莪术中抗癌活性单体的提取方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医药制品技术领域，具体涉及一种从中药莪术块茎中提取抗癌活性单 体的方法，以及该提取得到的抗癌活性单体在制备抗肝癌、抗肺癌药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 中药莪术是姜科姜黄属植物的根茎，莪术有行气破血、消积止痛的功效。现代药理 学研究表明莪术挥发油有抗肿瘤、抗菌作用；莪术醇有抑瘤作用、抗早孕作用。另外莪术对 心血管、胃肠平滑肌、急性肾功能衰竭作用显著，还具有保肝作用。
[0003]目前对中药莪术的的应用主要是以其挥发油注射液和复方莪术油用于抗癌作用， 制成抗癌药物，相对比较局限。另外，莪术挥发油成分复杂，不同成分的抗癌作用也存在很 大差别，缺乏必要的药效物质基础和药效研究，缺乏合理的质量控制标准，难以确保临床用 药的有效性、安全性、可持续性。可见，对莪术的化学成分进行进一步提取和研究非常有必 要。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术的不足，提供一种莪术中抗癌活 性单体的提取方法，该方法采用二维高效液相色谱进行分离纯化，得到具有生物活性新酮 类单体化合物，分离方法稳定，重复性高，制备量大，操作简单省时，成本低，提取率高。
[0005] 本发明所采用的技术方案为：
[0006] (1)以莪术块茎为原料，磨成粉末状后用乙酸乙酯浸泡或者回流提取，最终所得 滤液进行旋转蒸发至干，得粗提物，粗提物溶于正己烷-乙醇二元混合溶剂中，配成浓度为 50-500mg/mL的提取液；
[0007] (2)对提取液进行一维液相色谱分离：采用的色谱柱为正相硅胶色谱柱，采用 的流动相为A相正己烷、B相乙醇的二元流动相，进样量为50-150mL/针，流动相流速为 500-700mL/min，洗脱方式为B相浓度0-50 %梯度洗脱30min，检测器为紫外检测器、检测波 长210nm，根据紫外吸收光谱收集15. 5-17分钟洗脱液作为目的组分，旋转蒸发浓缩至干， 得到一维液相组分；
[0008] (3)使用正己烷-乙醇二元混合溶剂溶解一维液相组分，溶解至浓度为100mg/ mL ；
[0009] (4)进行二维液相色谱分离：采用的色谱柱为Acchrom X-Amide色谱柱，采用的流 动相为A相正己烷、B相乙醇的二元流动相，进样量为l-2mL/针，流动相流速为12-16mL/ min，洗脱方式为B相浓度0-30 %梯度洗脱30min，检测器为紫外检测器、检测波长210nm，根 据紫外吸收光谱收集17-18分钟洗脱液作为目的组分，旋转蒸发浓缩至干，得到目的产物。 经分析型色谱分析，该目的产物纯度达到99%，为单体化合物。
[0010] 经核磁共振分析，并经系统文献检索，发现该单体化合物为一未见报道的新化合 物，化合物母核为吉马烷型骨架结构，进一步解析其结构，得到分子结构式如下：
[0011]
[0012] 该化合物分子式为C15H2Q03，分子量为248,属于酮类单体化合物，我们将其命名为 8-羟基-吉马-1，7-二烯-5酮-8, 12-内酯。
[0013] 作为优选，所述步骤（1)、（3)中正己烷-乙醇二元混合溶剂中正己烷体积分数为 70%〇
[0014] 作为优选，所述步骤（2)中正相硅胶色谱柱的尺寸为直径150mm、长度250mm，其中 填料粒径为10 μ m，使用时柱温为室温。
[0015] 作为优选，所述步骤（4)中Acchrom X-Amide色谱柱的尺寸为直径20mm、长度 250_，其中填料粒径为10 μ m，使用时柱温为室温。
[0016] 本发明进一步提供上述提取得到的酮类单体化合物8-羟基-吉马-1，7-二烯-5 酮-8, 12-内酯在制备抗肝癌药物中的应用。该酮类单体化合物作为有效成分，按常规方 法如口服、注射，与药学上的可接受载体或赋形剂，制成适合口服、注射等给药方式的剂型， 如：片剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、丸剂、溶液剂、悬浮液、糖浆、口腔含片、舌下含片、注射剂、 软膏剂、栓剂、吸入剂等多种剂型。
[0017] 本发明还进一步提供上述提取得到的酮类单体化合物8-羟基-吉马-1，7-二 烯-5酮-8, 12-内酯在制备抗肺癌药物中的应用。该酮类单体化合物作为有效成分，按常 规方法如口服、注射，与药学上的可接受载体或赋形剂，制成适合口服、注射等给药方式的 剂型，如：片剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、丸剂、溶液剂、悬浮液、糖浆、口腔含片、舌下含片、注 射剂、软膏剂、栓剂、吸入剂等多种剂型。
[0018] 本发明采用二维液相色谱技术进行从莪术中分离纯化活性成分：
[0019] 首先，在一维分离的条件选择上：多次试验结果显示，正相硅胶色谱柱对所提物质 分离效果较好，而通过考察不同流动相组成和不同洗脱方式、流速及进样量后，结果显示采 用本发明乙醇-正己烷0% -50%梯度洗脱分离效果最佳，且重复性良好，得到的一维液相 组分中目的组分纯度高，峰容量较大，与其他峰之间分离良好，非常有利于分离操作和后续 进一步提纯；
[0020] 其次，在二维分离的条件选择上：使用Acchrom X-Amide色谱柱，在洗脱条件选择 为B相浓度0-30 %梯度洗脱时能将少部分极性接近的杂质分离开，得到纯度高达99 %的目 的单体化合物。
[0021] 在液相色谱的溶剂选择上，一维色谱分离、二维色谱分离以及中间提取物的溶解， 均采用正己烷、乙醇两种溶剂混合液，可以通过改变乙醇的比例来调节有效成分的溶解能 力和流动相的洗脱能力，且整个色谱分离仅使用两种溶剂，有利于提取溶剂的回收再利用。
[0022] 与现有技术中相比，本发明具有以下优点和显著效果：
[0023] (1)本发明提供了一种未报道过的新化合物；
[0024] (2)提取方法工艺简单，成本低，试剂耗费量小，制备量大，稳定可控，重复性好，批 次间一致性高，经工艺放大后可以运用于工业生产；
[0025] (3)得到的单体化合物纯度高，稳定性好，且具备良好的生物活性，通过细胞在线 实时监测的方法观测其在体外的抗肿瘤作用，发现其对肺癌A549细胞和肝癌Η印-G2细胞 具有抑制作用，具有抗肿瘤药物开发潜力，拓宽了抗肿瘤药物的原料来源；
[0026] (4)由于产物为高纯度且具生物活性的单体化合物，质量品质和用药更为可控，能 够确保临床用药的有效性、安全性、可持续性；
[0027] (5)本发明首次在中药莪术中发现了未曾报道过的新化合物，拓展了中药莪术的 有效成分种类，拓展了莪术的研究领域和开发价值。
【附图说明】
[0028] 图1所示的是本发明实施例1莪术中抗癌活性单体提取的一维色谱图；
[0029] 图2所示的是本发明实施例1莪术中抗癌活性单体提取的二维色谱图；
[0030] 图3所示的是本发明实施例1得到的目的组分的分析型高效液相色谱图；
[0031] 图4所示的是本发明实施例1得到的目的组分的CNMR谱（CDC13, 400MHz)的核磁 共振数据图谱；
[0032] 图5所示的是本发明实施例1得到的目的组分的HNMR谱（CDC13, 400MHz)的核磁 共振数据图谱；
[0033] 图6所示的是本发明得到目的成分对肺癌A549细胞的抑制作用；
[0034] 图7所示的是本发明得到目的成分对肝癌Hep_G2细胞的抑制作用。
【具体实施方式】
[0035] 以下结合实施例对本发明作进一步具体描述。应该指出，以下具体说明都是例示 性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有说明，本发明使用的所有科学和技术术语 具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同含义。
[0036] 1.原料、材料：
[0037] 莪术采摘自河北并经过鉴定；人肺癌A549细胞由中国医学科学院血液病医院提 供；人肝肿瘤Hep_G2细胞由中国医学科学院血液病医院提供。
[0038] 2.试剂：
[0039] 无水乙醇购自天津市北方天医化学试剂厂；色谱级正己烷购自Honeywell公司； F-12K 培养基购自 Life Technologies Corporation ;MEM 培养基购自 Life Technologies Corporation ;DMS0购自天津康科德科技有限公司。
[0040] 3.仪器设备：
[0041] 超微粉碎机购自山东三清不锈钢设备有限公司；台式冷冻离心机购自Thermo公 司；30升中药提取罐购自上海顺仪实验设备有限公司；恒温鼓风干燥箱购自上海一恒科学 仪器有限公司；旋转蒸发仪上海亚容生化仪器厂；色谱柱购自博纳艾吉尔有限公司；制备 型高效液相色谱仪购自江苏汉邦科技有限公司；iCELLigence实时无标记细胞功能分析仪 购自艾森生物（杭州）有限公司。
[0042] 实施例1 :
[0043] 以莪术为原料，磨成粉末状后称取4kg，溶于25L 98 %的乙醇溶液，进行回流提 取，最终所得滤液进行旋转蒸发至干，然后溶于正己烷体积分数为70 %的正己烷-乙醇二 元混合溶剂中，配制成浓度为100mg/mL的提取液，过0. 45 μ m微孔滤膜，进行一维液相色谱 制备。
[0044] 一维液相色谱采用Silica 150X250mm，10 μπι，100 A,流动相采用有机相的混合， 其中有机相Α相是正己烷、Β相是乙醇，梯度洗脱方式：Β相浓度0-50%梯度洗脱30分钟。 采用紫外检测器210nm选择吸收波长，制备温度为室温，进样量为100mL/针，流动相流速为 600mL/min，收集15. 5-17分钟（8号峰）的组分，如图1所示。进行旋转蒸发浓缩至干，得 一维液相组分。
[0045] -维液相组分使用正己烷体积分数为70 %的正己烷-乙醇二元混合溶剂复溶，溶 解至浓度为100mg/mL，用于二维液相色谱分离。
[0046] 二维色谱分离采用X_Amide20 X 250_，10 μ m，1.00.美，流动相采用有机相的混合， 其中有机相A相是正己烷，B相是乙醇，梯度洗脱方式：B相浓度0-30%梯度洗脱30分钟， 采用紫外检测器210nm选择吸收波长，制备温度为室温，进样量为lmL/针，流动相流速为 14mL/min，收集17-18分钟（3号峰）的组分，如图2所示。进行旋转蒸发浓缩至干得到白 色晶体状目的组分，称重为〇. 724g，计算产率为0. 0181 %。
[0047] 实施例2 :
[0048] 将实施例1得到的目的组分利用分析型色谱柱进行纯度检验，如图3所示，纯度达