[0191] 取SPF级SD大鼠80只，随机分成8组，各组大鼠用乙醚浅麻醉，随后在大鼠左后足趾 皮下注射含灭活的结核分枝杆菌完全弗氏佐剂O.lmL，大鼠的左后足即出现原发性关节炎， 造模13d左右会在右后足出现继发性关节炎。空白对照组注射等体积的生理盐水。造模13d 后开始给药，其中甲氨蝶呤组每5天注射给药一次，给药15天，一共4次;融合蛋白A与蛋白G 的高、中、低三个剂量(128mg/kg、32mg/kg、8mg/kg)每天注射给药一次，给药15天。
[0192]疗效评价：
[0193] 1.原发性及继发性足趾肿胀度
[0194]采用足容积测定方法，在每只大鼠左右后足踝关节处用脂溶性记号笔作一标志， 将动物左右后足分别浸入容积测定装置内。浸入深度以标记处为界，以该装置的刻度吸管 处读取数值即为动物左右后足的初始体积。
[0195]造模当天算作第0天，记为d0,从造模第一天dl开始测量左后足(造模足）的体积， 每隔2天一次，直到对侧非致炎足(右后足）出现肿胀（即出现了继发性关节炎)时开始给药， 并每隔2天测量一次左右后足的体积，求出原发性和继发性足趾肿胀度。计算公式如下：
[0196]原发性足趾肿胀度(mL)=测量当天的左后足体积-左后足的初始体积
[0197]继发性足趾肿胀度(mL)=测量当天的右后足体积-右后足的初始体积
[0198] 2.临床评分
[0199] 全身评分:从继发性炎症出现后，每隔2天进行全身评分。
[0200] 后足:无肿胀=0分，一个后足肿胀=1分，两个后足肿胀=2分；
[0201] 前足:无肿胀=0分，一个前足肿胀=1分，两个前足肿胀=2分；
[0202] 耳朵:无发红症状和结节=0分，一个耳朵出现发红症状或者结节=1分，两个耳朵 出现发红症状和结节=2分；
[0203]鼻:无肿胀=〇分，明显的肿胀=1分；
[0204]尾巴:无结节=0分，有结节=1分;满分8分。
[0205]关节炎指数评分:从继发性炎症出现后，每隔2天进行关节炎指数评分。
[0206] 正常=0分;踝关节出现红斑和轻度肿胀=1分;踝关节到跖关节或掌关节出现红 斑和轻度肿胀=2分;踝关节到跖趾关节或掌关节出现红斑和中度肿胀=3分;踝关节到跖 趾关节或掌关节出现红斑和重度肿胀=4分;每只足满分4分，每只大鼠最多记16分。
[0207] 3.体重增加值
[0208]造模前称量各组大鼠的初始体重，自造模dl天开始，每隔2天测一次体重，减去初 始体重，即为各组大鼠的体重增加值。实验结果见表16。
[0209]表16蛋白A、蛋白G对大鼠佐剂型关节炎慢性炎症的影响
[0210]
[0211] *P〈0·05，**Ρ〈0·01vscontrol.
[0212] 实验结果表明，各组大鼠造模后，左后足迅速肿胀（原发性炎症），第13d左右后足 (非对侧致炎足)开始红肿（即出现了继发性炎症），关节炎指数和全身评分开始升高，第19d 达到最高值，随着给药各组肿胀度及评分逐渐下降。以原发性足趾肿胀度来反映各治疗组 对原发性关节炎的治疗作用，各给药组的高、中两个剂量与模型组比较均能一定程度的治 疗原发性关节炎，阳性药甲氨蝶呤的效果最好，融合蛋白A与蛋白G以高剂量组的效果好，具 有极显著性差异(**P〈〇.01);以继发性足趾肿胀度来反映各治疗组对继发性关节炎的治疗 作用。
[0213] 实施例11
[0214] 融合蛋白A、蛋白G对人视网膜血管内皮细胞(HRCEC)的增殖抑制作用
[0215]采用MTT法检测整合素阻断剂多肽抑制人视网膜血管内皮细胞增殖的活性。HRCEC细胞在37°C、5%C02的培养箱中培养至密度90%以上时用胰蛋白酶消化收集，用培养液重 悬细胞并在显微镜下计数，将细胞浓度调整为3.0X104个/mL，将细胞悬液接种到96孔板 中，每孔lOOyL，并于37°C，5%C02培养箱中培养过夜。将多肽I、多肽II、多肽III、Avastin用 培养液稀释到各个预定浓度。待细胞完全贴壁后，将各个稀释液分别加入96孔板中，每孔 100yL。以加入整合素阻断剂多肽作为给药组，Avastin作为阳性对照组，以不加任何药物的 培养液作为空白对照组，在37°C，5%⑶2培养箱孵育48小时。向96孔板中每孔加入20yL5mg/ mL的MTT，继续培养4小时。吸去培养基，每孔加入100yLDMS0溶解。用酶标仪在570nm下检 测，参比波长为630nm处测定吸光值，并计算生长抑制率(proliferation inhibit ion，PI)， 公式如下：
[0217 ] 其中Ntest为测试组的0D值，N_trca为空白对照组的0D值。
[0218]数据统计：
[0219] 试验独立重复5次，试验得到的结果计算mean土SD，并进行统计t-test检验，P〈 0.05为显著性差异，P〈0.01为极显著性差异。实验结果见表17。
[0220]表17蛋白A、蛋白G对人视网膜血管内皮细胞(HRCEC)增殖抑制作用
[0221]
[0222] *P〈0·05，**Ρ〈0·01vs control.
[0223]结果显示，融合蛋白A、蛋白G能显著抑制人视网膜血管内皮细胞(HRCEC)增殖抑制 作用，呈现剂量依赖关系，在64yg/mL浓度下，抑制率达到50 %以上。
[0224] 实施例12
[0225]鸡胚尿囊绒膜(CAM)分析融合蛋白A、蛋白G的体内抑制血管生成活性作用
[0226]本研究采用CAM试验探讨融合蛋白A、蛋白G体内抑制血管生成的活性。研究表明在 鸡胚发育的第8天到第11天，胶原蛋白的生物合成速率达到最大，此时正是血管生成的最旺 盛阶段，而机体免疫系统尚未完全建立，因此选择发育到第8天的鸡胚开始给药。考虑到载 药纸片上的多肽会在鸡胚尿囊膜上有一定的弥散范围限制，因此试验中只计数距离纸片边 缘5_半径的范围内新生血管数量。采用如下操作步骤：
[0227] (1)将第6天的白杭鸡胚在60 % -70 %湿度的37°C培养箱培养两天。
[0228] (2)在鸡胚气室上方钻1.0cmX1.0cm的窗口，用镊子将内膜撕去，暴露出尿囊膜。 以直径为5mm的擦镜纸片为加样载体，放入鸡胚气室尿囊绒膜上。滤纸片加PBS为空白组，给 药组分别加不同剂量的融合蛋白，阳性对照为Avastin。
[0229] (3)将鸡胚气室用无菌透明胶带封上，于37°C培养72小时后，打开鸡胚气室，加入 固定液（甲醛:丙酮= 1:1)固定15min。取出粘附有擦镜纸片的尿囊膜，观察其新生血管分布 状况，对新生血管进行计数并拍照。每组剂量设5个重复，试验结果进行统计分析。
[0230] 鸡胚尿囊绒膜(CAM)分析融合蛋白的体内抑制血管生成活性结果：阴性对照采用 PBS处理，阳性对照Avastin的剂量为10yg，融合蛋白A、蛋白G设置高、中、低三个剂量处理鸡 胚，分别是128以8、32以8、8以8。结果见表18。
[0231] 表18蛋白A、蛋白G鸡胚尿囊绒膜(CAM)新生血管的抑制作用
[0232]
[0233] *P〈0·05，**Ρ〈0·01vscontrol.
[0234] 实验结果显示，融合蛋白A与蛋白G均能对CAM新生血管形成抑制，高剂量下有较强 的抑制效果，接近50 %。
[0235] 实施例13
[0236] 融合蛋白A、蛋白G对小鼠角膜新生血管的作用
[0237] (1 )BALB/c小鼠碱烧伤诱导角膜新生血管模型的制备：
[0238] 健康BALB/c小鼠15只，雄性，体重20_25g，裂隙灯显微镜下检查双眼眼前段及附属 器，排除眼部病变。碱烧伤模型制备前Id给0.3%氧氟沙星眼药水点眼，每日2次。小鼠经腹 腔注射1.8 %Avertin麻醉后，用镊子夹住直径为2mm的单层滤纸片，浸于lmol/L氢氧化钠溶 液中，使其达饱和状态，去除多余液体，将滤纸片置于BALB/c小鼠角膜中央40S，弃掉滤纸， 立即用15mL的PBS充分冲洗烧伤区及结膜囊lmin。棉签拭去过多水分，于手术显微镜下以角 膜刮铲平行于角膜缘的方式旋转刮除角膜上皮，注意勿伤及上皮下基质层及角膜缘，术毕 结膜囊内涂红霉素眼膏预防感染。
[0239] (3)实验动物分组及标本获取：
[0240] 15只小鼠按随机分组，标记为融合蛋白A组、融合蛋白G组和对照组，每组5只，自碱 烧伤后分别给予64yg融合蛋白A、64yg融合蛋白G和生理盐水玻璃体腔注射，每日1次，持续1 周，碱烧伤后ld、7d、14d于裂隙灯显微镜下观察各组角膜的炎症反应及新生血管情况。碱烧 伤后第14d于带眼前段照相的裂隙灯显微镜下拍照记录各组角膜新生血管形成情况，随即 以颈椎脱臼法处死所有小鼠并摘除眼球，生理盐水冲洗血迹，4%多聚甲醛固定1.5h，含 30 %蔗糖的中脱水过夜，0CT冰冻切片包埋剂包埋，-80°C冰箱中保存，8μπι冰冻切片，免 疫组织化学法检测⑶31的表达。
[0241] (3)角膜组织微血管密度定量测定：
[0242] 微血管密度(Microvesseldensity，MVD)是评价血管形成的指标。我们采用抗CD31抗体免疫组织化学法标记血管内皮细胞，计数单位面积中的微血管数目，由此来衡量 新生血管生成的程度。统计微血管的标准:显微镜下观察角膜组织中与邻近组织分界清楚， 并被染成棕黄色或褐色的内皮细胞或细胞团均计入新生血管。在10X20镜下计数整张切片 新生血管数目，角膜组织片照相后以图像处理软件ImageJ计算出整个角膜组织片面积，求 出该例整张切片的新生血管密度。结果见表19。
[0243]表19蛋白A、蛋白G对小鼠角膜新生血管的作用MVD计数
[0245] *P〈0·05，**Ρ〈0·01vs control.
[0246]结果显示，⑶31作为微血管标记物，主要表达于血管内皮细胞胞质中，染色阳性细 胞为血管内皮细胞染成棕黄色或褐色，无背景染色。融合蛋白A、蛋白G实验组⑶31阳性新生 血管与对照组相比显著减少。融合蛋白A、蛋白G相比对照组具有显著性差异。实验结果表明 融合蛋白A、蛋白G均能够抑制角膜新生血管的生长，能够作为治疗角膜新生血管性眼病的 药物。
[0247] 实施例14
[0248]融合蛋白A、蛋白G对家兔虹膜新生血管的作用
[0249]采用577nm氩离子激光凝阻家兔视网膜主分支静脉，经眼底荧光素血管造影(FFA) 证实静脉阻塞成功。5-12天后眼虹膜荧光素血管造影（IFA)显示虹膜血管与正常对照组对 比荧光素渗漏明显，证实虹膜新生血管化的动物模型(NVI)形成。
[0250]取造模成功的9只眼，随机分成3组，每组3只。分别标记为阴性对照组、融合蛋白A 治疗组、融合蛋白G治疗组，分别以生理盐水、128yg融合蛋白A、128yg融合蛋白G玻璃体腔注 射给药，每日1次，持续2周。第3周用光学及电子显微镜观察。
[0251]结果:光学显微镜下可观察到虹膜前表面是主要由纤维组织组成的纤维血管膜残 迹，仅有极少的开放血管腔。在虹膜基质内可看到血管残存物，为坏死细胞及细胞碎片。光 镜下的对照眼的虹膜表面为有分枝的和潜在管腔的纤维血管膜。
[0252]治疗组虹膜的超微结构为一系列的退行性改变。虹膜基质中部的大血管的内皮细 胞有正常的细胞核、细胞质和细胞连接。虹膜基质中及虹膜前表面有毛细血管残迹，周围有 细胞碎片和巨噬细胞浸润。无潜在管腔的毛细血管及退变的壁细胞，表明新生血管消退。
[0253]通过虹膜新生血管化的动物模型实验，证明了融合蛋白A与融合蛋白G能够抑制新 生血管形成并使已形成的血管退化。
[0254] 实施例15
[0255]融合蛋白A、蛋白G对兔眼脉络膜血流的影响
[0256]取体重为2.5-3.0公斤的新西兰白兔，随机分为3组，分别标记为对照组、融合蛋白 A组