩增的时 间依赖性或循环数依赖性，并标准化，例如通过将祀的指标除W同一反应中扩增的1C的指 标。可使用两个点建立校准曲线图，它可立即用于量化测试样品中的祀核酸。分开地，可W 投射所得校准曲线图W鉴定与比值零有关的输入祀数量或浓度所对应的点。可W使用运个 投射点作为固定点来绘制再校准曲线图。虽然没有用于创建初始校准曲线图，但是可存储 鉴定的固定点，供与再校准规程联合使用。
[0082] 可使用少至一种调节校准物来进行系统再校准。鉴于固定点的可得性，可W将祀 和共扩增的1C的扩增指标标准化W给出比值，并将标准化结果与固定点组合使用W产生 完全校准曲线。
[0083] 一般而言，实施使用最少资源的校准和再校准规程来进行定期仪器校准显然是有 利的。节约实验室资源确实是采用单点系统校准或再校准规程的一个原因。
[0084] 洗择参照巧准曲线巧固定点的优洗方法
[0085] 可多种方式确定祀和1C的扩增指标（作为输入祀量或浓度的函数）的比的 校准曲线图上的固定点，如所公开的校准办法中采用的。在某些优选办法中，组合来自使用 不同实时扩增和检测仪器扩增和检测多种校准标准品的合并结果，并将一条最佳拟合校准 曲线拟合至合并数据（即来自不同校准标准品每一种的合并扩增指标数据点）。运有效地 均衡在不同仪器（例如属于测定法制造商和终端用户）上进行测定法产生的校准曲线图中 的变异。在一种备选办法中（在本文中的实施例中演示），使用来自仅一台实时仪器的结果 建立一条校准曲线。一般而言，一旦通过一些手段建立校准曲线，接着是选择要用于与来自 在相同或不同仪器上运行的一种调节校准物的结果组合的固定点的过程。运可W牵设测试 来自校准曲线的候选点（例如与不同校