一种具有抗肿瘤、抗炎症和治疗眼科疾病功能的融合蛋白及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物制药技术领域，更具体地说，涉及一种具有抗肿瘤、抗炎症和治疗 眼科疾病功能的融合蛋白及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 肿瘤、关节炎、细菌引起的炎症、眼科疾病（如AMD)等疾病均被称为血管相关性疾 病。
[0003]近年我国肿瘤的发病率和病死率不断增长。无限制生长、侵袭和转移是肿瘤的恶 性标志和特征，也是导致治疗失败和死亡的主要原因。因此，控制肿瘤的生长、侵袭和转移 是改善预后，提高生存率的主要措施。1971年Folkman首先提出肿瘤生长依赖血管新生的理 论，肿瘤血管生成是肿瘤生长和转移的形态学基础，它不仅向肿瘤提供营养，也向宿主输出 大量的肿瘤细胞导致肿瘤的生长和转移。绝大多数恶性实体肿瘤如卵巢癌、肝癌、宫颈癌和 乳腺癌等都是血管依赖性肿瘤。新生血管一方面为肿瘤生长提供营养和氧气，另一方面还 是肿瘤转移的重要途径。因此，抑制肿瘤血管形成是重要的抗癌措施。
[0004]关节炎类炎症疾病，是指发生在人体关节及其周围组织的炎性疾病，可分为数十 种。我国的关节炎患者有1亿以上，且人数在不断增加。临床表现为关节的红、肿、热、痛、功 能障碍及关节畸形，严重者导致关节残疾、影响患者生活质量。其中主要包括风湿性关节 炎、类风湿关节炎、骨关节炎、痛风性关节炎、强直性脊柱炎、反应性关节炎、感染性关节炎 等。这其中类风湿关节炎(rheumatoidarthritis，RA)是临床最常见的炎性关节病和主要 致残因素之一。在全世界约为〇.5%_1.0%，RA的发病在我国约为0.4%，是一种病因尚未明 了的慢性全身性炎症性疾病，以慢性、对称性、多滑膜关节炎和关节外病变为主要临床表 现，属于自身免疫炎性疾病。患者常以手部或腕部疼痛及肿胀(特别是腕背部的肿胀)为首 发症状，症状持续不缓解，普通的对症治疗虽可以缓解症状，但常常由于用药不规则或不足 量而导致症状反复。病情进展时可以出现明显的晨僵，通常可达1小时以上，并不断加重；同 时出现一定的关节功能障碍。其基本病理特点是血管炎和滑膜炎。关节内滑膜血管增生，形 成血管翳，导致滑膜增厚，渗出增多，分泌多种细胞因子，侵犯软骨并引起骨质损害。对其周 围的肌腔、韧带、腱鞘以及肌肉等组织也均可侵蚀，从而影响关节的稳定，容易发生关节畸 形而出现功能障碍。血管炎亦可侵犯周身各脏器组织，形成系统性疾病。关节炎的病理过程 中，血管新生是一种标志性的组织学改变，新生血管形成伴随滑膜增生和炎细胞浸润，是其 中血管翳形成及关节破坏的基础。原来应该没有血管存在的关节软骨因某种异常变化，而 形成新的血管，使得软骨受到侵蚀，造成关节变形或疼痛。新生血管引起类风湿关节炎患者 滑膜组织发生异常变化。所以抑制新生血管形成在一定程度上可以缓解或治愈关节炎类炎 症疾病。
[0005]眼科类疾病中的虹膜新生血管性眼病、脉络膜新生血管性眼病、视网膜新生血管 性眼病及角膜新生血管性眼病等，其发病机理均与新生血管的过度形成有关，抑制新生血 管的形成是治疗这类疾病的关键，而内皮细胞的增殖和迀移是新生血管形成的关键步骤。 血管生成抑制剂是近年在治疗新生血管性疾病中引起重视的一类药物，因此阻断新生血管 形成可能成为治疗由于眼中血管生成导致的患者眼病的新手段。在这些血管生成抑制剂 中，尤其以血管抑素和内皮抑素最引人注目。尽管这些血管抑制剂呈现出非常诱人的前景， 但其缺陷也非常明显:迄今为止的抑制血管生成药物，如内皮抑素、血管抑素等作用靶点不 明确，它们对血管的专一性和选择性还不够好，效果有限，导致实验中用药量较大。因此，一 个好的抗血管生成药物应该对新生血管的标记分子具有选择性，以达到对新生血管的导向 性作用，从整体上提高药物对血管生成的抑制作用:做到只使用低剂量的药物，就能达到高 效的抑制血管生成的效果。Avastin目前已经成功用于眼部疾病的治疗，而我国尚缺乏自主 研制的此类药物。而本发明的整合素靶点抑制血管生成将成为治疗这类眼病的新选择。
[0006]此外，肿瘤、关节炎类炎症、眼病都是与血管相关的疾病。肿瘤的生长和转移依赖 新生血管;炎症与血管新生是两个相互联系，共同发展的病理过程;眼科疾病如年龄相关性 黄斑变性(AMD)主要表现是脉络膜新生血管的生成。
[0007]新生血管生成，在正常生理条件下，受到高度调节，在生殖、胚胎发育、组织修复和 创伤愈合中是必不可少的过程。血管生成在多种病理条件下也会发生，所述病理条件包括： 肿瘤生长和转移;炎性障碍，例如类风湿性关节炎、银肩病、骨关节炎、炎性肠病、克隆病、溃 疡性结肠类以及其它炎性障碍。
[0008]整合素是一类广泛分布于细胞表面的受体，能介导细胞与细胞外基质及细胞与细 胞之间的相互黏附，它们通过连接胞内细胞骨架蛋白和细胞外基质分子的相互作用参与血 管生成。目前至少有8种的整合素（<1101、€[201、€[301、€[601、€[604、€[501、(^03、(^05)参与血管 生成，其中ανβ3发挥着重要作用。ανβ3能识别配体分子中的精-甘-天冬序列(arg-gly-asp， RGDhavi^可以表达于多种细胞类型，并与多细胞活动过程中的多种配体结合参与肿瘤的 血管生成、侵袭、转移、炎症、伤口愈合和凝血等生理和病理过程。因此，含有R⑶序列的多肽 具有整合素拮抗剂作用，RGD序列可以作为一种载体，祀向运输到新生血管内皮，从而对新 生血管性疾病达到更高效率的治疗。因此，血管抑制多肽通过抑制血管生成不仅可阻止向 滑膜输送氧气和营养物质，且直接导致血管退化，从而可能抑制RA滑膜增生。抑制新生血管 的形成是治疗这类疾病的关键，而内皮细胞的增殖和迀移是新生血管形成的关键步骤。
【发明内容】
[0009] 1.要解决的问题
[0010] 针对现有的多肽化学合成成本高，半衰期短，靶点单一等问题，本发明提供一种具 有抗肿瘤、抗炎症和治疗眼科疾病功能的融合蛋白及其应用，本发明的融合多肽采用大肠 杆菌培养表达方法，将两种不同的活性多肽进行连接，代替了化学合成方法，降低成本，中 间Linker的链接增加了蛋白分子量，使原核表达成为可能，并延长多肽半衰期，同时将两种 不同的多肽进行连接，使其具有两种多肽各自的靶点，使融合蛋白具有双靶点功能。
[0011] 2.技术方案
[0012]为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
[0013] -种融合蛋白，具有抗肿瘤、抗炎症和治疗眼科疾病功能，其氨基酸序列为：
[0014]Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg- Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pr〇-Linker-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala- Val-Pr〇-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp〇
[0015]优选地，所述的所述的Linker S:Ala-Glu-Ala-Ala-Ala-Lys-Glu-Ala-Ala_Ala-Lys-Glu-Ala-Ala-Ala-Lys-Glu-Ala-Ala-Ala-Lys-Ala，或：Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser_Gly-Gly-Gly-Gly-Ser〇 [0016 ]优选地，其氨基酸序列为：
[0017]蛋白八：八1&-。5^-八8卩-。5^-八找-617-八8卩-。}^-?116-。5^-617-617-617-617-116-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pr〇-Ala-Glu-Ala-Ala-Ala-Lys-Glu-Ala-Ala-Ala-Lys-Glu-Ala-Ala-Ala-Lys-Glu-Ala-Ala-Ala-Lys-Ala-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp;或
[0018]蛋白6:八1&-〇5^-八8卩-〇5^-八找-617-八8卩-〇}^-?116-〇5^-617-617-617-617-116-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pr〇-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pr〇-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp〇
[0019] 上述的融合蛋白的基因表达序列，所述蛋白A的基因表达序列为：
[0020] GCATGCGATT GCCGTGGTGA TTGCTTTTGC GGTGGTGGTG GTATCGTGCG CCGTGCCGAC 60
[0021] CGCGCAGCCG TGCCCGCGGA AGCCGCGGCG AAAGAAGCCG CGGCGAAAGA AGCCGCGGCG 120
[0022] AAAGAAGCCG CGGCGAAAGC GATCGTGCGC CGTGCCGACC GCGCAGCCGT GCCCGGTGGT 180
[0023] GGTGGTCGTG GTGAT 195
[0024] 所述蛋白G的基因表达序列为：
[0025] GCATGCGATT GCCGTGGTGA TTGCTTTTGC GGTGGTGGTG GTATCGTGCG CCGTGCCGAC 60
[0026] CGCGCAGCCG TGCCCGGTGG TGGTGGTTCT GGTGGTGGTG GTTCTGGTGG TGGTGGTTCT 120
[0027] ATCGTGCGCC GTGCCGACCG CGCAGCCGTG CCCGGTGGTG GTGGTCGTGG TGAT 174
[0028] 上述的融合蛋白在制备抗肿瘤药物、制备治疗炎症药物和制备治疗眼科疾病药物 中的应用。
[0029] 优选地，所述的肿瘤包括胃癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌、胶质瘤、黑色素瘤和宫 颈癌以及起源于人的头颈部、脑部、甲状腺、食管、胰腺、肺脏、肝脏、胃、乳腺、肾脏、胆囊、结 肠或直肠、卵巢、子宫颈、子宫、前列腺、膀胱、睾丸的原发或继发的癌、黑色素瘤以及肉瘤。
[0030] 优选地，所述的炎症包括类风湿关节炎、骨关节炎、痛风性关节炎、强直性脊柱炎、 银肩病关节炎、反应性关节炎、感染性关节炎和创伤性关节炎。
[0031] 优选地，所述的眼科疾病包括虹膜新生血管性眼病、脉络膜新生血管性眼病、视网 膜新生血管性眼病或角膜新生血管性眼病。
[0032] 优选地，所述的虹膜新生血管性眼病包括新生血管性青光眼、糖尿病视网膜病变 或视网膜中央静脉栓塞引起的虹膜新生血管性眼病;所述的脉络膜新生血管性眼病包括年 龄相关性黄斑变性、中心性渗出性视网膜脉络炎、眼组织胞浆菌病综合征或葡行性脉络膜 病变脉络膜新生血管性眼病;视网膜新生血管性眼病包括糖尿病、肿瘤、视网膜脱落、视网 膜中央静脉阻塞、视网膜静脉周围炎、全身性红斑狼疮、Eales病或Coat病相关的视网膜新 生血管性眼病;所述的角膜新生血管性眼病包括角膜接触镜所致角膜新生血管性疾病，以 及碱及其他化学物质烧伤、角膜手术、细菌感染、衣原体感染、病毒感染或原虫感染引起的 角膜新生血管性眼病。
[0033]优选地，抗肿瘤药物、治疗炎症药物和治疗眼科疾病药物的剂型为注射剂、胶囊、 片剂、药丸、鼻喷剂或气雾剂;所述注射剂的注射方法包括静脉注射、静脉滴注、皮下或者肌 肉注射。
[0034]上述的融合蛋白的制备方法，包括合成方法和重组表达体方法。
[0035] 3.有益效果
[0036]相比于现有技术，本发明的有益效果为：
[0037] (1)本发明的融合蛋白分子分别由不同的氨基酸Linker连接，其中蛋白A