Cd19靶向性的嵌合抗原受体和nkt细胞及其制法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于用于肿瘤治疗的生物制品领域，具体地，涉及CD19靶向性的嵌合抗原 受体和NKT细胞及其制法和应用。更具体地，涉及过继免疫治疗中的嵌合抗原受体 CD19ScFv-CD8-CD137-CD3G及其基因和重组表达载体、工程化CD19靶向性的NKT细胞 (CAR19-NKT细胞)及其应用。
【背景技术】
[0002]自然杀伤细胞(NKT)是一种特殊类型的T淋巴细胞亚群，具有T细胞和NK细胞细胞 两重性质。NKT细胞能表达T细胞的TCR与NK细胞的NKR-P1两种受体，在TCR和NKR介导下，NKT 细胞能够产生大量的IL-4及INFy。。
[0003]通常情况下，输注的NKT细胞在患者体内半衰期为2周左右，有效期短暂，需要反复 多次输注。另外，NKT细胞本身缺少特异性抗体，不足以在肿瘤周围或者瘤巢中富集，制约了 NKT细胞对恶性肿瘤的靶向治疗。
[0004] CD19分子是B淋巴细胞表面发挥特异性信号转导的受体，存在于B细胞成熟的各个 阶段，在B祖细胞阶段出现并稳定持续地表达。CD19作为B细胞系特异的细胞表面分化抗原， 仅表达于前B细胞和成熟B细胞表面，而在造血干细胞、浆细胞和其他正常组织细胞中不表 达。而且，CD19分子在膜上比较暴露，容易接近，与单克隆抗体结合后无显著内化及脱落，也 不会因为与抗体的结合而发生抗原调变。此外，近期关于癌基因MYC基因如何推动B淋巴细 胞恶性肿瘤的发生与发展的研究，发现CD19对稳定Myc蛋白来说是绝对必要的，当Myc基因 是稳定的，并处于较高水平时，Myc基因会促使癌症发展，并且，Myc蛋白水平高的患者更可 能死于淋巴瘤。⑶19可能是控制Myc基因通路上的开关，而控制通断开关可能代表了治疗淋 巴细胞肿瘤的有力工具。基于以上现象，故CD19成为治疗CD19阳性的急性B淋巴细胞白血病 的一个重要靶点。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是为了克服现有技术中NKT细胞对肿瘤的杀伤作用比较弱、特异杀 伤活性有待提高的缺陷，提供一种嵌合抗原受体CD19ScFv-CD8-CD137-CD3G及其基因和重 组表达载体、工程化⑶19靶向性的NKT细胞(CAR19-NKT细胞)及其应用。
[0006] 本发明的第一方面，提供了一种嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体以CD8的 绞链区和跨膜区及CD137和CD3G的胞内信号结构域串联而成的结构为信号传导结构域。
[0007] 在另一优选例中，所述嵌合抗原受体为CD19ScFv-CD8-CD137-CD3G，由CD19ScFv、 CD8的铰链区和跨膜区、CD137的胞内信号结构域和CD3G的胞内信号结构域串联构成。
[0008]在另一优选例中，所述嵌合抗原受体的胞外结合区为抗CD19的单链抗体。
[0009]在另一优选例中，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQIDNO. 1所示。
[0010]在另一优选例中，所述CD8的铰链区和跨膜区选自下组：
[0011] (A)具有SEQIDN0:17所示氨基酸序列的多肽；
[0012] (B)具有与SEQIDNO: 17所示氨基酸序列2 80%同源性（优选地，2 90%的同源 性;等优选地2 95%的同源性;最优选地，2 97%的同源性）的多肽；（C)将SEQIDNO: 17中 任一所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的衍生多肽。
[0013]在另一优选例中，所述⑶137的胞内信号结构域选自下组：
[0014] (A)具有SEQIDN0:18所示氨基酸序列的多肽；
[0015] (B)具有与SEQIDN0:18所示氨基酸序列2 80%同源性（优选地，2 90%的同源 性;优选地2 95%的同源性;最优选地，2 97%的同源性），并且能够转导效应子功能信号的 多肽；
[0016] (C)将SEQIDN0:18中任一所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或 添加而形成的衍生多肽。
[0017]在另一优选例中，所述〇)3ζ的胞内信号结构域选自下组：
[0018] (Α)具有SEQIDΝ0:19所示氨基酸序列的多肽；
[0019] (B)具有与SEQIDN0:19所示氨基酸序列2 80%同源性（优选地，2 90%的同源 性;等优选地2 95 %的同源性;最优选地，2 97 %的同源性），并且能够转导效应子功能信号 的多肽；
[0020] (C)将SEQIDN0:19中任一所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或 添加而形成的衍生多肽。
[0021]在另一优选例中，所述CAR包括SEQIDN0:9所示的氨基酸序列。
[0022] 在另一优选例中，所述嵌合抗原受体(CAR)还包括抗原结合结构域。
[0023]在另一优选例中，所述抗原结合结构域为抗体或其抗原结合片段。
[0024] 在另一优选例中，所述抗原结合片段为Fab或scFv。
[0025]在另一优选例中，所述抗原包括肿瘤抗原。
[0026] 在另一优选例中，所述肿瘤抗原与血液恶性肿瘤相关。
[0027]在另一优选例中，所述肿瘤抗原与实体瘤相关。
[0028] 在另一优选例中，所述肿瘤抗原选自下组:⑶19、⑶20、⑶30、Herl。
[0029]在另一优选例中，所述嵌合抗原受体(CAR)为分离的。
[0030]在另一优选例中，所述嵌合抗原受体(CAR)的氨基酸序列如SEQIDN0.:1所示。
[0031] 本发明的第二方面，提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码本发明第一方面所 述的嵌合抗原受体(CAR)。
[0032] 在另一优选例中，所述核酸分子包含选自下组的编码所述CD8的铰链区和跨膜区 的核酸序列：
[0033] (a)编码如SEQIDN0. : 17所示多肽的多核苷酸；
[0034] (b)序列如SEQIDΝ0·:3所示的多核苷酸；
[0035] (c)核苷酸序列与SEQIDΝ0. : 3所示序列的同源性2 90% (较佳地2 95%)，并且 编码SEQIDN0.: 17所示氨基酸序列的多核苷酸；
[0036] (d)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
[0037]在另一优选例中，所述核酸分子包含选自下组的编码所述CD137的胞内信号结构 域的核酸序列：
[0038] (a)编码如SEQIDN0. : 18所示多肽的多核苷酸；
[0039] (b)序列如SEQIDNO. :4所示的多核苷酸；
[0040] (c)核苷酸序列与SEQIDNO. :4所示序列的同源性2 90% (较佳地2 95%)，并且 编码SEQIDN0.: 18所示氨基酸序列的多核苷酸；
[0041] (d)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
[0042]在另一优选例中，所述核酸分子包含选自下组的编码所述CD3G的胞内信号结构域 的核酸序列：
[0043] (a)编码如SEQIDN0. : 19所示多肽的多核苷酸；
[0044] (b)序列如SEQIDΝ0·:5所示的多核苷酸；
[0045] (c)核苷酸序列与SEQIDΝ0. : 5所示序列的同源性2 90% (较佳地2 95%)，并且 编码SEQIDN0.: 19所示氨基酸序列的多核苷酸；
[0046] (d)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
[0047]在另一优选例中，所述核酸分子包含选自下组的核酸序列：
[0048] (a)编码如SEQIDN0. :9所示多肽的多核苷酸；
[0049] (b)序列如SEQIDN0·: 10所示的多核苷酸；
[0050] (c)核苷酸序列与SEQIDN0. : 10所示序列的同源性2 95% (较佳地2 98%)，并且 编码SEQIDN0. :9所示氨基酸序列的多核苷酸；
[0051] (d)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
[0052]在另一优选例中，所述核酸分子为分离的。
[0053]在另一优选例中，所述核酸分子还包括编码前导序列（信号肽）的多核苷酸，所述 前导序列的氨基酸序列如SEQIDN0. :21所示：
[0054] 在另一优选例中，所述核酸分子的序列如SEQIDN0.:2所示。
[0055]本发明的第三方面，提供了一种载体，所述的载体含有本发明第一方面所述的核 酸分子。
[0056]在另一优选例中，所述载体为慢病毒载体。
[0057]本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞中含有本发明第三方 面所述的所述的载体或染色体中整合有外源的本发明第二方面所述的核酸分子。
[0058]在另一优选例中，所述细胞为分离的细胞，和/或所述细胞为基因工程化的细胞。
[0059]在另一优选例中，所述细胞为哺乳动物细胞。
[0060]在另一优选例中，所述细胞为NKT细胞、或T细胞。
[0061]在另一优选例中，所述T细胞为NKT细胞。
[0062]本发明的第五方面，提供了一种药物组合物，所述组合物含有药学上可接受的载 体以及本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第 三方面所述的载体、或本发明第四方面所述的细胞。
[0063]本发明的第六方面，提供了本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、本发明第二方 面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的载体、或本发明第四方面所述的细胞的用途，用 于制备治疗肿瘤的药物或制剂。
[0064]在另一优选例中，所述的肿瘤包括白血病。
[0065]在另一优选例中，所述白血病是指进展期CD19阳性的急性B淋巴细胞白血病。
[0066]本发明的第七方面，提供了一种治疗疾病的方法，包括给需要治疗的对象施用适 量的本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三 方面所述的载体、或本发明第四方面所述的细胞、或本发明第五方面所述的药物组合物。
[0067] 在另一优选例中，所述疾病为肿瘤。
[0068]本发明的第八方面，提供了一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体以CD8的hinge 区和跨膜区及CD137和CD3G的胞内信号结构域串联而成的结构为信号传导结构域，所述信 号传导结构域氨基酸序列如SEQIDN0:9所示。
[0069] 本发明的第九方面，提供了一种NKT细胞群，所述NKT细胞群中：
[0070] CD3+CD8+NKT细胞/CD3+CD4+NKT细胞的比率为10/1~4/1(优选为9/1~6/1);并且 CD3+CD56+NKT细胞/CD3+CD8+NKT细胞的比率为1/18~10/18(优选为5/18~10/18,如可以为 1/8、1/6、1/4、1/3)〇
[0071] 在另一优选例中，所述NKT细胞群中：
[0072] 〇)3+细胞比率2 95%;〇)3+〇)8+细胞比率2 90.99%;〇)3+〇)56+细胞比率2 15%(优 选地，2 18%;更优选地 2 20%;最优选地 2 22%，如 2 24%、2 26%、2 28%、2 30%) ;CD8+ CD56+细胞比率2 15% (优选地，2 18% ;更优选地2 20% ;最优选地2 22%，如2 24%、2 26%、> 28%、> 30%)。
[0073]在另一优选例中，所述NKT细胞为表达嵌合抗原受体的NKT细胞。
[0074]在另一优选例中，所述NKT细胞为本发明第四方面所述的细胞。
[0075]本发明的第十方面，提供了一种制备本发明第九方面所述的NKT细胞群的方法，其 特征在于，所述方法包括步骤：
[0076] (a)将单个核细胞(PBMCs)培养于NKT细胞培养基中，所述NKT细胞培养基含有抗 CD3单克隆抗体、白介素-2、和白介素-15,进行第一阶段培养。
[0077]在另一优选例中，通过所述第一阶段培养，从而分离单个核细胞中原始的NKT细胞 并刺激其增殖。
[0078]在另一优选例中，所述第一阶段培养所用的细胞培养容器是经RetroNectin包被 的。
[0079] 在另一优选例中，所述抗CD3单克隆抗体的浓度为20ng/ml-80ng/ml(优选为30ng/ ml-70ng/ml，更优选为40ng/ml-60ng/ml，最优选为约50ng/ml);和/或 [0080] 所述白介素-2的浓度为200U/mL-800U/mL(优选为300U/mL-700U/mL，更优选为 400U/mL-600U/mL，最优选为约500U/mL);和/或
[0081 ] 所述白介素-15的浓度为20ng/mL-80ng/mL(优选为30ng/mL-70ng/mL，更优选为 40ng/mL-60ng/mL，最优选为约 50ng/mL)。
[0082]在另一优选例中，所述第一阶段的培养时间为2天-6天;优选为3天-5天;更优选为 4天。
[0083]在另一优选例中，所述NKT细胞培养基为GT-T551培养基。
[0084]在另一优选例中，所述NKT细胞培养基中还包含血清;优选地所述血清为自体血清 或胎牛血清;更优地所述血清为自体血清。
[0085] 在另一优选例中，所述血清含量为0.4% (v/v)_0.8% (v/v);优选为0.6% (v/v)。
[0086] 在另一优选例中，所述单个核细胞(PBMCs)来源于哺乳动物，更优选地来源于人。
[0087]在另一优选例中，所述方法包括步骤：
[0088] (b)将所述第一阶段培养的细胞转移到培养瓶中，加入NKT细胞培养基，进行第二 阶段培养，其中，所述NKT细胞培养基中含有白介素-2;优选地，所述白介素-2的浓度为 200U/mL-800U/mL(优选为 300U/mL-700U/mL，更优选为400U/mL-600U/mL，最优选为约 500U/ mL) 〇
[0089] 在另一优选例中，通过所述第二阶段培养从而实现NKT细胞体外的扩增。
[0090]在另一优选例中，用于所述第二阶段培养的培养瓶是未包被的。
[0091]在另一优选例中，用于所述第二阶段培养的所述NKT细胞培养基中还包含血清;优 选地所述血清为自体血清或胎牛血清;更优地所述血清为自体血清。
[0092] 在另一优选例中，所述血清含量为0.4% (v/v)_0.8% (v/v);优选为0.6% (v/v)。
[0093] 在另一优选例中，所述第二阶段的培养时间为8天-20天;优选为10天-18天;更优 选为为12天-16天。
[0094]在另一优选例中，所述方法还包括步骤；
[0095] (c)将嵌合抗原受体(CAR)基因整合于所述NKT细胞中，从而制备表达嵌合抗原受 体的NKT细胞。
[0096]在本发明的一个优选的实施方式中，根据本发明的嵌合抗原受体，为CD19ScFv_ ⑶8-⑶137-⑶3ζ，由⑶19ScFv、⑶8的铰链区和跨膜区、⑶137的胞内信号结构域和⑶3ζ的胞 内信号结构域串联构成。
[0097]优选地，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQIDNO. 1所示。
[0098]本发明还提供了编码根据本发明的嵌合抗原受体的基因。
[0099]优选地，