一种Nav1.7抑制剂及其改造方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于药物开发领域，尤其是涉及一种Navi. 7抑制剂及其改造方法。
【背景技术】
[0002] 接近25%的人会发生从生病起至少持续三个月的慢性疼痛，已有的镇痛药物主要 作用于中枢神经系统，对慢性疼痛的治疗效果不明显。痛觉是机体受到伤害性刺激时的一 种保护性反应，痛觉信号通过初级感觉神经传至脊髓后角，换元后通过感觉传导上行通路 传至大脑皮层和边缘系统，引起痛觉。背根神经节（DRG)神经元作为躯体感觉传入的初级 感受神经元，是介导痛觉、生理性体表感觉和位置等信号的最初感受器。
[0003] 电压门控性钠（Nav)l.7主要表达在小型的DRG神经元和交感神经节的神经元，在 疼痛信号的传导过程中起关键作用。在小型DRG痛觉受器，Navi.7位于周围神经末梢、体细 胞、中央轴突投射和突触前终端。具体来说，Navi. 7表达c-纤维神经末梢作为合并和放大 小型的受体去极化的阈值通道，使膜电位达到动作电位阈值，因此在疼痛信号起始阶段起 到重要作用。Navi. 7离子通道的选择性抑制剂几乎可用于各种疼痛的治疗。因此，Navi. 7 离子通道的高度选择性抑制剂是目前镇痛药物研发的热点。
[0004] 多肽毒素作为镇痛类药物是毒素类药物的一个主要研究方向，因为多肽毒素可作 用于离子通道受体、乙酰胆碱受体、G-蛋白耦合受体等。目前已上市的药物中至少有7个 是源于毒素的，比如ziconitide，一种选择性地阻断N-型电压门控钠通道的镇痛药物。
[0005] 近年来研发了一系列针对Navi. 7选择性抑制的肽类毒素，如从狼蛛毒液中提取 的Protx-II，GpTx-Ι，以及从少棘蜈蚣毒液中纯化得到的多肽毒素Ssm6a，在这些多肽中， Ssm6a最广泛地抑制Na+各亚型通道，Ssm6a是含有45个氨基酸的多肽，抑制Navi. 7的1C5。 值是25nM，其对Navi. 7的抑制作用是Navi. 2的32倍，是其他亚型的Na+通道的150倍， 因此是一种很有潜力的Navi. 7抑制剂类镇痛药物。动物实验均证明Ssm6a可特异性阻断 Navi. 7电流并明显减轻外周神经痛，相关专利（CN201210453532. 1)已公开Ssm6a具有很好 的热稳定性和蛋白酶稳定性，在血浆中的稳定性也比较好，对福尔马林引起的疼痛的II相 镇痛效果明显，但对酸、热引起的疼痛药效仅达4h，很可能是由于该多肽被肝脏和肾清除的 速率较快，在体内容易降解失活而降低药效；而且生理活性方面的研究均是用少棘蜈蚣毒 液中提取得到的多肽，这种获得方式工序复杂、成本较高，从而使这些肽类毒素的使用受到 限制，故研发既保持高度生物活性，又能容易获取的生物稳定性的肽类毒素已成为下一步 的研发目标，具有广泛的开发和应用前景。
[0006] 毒素多肽的分子量小，其大小一般少于60个氨基酸，二硫键富集，且二硫键为维 持毒素多肽结构稳定的主要化学键，因此其生物活性受突变、重组产物工业生产和化学合 成的影响很大，且很难对其进行优化，如ProTx-II需要不断地优化因为其在大鼠模型上对 炎症疼痛的镇痛效果明显降低，且治疗浓度范围也较窄，在0.lmg/kg浓度时就会成为大鼠 的致死浓度，但至今未见有对ProTx-II优化的突变体的报道。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种有效抑制Navi. 7离子通道的抑制剂，该抑制剂是能在 原核胞内表达系统中大量表达的融合蛋白。
[0008] 本发明的技术方案是： 一种Navi. 7抑制剂，该抑制剂为分子量大于lOOOODa的融合蛋白，包括以SEQIDN0:2 为模板的蛋白突变体和能阻断Navi. 7电流的多肽。
[0009] 该抑制剂还可以包括连接肽，连接肽位于以SEQIDN0:2为模板的蛋白突变体与 能阻断Navi. 7电流的多肽之间。具体地，连接肽的序列包括但不限于：GGGGS，GGSGG，GS， PSTSTST，EIDKPSQ及其多聚体之一。
[0010] 以SEQIDN0:2为模板的蛋白突变体为SEQIDN0:2第14-31位由氨基酸 插入、删除和置换所形成的突变体，所述插入、删除和置换的氨基酸为天然氨基酸。具 体地，SEQIDN0:2第14-31位突变的序列为：XXDXwSX(n)AX(1)，X为任一天然氨基酸， 1彡m彡5，1彡η彡8，1彡i彡8,3彡m+n+i彡13。更具体地，所述SEQIDN0:2的蛋白 突变体的蛋白序列为SEQIDN0:3。
[0011] 所述能阻断Navi. 7电流的多肽为毒素多肽。
[0012] 所述能阻断Navi. 7电流的多肽为氨基酸个数小于等于60的多肽。
[0013] 所述能阻断Navi. 7电流的多肽为富含二硫键的多肽。具体地，所含二硫键的数量 为含有3对以上二硫键。
[0014] 所述能阻断Navi. 7电流的多肽其序列为SEQIDN0:5。
[0015] 本发明的抑制剂是序列为SEQIDNO: 1的融合蛋白，该融合蛋白能够在大肠杆菌 中的胞内可溶表达。
[0016] 本发明的抑制剂在?μΜ的浓度下能实现对于DRG细胞TTX-敏感的钠电流90%以 上的抑制；该抑制剂在?μΜ的浓度下与DRG孵育后，在被冲洗的情况下能够至少在500s时 间内保持钠电流抑制作用； 本发明还提供一种改造Navi. 7抑制多肽的方法：将能阻断NaVl. 7电流的抑制剂多肽 与上述以SEQIDN0:2为模板的蛋白突变体连接在一起，能够在大肠杆菌胞内可溶表达出 能阻断Navi. 7电流的融合蛋白。
[0017] 该方法构建的融合蛋白还可以采用连接肽来连接Navi.7抑制剂多肽和以SEQID NO:2为模板的蛋白突变体。
[0018] 该方法中所述Navi. 7抑制剂多肽为毒素多肽；所述Navi. 7抑制剂多肽为氨基 酸个数小于等于60的多肽；所述Navi. 7抑制剂多肽为含有3对以上二硫键的多肽；所述 Navi. 7抑制剂多肽其序列为SEQIDN0:5。
[0019] -种核酸，该核酸编码上述任一种蛋白或多肽序列。
[0020] -种表达载体，载体中包含上述核酸。
[0021 ] -种药物，该药物包含以上所述任一种蛋白序列。
[0022] 本发明中，经过对M-FABP蛋白（SEQIDN0:2)进行改造，与毒素多肽Ssm6a(SEQ IDN0:5) -起构建成一个新的融合蛋白SP-T0X(SEQIDN0:1)，该融合蛋白能够在E.coli 胞内高效表达，能选择性且有效地抑制大鼠DRG神经元的Navi. 7离子通道，且结合后的洗 脱速率，与Ssm6a相比低10倍，有效地减少了大鼠的炎症疼痛，因此该方法能够用于一系列 具有Navi. 7抑制作用的多肽的改造，尤其适合富含二硫键的毒素多肽的改造，适合于对序 列的改造比较敏感且大量生产有困难的多肽。
[0023] 所述融合蛋白SP-T0X(SEQIDNO: 1)包括176个氨基酸，分子量为19550. 6Da，理 论等电点为5. 6。中间为编码连接多肽的序列（SEQIDN0:4)，连接多肽序列的上游为编码 结构蛋白的序列（SEQIDN0:3)，下游为编码有镇痛活性多肽的序列（SEQIDN0:5)。
[0024]M-FABP为人类肌肉脂肪酸结合蛋白的支架部分（Thescaffoldofhumanmuscle fattyacidbindingp;rotein，SC0Pid:dlhmsa_)，其序列为SEQID:2，其结构为10个β 反平行链形成β折叠，折叠帽包括两个短的α-螺旋，位于第一条和第二条β链之间，经 过与其结构同源的蛋白（SCOPId:dlr0ua_)进行比对，可以看出其在折叠帽区的序列不一 样，即折叠帽区是可以接受较大突变的，其可接受的范围跨度最少为20个氨基酸，因此我 们选择在其折叠帽区域具体分析为第14-31位（FDDYMKSLGVGFATRQVA)进行突变，可保持其 结构稳定，进一步分析，发现在固定位点进行突变（XXDXWSXWAXW，X为任一天然氨基酸， l<m<5，l<n<8，l<i<8,3<m+n+i< 13)更利于结构的稳定性。
[0025] 本发明中用一段对结构稳定性影响较小的一段新的序列（WIDTYSGVPTYADDFEG) 置换原始的螺旋结构序列第14-31位（FDDYMKSLGVGFATRQVA)，且通过连接肽GGSGG连接 Ssm6a，形成融合蛋白SP-T0X。本发明中还构建了SP-T0X-cc2ss，即将Ssm6a部分的两个 相邻的半胱氨酸置换为丝氨酸，阻断Ssm6a的天然二硫键的形成，作为对比蛋白，用来验证 SP-T0X的活性。
[0026] 由于毒素多肽通常由小于60个的氨基酸组成，且富含二硫键，二硫键为维持毒素 多肽结构稳定的主要化学键，且其分子量较小，因此毒素多肽应用于临床有两个局限性，一 是毒素多肽如Ssm6a依靠二硫键的折叠维持他们的结构稳定性和发挥生物学活性，合成或 重组的多肽易产生二硫键错配或导致生物活性降低或丧失，例如，Ssm6a有3个二硫键可形 成15个异构体，化学合成的Ssm6a，即使是折叠成热力学最稳定的异构体，在luM的浓度下 对Navi. 7没有活性；二是这些毒素多肽很难优化，因为其结构出现微小的改变都会引起生 物活性的改变，因此难以直接对毒素多肽进行优化。例如，另一种蜘蛛毒素多肽GsAFl，与 ProTx-II有着90%的同源性，仅有4个氨基酸的差异，但是他们对Navi. 7的抑制效果却相 差10倍。因此对先导化合物的常规突变策略不适合于这些毒素多肽。
[0027]另外毒素多肽类的生产上，其生物提取的方法操作复杂且产量低，其在工程细胞 中的表达则为首选的大量制备的方法，由于毒素多肽的二硫键在细胞质的还原环境中难以 形成，导致毒素多肽在细胞质中的表达很困难，只能通过与信号肽形成融合蛋白转运到大 肠杆菌的细胞