人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性抗体rv3a5及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程抗体技术，特别是涉及人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性抗体 RV3A5及其应用。
【背景技术】
[0002] 狂犬病是由狂犬病毒引起的世界性人兽共患病，一旦发病100%死亡。目前世界上 87个国家有狂犬病报道，每年约有5万多人死于狂犬病(Knobel DL，et al.2005)。狂犬病暴 露后预防是防治狂犬病的主要措施。对于严重暴露的人，世界卫生组织（World Health Organization，WHO)建议采用狂犬疫苗注射结合抗狂犬病毒免疫球蛋白（rabies immune globulin，RIG)的方法。目前使用的两类RIG为人抗狂犬病毒免疫球蛋白（human rabies immune globulin，HRIG)和马抗狂犬病毒免疫球蛋白（Equine rabies immune globulin, ERIG)。由于ERIG副反应比较严重，而且对某些疫苗的抗体反应有抑制，而HRIG价格昂贵，供 应量有限并且有潜在的病原威胁。因此制备高效、价廉、副反应小的被动免疫制剂成为新的 研发目标。
[0003] 含有特异性抗体的人源或动物血清免疫球蛋白用以预防和治疗传染病已历史悠 久。单克隆抗体的体外抗病毒中和活性和体内保护肌体抵抗病毒攻击已获得许多实验证 明，如鼠抗甲肝病毒、汉坦病毒、麻疹病毒、RSV病毒、CMV病毒等中和性单克隆抗体可以在体 内100%保护动物免受病毒攻击。以抗原免疫动物获得多抗血清的途径一直是获得抗体的 经典方法，但缺乏特异性和均一性。继而建立的B淋巴细胞杂交瘤技术使得众多科学家通过 细胞工程可以在体外定向地制备各种单克隆抗体(monoclonal antibody，McAb)，其特异性 强，性质均一，易于大量生产。然而McAb多为鼠源性，鼠源McAb的异源性反应极大地限制了 McAb作为治疗制剂在人体的应用。免疫球蛋白（Vaccinia immune globulin,VIG)作为抗体 成分主要来自捐献者(恢复期病人)免疫血清，从获得阳性血清到通过安全性检测均需花费 大量的人力和财力，这就使其大量制备受到限制，同时由于来源于血清因此容易发生血源 性传播疾病的感染。因此使用人源基因工程产品替代血制品则可克服这些缺陷，随着人源 基因工程抗体研究的不断深入，给这一领域的生物制品发展带来了新的希望和广阔前景。 通过抗体分子基因水平的重组可获得多种多样的特异性鼠源及人源抗体，使对单克隆抗体 的研究有了突破性进展并越来越显示出其重要意义及实际运用前景。人源抗狂犬病毒单克 隆抗体的研制和噬菌体抗体库技术的产生为解决被动免疫制剂问题提供了新的思路。狂犬 单克隆抗体CR57和CR4098制成的单克隆抗体鸡尾酒中和了26种典型的街毒株。对动物的保 护性实验表明，利用单克隆抗体鸡尾酒进行治疗具有可行性和优越性(Goudsmit J，et al.2006)〇
[0004] 上世纪80年代末90年代初兴起的噬菌体抗体库技术兴起和整个基因工程抗体技 术研究领域的发展，使当今世界人源或基因工程抗体的开发研究取得很大进展并已由基础 研究阶段步入实质性应用研究和开发阶段。人源抗病毒基因工程抗体，尤其是人源全抗体 的研究成功，给各种病毒性传染病的特异性预防和治疗带来了新的希望，在抗病毒感染生 物药领域逐渐形成了一类新的抗病毒药，即所谓的抗体药(Antibody Drug)。如同当初血源 性疫苗向基因工程疫苗的转变，现在也急需用基因工程抗体替代血源性VIG，如通过嵌合抗 体技术（Boul ianne，G · L · et al ·，1984 ;Morrison，S.L.et al.，1984)、人源化抗体技术 (Jones，P.T.et al. ,1986)、携带人单抗的转基因小鼠技术(Green，L.L.et al. ,1994)、异 体杂交瘤技术(James,K.et al. ,1987)、·菌体表面展示技术(Barbas,C.F.et al. ,1991) 等产生人源化抗体，已成为国内外研究的重大方向，并逐步走向成功。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性抗体RV3A5或其活性片段。
[0006] 本发明的另一目的是提供编码上述中和性抗体RV3A5或其活性片段的基因。
[0007] 本发明的再一目的是提供上述中和性抗体RV3A5及其活性片段在制备预防或治疗 狂犬病药物或诊断试剂中的应用。
[0008] 本发明运用噬菌体抗体库技术，采集多个具有高滴度狂犬病毒抗体的疫苗接种者 外周血淋巴细胞，通过基因工程手段构建了人源抗狂犬病毒基因工程抗体文库，并筛选获 得特异抗狂犬病毒基因工程抗体Fab段。获得的Fab段抗体命名为RV3A5。
[0009] 这株重组抗体是由存在于抗体轻链和重链基因可变区中的高变区（CDRs)特异性 基因序列决定的，并在原核细胞中获得有效表达的特异性结合狂犬病毒的功能性抗体。它 们特异性识别狂犬病毒颗粒抗原，且均针对狂犬病毒糖蛋白G，与狂犬病毒具有明显的免疫 荧光反应(IFA)和酶联免疫(ELISA)反应，具有抗狂犬病毒感染的中和活性功能。
[0010] RV3A5特异性的轻链可变区基因来源于对人源抗狂犬病毒抗体基因库的特异性富 积筛选，该抗体库的建立来源于以狂犬单克隆抗体CR4098为骨架，从狂犬病疫苗接种者外 周血淋巴细胞通过RT-PCR扩增抗体轻链可变区基因，替换单抗CR4098的轻链基因，构建轻 链置换文库。RV3A5特异性的重链可变区基因与CR4098相同。其轻链和重链可变区相应的三 个CDR区序列组合及其CDR区之间的框架区序列组成了每个抗体可变区序列特征，RV3A5隶 属于抗体轻链家族VL6。抗体蛋白功能由存在于抗体基因轻链和重链可变区的决定族互补 区域⑶R1、CDR2和⑶R3中特异性核苷酸序列及其互补所决定，6个相应的⑶R区氨基酸序列 构成了抗体的特异性抗原结合区域，决定了每个抗体的抗原结合特征和抗狂犬病毒功能特 征。决定每株中和抗体功能的抗体轻链和重链可变区氨基酸序列如表1所示：
[0011] 表1
[0012]
[0013]中和性抗体RV3A5轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No: 1所示，其重链可变区的 氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。
[0014] 编码中和性抗体RV3A5轻链可变区的基因序列如SEQ ID No: 3所示，重链可变区的 基因序列如SEQ ID No:4所示。
[0015]应当理解，在不影响scFv抗体活性的前提下，本领域技术人员可对SEQ ID No: 1-2 所示的氨基酸序列进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸获得具有同等功能的 氨基酸序列，例如在非高变区将具有类似性质的氨基酸进行替换，如将RV3A5的轻链VL序列 的第6位的Val替换为Ala。
[0016] 本发明还提供含有编码所述中和性抗体RV3A5轻链可变区和重链可变区基因的表 达载体。
[0017] 本发明还提供含有编码所述中和性抗体RV3A5轻链可变区和重链可变区基因的工 程菌及转基因细胞系。
[0018] 本发明还提供所述中和性抗体RV3A5在制备预防或治疗狂犬病的药物或诊断试剂 中的应用。
[0019] 本发明进一步提供含有所述中和性抗体RV3A5的药物或诊断试剂。
[0020] 此外，考虑到密码子的简并性，例如可在其编码区，在不改变氨基酸序列的条件 下，对编码上述scFv段抗体的基因序列进行修改，获得编码相同抗体的基因。本领域技术人 员可以根据表达抗体宿主的密码子偏爱性，人工合成改造基因，以提高抗体的表达效率。
[0021] 进一步，本发明将上述scFv抗体的轻链可变区和重链可变区进行重组，获得其它 分子形式如Fab抗体，该抗体同样能够特异性识别狂犬病毒表面抗原，具有细胞内免疫的作 用。单链抗体穿透力强，易于进入局部组织发挥作用。
[0022] 可将上述编码Fab抗体的基因、scFv基因克隆到表达载体中，进而转化宿主，通过 诱导表达获得Fab抗体以及单链抗体。
[0023] 此外，可将上述scFv抗体的轻重链编码基因隆到全抗表达载体中，并导入宿主细 胞中，获得表达抗狂犬病毒的全抗免疫球蛋白。
[0024] 在本发明的实施例中，将上述scFv抗体RV3A5的轻链和重链基因分别克隆入VH/VK 全抗体表达载体，采用转染试剂聚乙烯亚胺(PEI)瞬时转染293T细胞，利用哺乳动物细胞系 统实现了全抗体的分泌型表达，得到全抗体免疫球蛋白IgG(即人源IgG全抗体RV3A5)。 [0025] 利用EL ISA、I FA、SDS-PAGE对获得的全抗体进行功能鉴定，结果表明人源I gG全抗 体RV3A5针对aG株和CTN株狂犬病毒颗粒均有特异性结合，与利用杆状病毒/昆虫细胞系统 表达的狂犬病毒aG株糖蛋白有特异性结合。采用快速免疫荧光灶抑制实验检测抗体在体外 与国际标准攻击毒株CVS株和国内疫苗株aG株的中和反应，结果显示，CR4098置换抗体 RV3A5对狂犬病毒aG株和CVS株均具有较高的中和效价分别为834IU/ml和779IU/ml，与单抗 CR4098的中和活性相近。
[0026] 本发明运用噬菌体抗体库技术，成功地获得了特异性针对狂犬病毒糖蛋白的人源 中和性抗体;利用上述获得的人源中和性抗狂犬病毒糖蛋白基因工程抗体可变区基因 、Fab 抗体基因以及上述每个抗体基因特征下的全抗体基因