修饰的胶原蛋白分子的制作方法
【专利说明】
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求于2013年5月9日提交的新加坡申请号201303597-7的优先权权益， 该申请的内容整体地通过引用合并于此用于所有目的。
技术领域
[0003] 本发明属于生物材料及其合成分领域，具体地，胶原蛋白分子的领域。
【背景技术】
[0004] 生物材料是能够在生物学系统中交互作用的天然或合成材料。生物材料的重要应 用是用于组织工程的支架。最常见的支架之一是基于胶原蛋白的支架。
[0005] 胶原蛋白是哺乳动物组织中的主要结构成分，并介导大量的生物学过程。其独特 的分级自组装性质，以及体内的高丰度，使得其成为了仿生学领域中有吸引力的支架。除了 胶原蛋白以外，糖胺聚糖（GAG)也充当组织中必不可少的成分。这些高度带负电荷的大分 子调节许多重要的生理过程和基于胶原蛋白的支架的机械特性。然而，来源于天然材料的 胶原蛋白-GAG复合材料具有缺点。例如，与天然材料相关联的免疫原性、批次间变异、和复 杂的纯化。这些缺点已经阻碍了产生用于工程化细胞外环境的明确的分子工具的努力。
[0006] 因此本发明寻求提供改进的胶原蛋白-支架。
【发明内容】
[0007] 在第一个方面，提供了一种胶原蛋白分子，其包含三条链，其中至少一条链包含至 少一个具有下式的重复单元：
[0008] (Xl-X2-G)n ；
[0009] 其中Xl或X2可以是任意氨基酸或氨基酸衍生物，前提条件是Xl或X2中的至少 一个是糖胺聚糖配基；
[0010] G是甘氨酸；且
[0011] η为正整数且为至少1。
[0012] 在第二个方面，提供了如本文所定义的胶原蛋白分子，其用在疗法中。
[0013] 在第三个方面，提供了一种治疗需要疗法的患者的方法，包括施用如本文所定义 的胶原蛋白分子。
[0014] 在第四个方面，提供了如本文所定义的胶原蛋白分子，其用于化妆品中。
[0015] 在第五个方面，提供了如本文所定义的胶原蛋白分子，其用于组织工程中。
[0016] 在第六个方面，提供了如本文所定义的胶原蛋白分子，其用于构建支架中。
[0017] 在第七个方面，提供了一种组合物，其包含如本文所定义的胶原蛋白分子和一种 或多种赋形剂。
[0018] 在第八个方面，提供了如本文所定义的胶原蛋白分子，其用于基于糖胺聚糖的药 物中。
[0019] 在第九个方面，提供了如本文所定义的胶原蛋白分子，其用作用于组织工程的生 物材料。
[0020] 在第十个方面，提供了如本文所定义的胶原蛋白分子，其用于药物递送或伤口愈 合中。
【附图说明】
[0021] 结合非限制性实施例和附图考虑，参照【具体实施方式】，将更好地理解本发明，在附 图中：
[0022] 图1由图IA和IB构成，显示了本文公开的胶原蛋白分子的示意性实施例。图IA 显示了具有三条链的胶原蛋白分子的示意性图示，其中一条链包含重复单元。图IB显示了 具有三条链的胶原蛋白分子的示意性图示，其中两条链或三条链包含重复单元。图1图示 了在一条链内或链间，重复单元可以是相同的或不同的。图1还图示了在指定的链内或链 间，重复单元可以重复相同或不同的次数。
[0023] 图2由图2A和2B构成。图2A显示本领域已知的胶原蛋白-GAG肽的示意性图 示。图2B显示本发明的胶原蛋白-GAG肽的示意性图示。如图2中显示的GAG配基可以是 任意的GAG配基。图2中显示的氨基酸或氨基酸衍生物可以是任意氨基酸或任意氨基酸衍 生物。
[0024] 图3显示异质GAG配基链和如本文公开的包含同质GAG配基的同质胶原蛋白链之 间的差异。
[0025] 图4显示可以在本发明中使用的多种GAG配基的实施例。
[0026] 图5由图5A和5B构成。图5A显示在胶原蛋白模拟肽中CS-A二糖和带正电荷的 氨基酸之间的静电相互作用的示意性图示。图5B显示使用的肽的结构。
[0027] 图6由图6A-6F构成。图6A显示肽1的⑶光谱。图6B显示肽2和3的⑶光谱。 图6C和6D显示肽1 · 2的1:2混合物的相对于温度的热变性曲线和一阶导数作图。图6E 和6F显示肽1 · 3的1:2混合物的相对于温度的热变性曲线和一阶导数作图。
[0028] 图7由图7A和7B构成，并且显示了肽1 · 2(图7A)和肽1 · 3(图7B)的1:2混 合物的CD光谱。
[0029] 图8由图8A-8D构成，并且显示了肽4(图8A)、肽1 · 4的1:2混合物（图8B)、 CS-A二糖和肽4的4:1混合物（图8C)的1H、15N-HSQC光谱，肽1 · 3的1:2退火混合物的 DSC解链曲线图（图8D)。
[0030] 图9由图9A-9B构成，并且显示了 CS-A二糖和肽4的4:1混合物（图9A)、10:1 混合物（图9B)的1H、15N-HSQC光谱。
[0031] 图10显示了肽1的分析性HPLC迹线（顶部）和ESI质量数据（底部）。
[0032] 图11显示了肽2的分析性HPLC迹线（顶部）和ESI质量数据（底部）。
[0033] 图12显示了肽3的分析性HPLC迹线（顶部）和ESI质量数据（底部）。
[0034] 图13显示了肽4的分析性HPLC迹线（顶部）和ESI质量数据（底部）。
[0035] 图14显示了肽5的分析性HPLC迹线（顶部）和ESI质量数据（底部）。
[0036] 图15显示了在如方案1中所绘合成如上所定义的含有GAG的胶原蛋白肽1的方 法的一个实施方案中，从三氯乙酰亚胺酯4转化后，完全保护的二糖5的 1H NMR光谱。
[0037] 图16显示了在如方案1中所绘合成如上所定义的含有GAG的胶原蛋白肽1的方 法的一个实施方案中，从三氯乙酰亚胺酯4转化后，完全保护的二糖5的 13C NMR光谱。
[0038] 图17显示了在如方案1中所绘合成如上所定义的含有GAG的胶原蛋白肽1的方法 的一个实施方案中，用η-三丁基锡烷和AIBN将N-三氯乙酰基经自由基介导还原为N-乙 酰基同类物后，乙酰胺6的 1H NMR谱。
[0039] 图18显示了在如方案1中所绘合成如上所定义的含有GAG的胶原蛋白肽1的方法 的一个实施方案中，用η-三丁基锡烷和AIBN将N-三氯乙酰基经自由基介导还原为N-乙 酰基同类物后，乙酰胺6的 13C NMR谱。
[0040] 图19显示了在如方案1中所绘合成如上所定义的含有GAG的胶原蛋白肽1的方 法的一个实施方案中，在水解6的亚苄基乙缩醛，接着去除TMS基团后，二醇7的 1H NMR谱。
[0041] 图20显示了在如方案1中所绘合成如上所定义的含有GAG的胶原蛋白肽1的方法 的一个实施方案中，在水解6的亚苄基乙缩醛，接着去除TMS基团后，二醇7的 13C NMR谱。
[0042] 图21显示了在如方案1中所绘合成如上所定义的含有GAG的胶原蛋白肽1的方 法的一个实施方案中，在选择性苯甲酰化二醇7的C6羟基后，二糖8的 1H NMR谱。
[0043] 图22显示了在如方案1中所绘合成如上所定义的含有GAG的胶原蛋白肽1的方 法的一个实施方案中，在选择性苯甲酰化二醇7的C6羟基后，二糖8的 13C NMR谱。
[0044] 图23显示了在如方案1中所绘合成如上所定义的含有GAG的胶原蛋白肽1的方 法的一个实施方案中，在用SO 3 ?三甲胺复合物处理8后，硫酸化二糖基序的1H NMR谱。
[0045] 图24显示了在如方案1中所绘合成如上所定义的含有GAG的胶原蛋白肽1的方 法的一个实施方案中，在用SO 3 ?三甲胺复合物处理8后，硫酸化二糖基序的13C NMR谱。
[0046] 图25显示了在如方案1中所绘合成如上所定义的含有GAG的胶原蛋白肽1的方 法的一个实施方案中，在LiOOH和NaOH的相继处理后，所需CS-A二糖9的 1H NMR谱。
[0047] 图26显示了在如方案1中所绘合成如上所定义的含有GAG的胶原蛋白肽1的方 法的一个实施方案中，在LiOOH和NaOH的相继处理后，所需CS-A二糖9的 13C NMR谱。
【具体实施方式】
[0048] 胶原蛋白是哺乳动物组织中介导许多生物学过程的主要结构成分。目前，已知有 28种不同类型的胶原蛋白，这些类型的实例包括但不限于I型胶原蛋白、II型胶原蛋白、 III型胶原蛋白、IV型胶原蛋白和V型胶原蛋白。在这些类型中，I型胶原蛋白在身体中最 丰富并且见于皮肤中。I型胶原蛋白也是组织工程中最常使用的胶原蛋白。天然存在的胶 原蛋白具有由三个蛋白股或三条蛋白链组成的三螺旋结构。本领域技术人员要理解的是不 同类型的胶原蛋白由不同类型的蛋白链组成。例如，I型、IV型和VIII型胶原蛋白由两条 a 1链和一条α 2链构成，II型、II VII型和X型胶原蛋白由三条a 1链构成，VI型胶原 蛋白由一条α 1、一条α 2和一条α 3链构成。如本文所公开的胶原蛋白分子的修饰可以对 胶原蛋白分子的一股或多股进行。在一个实例中，VI型胶原蛋白的一条α?链被修饰。在 另一个实例中，X型胶原蛋白的两条α 1链被修饰。
[0049] 本领域技术人员要理解的是胶原蛋白的一个区别性特征是在胶原蛋白分子的每 条链或每股中存在氨基酸的重复单元。这种重复的氨基酸单元是Gly-Pro-X或Gly-X-Hyp, 其中X是任意氨基酸，且Hyp是脯氨酸的衍生物，羟基脯氨酸。
[0050] 胶原蛋白分子可以被修饰或合成以赋予所需的特性诸如稳定性、在胶原蛋白分子 的一股上的总电荷以及与其他分子的相互作用。
[0051] 因此，在第一个方面，本发明提供了一种胶原蛋白分子，包含三条链，其中至少一 条链包含至少一个具有下面通式的重复单元：
[0052] (Xl-X2-G)n ；
[0053] 其中Xl或X2可以是任意氨基酸或氨基酸衍生物，前提条件是Xl或X2中的至少 一个是糖胺聚糖配基；
[0054] G是甘氨酸；且
[0055] η为正整数且为至少1。
[0056] 例如，η可以是至少2、至少5、至少10、至少20、至少50、至少100、至少200、至少 500或至少1000。在一个实例中，η为1-10、2-5、2-4或10-50。在一个实例中，η是4。包 含上述值中的任一个的任何范围也是可能的。因此，通常将理解η不存在上限。
[0057] 当在本文中使用时，术语"氨基酸"是指带电荷的、不带电荷的、极性的、非极性的、 芳族的、非芳族的氨基酸并且可以包括天然存在的氨基酸以及非天然存在的氨基酸。天然 存在的氨基酸、标准的或典型的氨基酸是指蛋白氨基酸。这些氨基酸的实例包括但不限于 20种必需氨基酸诸如，脯氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、酪 氨酸和天冬酰胺。非天然存在的氨基酸、非典型氨基酸或非天然氨基酸的实例是指20种 必需氨基酸以外的氨基酸，包括但不限于非蛋白氨基酸、N-甲基氨基酸、D-氨基酸、二氨基 酸、脯氨酸和丙酮酸衍生物、甘氨酸衍生物和已经被修饰的氨基酸。
[0058] 当在本文中使用时，术语"氨基酸衍生物"是指已经通过添加或去除一个或多个官 能团而修饰的氨基酸或其手性已经被修饰的氨基酸。氨基酸衍生物的实例包括但不限于羟 基脯氨酸和被保护的氨基酸诸如Fmoc和Boc保护的氨基酸。
[0059] 在本文公开的胶原蛋白分子的一个实例中，胶原蛋白分子具有三条链，其中所述 至少一个重复单元处于一条链中。要理解包含重复单元的链的剩余部分由氨基酸或氨基酸 衍生物构成。还要理解剩余的链仅由氨基酸、氨基酸衍生物或它们的混合物构成。在本文 公开的胶原蛋白分子的另一实例中，胶原蛋白分子具有三条链，其中至少一个重复单元处 于两条链中。要理解包含重复单元的链的剩余部分由氨基酸或氨基酸衍生物构成。还要理 解剩余的链仅由氨基酸、氨基酸衍生物或它们的混合物构成。还在本文公开的胶原蛋白分 子的另一实例中，胶原蛋白分子具有三条链，其中至少一个重复单元处于所有三条链中。要 理解链的剩余部分由氨基酸或氨基酸衍生物构成。此外，本领域技术人员很容易理解的是 链内的重复单元可以是不同的或者η可以是不同的。本领域技术人员还很容易理解的是在 链间重复单元可以是不同的或在链间η可以是不同的。例如，在一个胶原蛋白分子的任意 指定链中，一个重复单元可以重复5次，而不同的重复单元可以重复10次，而在同一分子的 第二条链中第一重复单元或另一个重复单元可以重复20次，并且第三条链仅由氨基酸或 氨基酸衍生物构成。
[0060] 出于清楚的缘故，本文公开的胶原蛋白分子的实例示例性地呈现于图1中。图IA 显示了本文公开的其中所述至少一个重复单元在一条链上的胶原蛋白分子的实例。从图IA 将理解重复单元可以是相同的或不同的，并且η可以是相同的或不同的。图IB显示了本文 公开的其中所述至少一个重复单元在两条链或三条链上的胶原蛋白分子的实例。将理解的 是在链间重复单元可以是相同的或不同的。还将理解的是在链间η可以是相同的或不同 的。将理解图1代表了本文公开的胶原蛋白分子的实例，并且不以任何方式限制要求保护 的分子的范围。当在本文中使用时，胶原蛋白可以是天然胶原蛋白或胶凝的胶原蛋白。胶 凝的胶原蛋白是指已经变性的胶原