基于单链dna分子构建测序文库的方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，特别是基因测序领域。具体地，本发明涉及基于单链DNA分子构建测序文库的方法及其应用。更具体地，本发明涉及基于单链DNA分子构建测 序文库的方法、用于基于单链DNA构建测序文库的装置、确定单链DNA分子的序列信息的方 法、确定RNA样本的序列信息的方法、用于确定染色质目标区域的序列信息的方法以及用 于确定基因组甲基化信息的方法。
【背景技术】
[0002] 二代测序技术迅猛发展，解析并鉴定了许多人类和动植物正常和致病性状的基 因，从全基因组的层面了解到前所未知的生物遗传和发育学问题。而测序前不可缺少的一 步就是构建能够适用于二代测序平台的标准样品文库，简称建库。目前主要的建库方法是 Illumia的Trueseq和Nextera系列建库方法，建库操作繁琐，并且操作过程中必须要补平 末端、加碱基A和连接接头，而这三步反应都要求在纯化后的样品体系中进行，因此每个反 应都必须进行纯化操作，而由于技术限制，纯化操作不可避免的会有一定量的样品损失，导 致这些方法的DNA起始量大，至少在纳克水平以上，并且建库过程中DNA信息大量丢失。对 于微量样品，例如珍贵稀缺的样品或者临床病人标本，传统的建库方法并不适用。因此，目 前二代测序技术在构建基因文库的方法上仍有待改进。
【发明内容】
[0003]本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的 在于提出一种操作简单，高灵敏性，适于微量样品的基于单链DNA分子构建测序文库的方 法及其应用。
[0004] 需要说明的是，本发明是基于发明人的下列工作而完成的：
[0005] 发明人采用单链建库，利用DNA链3'端的Poly(C)n与含有Poly(6)"的延伸引物 互补配对并进行延伸反应；尽量减少通过离心柱纯化的次数，仅在扩增前进行一步纯化，并 且纯化通过磁珠与生物素亲和结合而进行的，显著减少样品损失；利用PCR反应连接接头， 并且能在添加索引标签的同时对文库样本进行扩增，扩增产物构成测序文库。
[0006] 因而，根据本发明的一个方面，本发明提供了一种基于单链DNA分子构建测序文 库的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：（1)在单链DNA分子的3'末端形成 poly(C)n尾部，以便获得具有Poly(C)n尾部的单链DNA分子，其中，η代表碱基C的数目，并 且η为5~30之间的整数；（2)利用延伸引物，基于所述具有Poly(C)尾部的单链DNA分 子，获得双链DNA分子，其中，延伸引物在其3'末端包括iKGh单元，Η为碱基A、碱基T或 碱基C，m为碱基G的数目，并且m为5~15之间的整数；以及（3)在所述双链DNA分子远 离iKGh单元的一端连接接头，并对所得到的连接产物进行扩增，以便获得扩增产物，所述 扩增产物构成所述测序文库。
[0007]利用根据本发明实施例的基于单链DNA分子构建测序文库的方法，能够有效地构 建单链DNA分子的测序文库，特别是能够有效地构建微量样本的测序文库。利用DNA链3' 端的Poly(C)n与含有Poly(G)"的延伸引物互补配对并进行单链DNA延伸反应，能避免延伸 引物互补配对到基因组DNA而不是其3'端上的情况，减小偏差的同时也保留了DNA链的特 异性，而且能应用于细胞的全基因组甲基化信息研究；并且仅进行一步纯化或不进行纯化， 显著降低多步纯化产生的样品损失和基因信息大量丢失，从而大幅减少了建库DNA的起始 量，进而能够高效、灵敏地应用于高通量测序技术，基于对测序结果的数据分析，就能够有 效地获得基因序列彳目息。
[0008] 根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种用于基于单链DNA构建测序文库的 装置。根据本发明的实施例，该装置包括：尾部连接单元，所述尾部连接单元用于在单链 DNA分子的3'末端形成poly(C)n尾部，以便获得具有Poly(C)n尾部的单链DNA分子，其中， η代表碱基C的数目，并且η为5~30之间的整数；延伸单元，所述延伸单元与所述尾部连 接单元相连，并且用于基于所述具有Poly(C)尾部的单链DNA分子，获得双链DNA分子，其 中，延伸引物在其3 '末端包括H(G) "单元，Η为碱基A、碱基T或碱基C，m为碱基G的数目， 并且m为5~15之间的整数；接头连接单元，所述接头连接单元与所述延伸单元相连，并且 用于在所述双链DNA分子远离H(G) "单元的一端连接接头；以及扩增单元，所述扩增单元与 所述接头连接单元相连，并且用于对所述接头连接单元的连接产物进行扩增，以便获得扩 增产物，所述扩增产物构成所述测序文库。
[0009] 利用根据本发明实施例的用于基于单链DNA构建测序文库的装置，能够利用微量 单链DNA样品进行测序文库的构建，并且保留了单链DNA链的特异性，样品损失少，基因信 息保持完整，且能应用于细胞的全基因组甲基化DNA文库的构建。
[0010] 根据本发明的又一方面，本发明提供了一种确定单链DNA分子的序列信息的方 法。根据本发明的实施例，该方法包括：基于所述单链DNA分子，根据前述方法构建测序文 库；以及对所述测序文库进行测序，以便获得测序结果；基于所述测序结果，确定所述单链 DNA分子的序列信息。
[0011]利用根据本发明实施例的确定单链DNA分子的序列信息的方法，能够灵敏、准确、 高效地确定微量样本单链DNA分子的序列信息，并且能应用于细胞的全基因组甲基化DNA 分子，从而实现对样品的全基因组或特定区域基因组的甲基化检测。
[0012] 根据本发明的又一方面，本发明提供了一种确定单链DNA序列信息的系统。根据 本发明实施例，该系统其包括：测序文库构建装置，采用前述方法制备样本基因的测序文 库；测序装置，所述测序装置与所述测序文库制备单元相连，以便用于对所述样本的基因测 序文库进行测序，获得所述样本DNA的测序结果；以及分析装置，对所述样本DNA的测序结 果进行分析，以便获得所述单链DNA序列信息。
[0013] 采用根据本发明实施例的确定单链DNA分子的序列信息的系统，能够灵敏、准确、 高效地确定微量样本单链DNA分子的序列信息，并且可以应用该系统对全基因组甲基化 DNA分子的序列进行分析，从而实现对样品的全基因组或特定区域基因组的甲基化检测。
[0014] 根据本发明的再一方面，本发明提供了一种确定RNA样本的序列信息的方法。根 据本发明实施例，该方法包括：对RNA样本进行反转录，以便获得单链DNA分子；基于所述 单链DNA分子，通过根据前述的方法，构建测序文库；对所述测序文库进行测序；以及基于 所述测序结果，确定所述RNA样本的序列信息。
[0015] 利用根据本发明实施例的确定RNA样本的序列信息的方法，能够灵敏、准确、高效 地确定微量样本单链DNA分子的序列信息，从而实现对样本的基因组的检测。
[0016] 根据本发明的一个方面，本发明提供了一种用于确定染色质目标区域的序列信 息的方法。根据本发明实施例，该方法包括：将染色质进行随机打断，以便获得长度为 200bp~500bp的染色质样本；利用抗体对所述染色质样本进行染色质免疫共沉淀，所述抗 体特异性识别所述目标区域，以便获得包含所述目标区域的双链DNA样本；对所述包含所 述目标区域的双链DNA样本，进行变性处理，以便得到单链DNA分子；基于所述单链DNA分 子，通过根据前述的方法，构建测序文库；对所述测序文库进行测序；以及基于所述测序结 果，确定所述染色质目标区域的序列信息。
[0017] 利用根据本发明实施例的确定染色质目标区域的序列信息的方法，能够灵敏、准 确、高效地确定微量样本确定染色质目标区域的序列信息，从而实现对染色质样本的基因 组目标区域的检测。
[0018] 根据本发明的又一方面，本发明提供了一种用于获得基因组甲基化序列信息的方 法。根据本发明实施例，该方法包括：将全基因组的至少一部分进行重亚硫酸盐处理，以便 将所述全基因组中的碱基中非甲基化的胞嘧啶转换为尿嘧啶，并且获得经过转换的基因组 样本；将所述基因组样本进行随机打断，以便获得长度为200bp~500bp的双链DNA样本； 对所述包含所述目标区域的双链DNA样本，进行变性处理，以便得到单链DNA分子；基于所 述单链DNA分子，通过根据前述的方法，构建测序文库；对所述测序文库进行测序；以及基 于所述测序结果，确定基因组甲基化序列的信息。
[0019] 利用根据本发明实施例的确定基因组甲基化信息的方法，能够准确地确定样本全 基因组或者特定区域基因组的甲基化信息，从而实现对样本全基因组或者特定区域基因组 的甲基化检测。
[0020] 本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变 得明显，或通过本发明的实践了解到。
【附图说明】
[0021] 本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变 得明显和容易理解，其中 ：
[0022] 图1显示了根据本发明一个实施例的基于单链DNA分子构建测序文库的方法的流 程意图；
[0023] 图2显示了根据本发明一个实施例的尾部连接反应示意图；
[0024] 图3显示了根据本发明一个实施例的延伸反应示意图；
[0025] 图4显示了根据本发明一个实施例的尾部连接反应示意图；
[0026] 图5显示了根据本发明一个实施例的第一轮PCR扩增反应示意图；
[0027] 图6显示了根据本发明一个实施例的第二轮PCR扩增反应获得完整文库样本反应 不意图；
[0028] 图7显示了根据本发明一个实施例的用于基于单链DNA构建测序文库的装置示意 图，
[0029]其中，
[0030] 图7A显示了以单链DNA样本构建测序文库的装置示意图；
[0031] 图7B显示了以RNA或染色质样本构建测序文库的装置示意图，
[0032] 图8显示了根据本发明一个实施例的确定单链DNA序列信息的系统的示意图；
[0033] 图9显示了根据本发明一个实施例的确定RNA样本的序列信息的方法的示意图；
[0034] 图10显示了根据本发明一个实施例的确定染色质目标区域的序列信息的方法的 不意图；
[0035] 图11显示了根据本发明一个实施例的确定基因组甲基化信息的方法的示意图。
【具体实施方式】
[0036] 下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终 相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附 图描述的实施例是示例性的，仅用于