转录活性的生物学功能，使用慢病毒包装 的三个HCT116细胞系:对照，ELL和ELL(C595A)进行细胞增殖实验。
[0164] pHAGE-control 为 pHAGE-CMV-MCS-IZsGreen 载体；
[0165] pHAGE-ELL 为将 ELL 编码基因序列3 插入 pHAGE-CMV-MCS-IZsGreen 载体（Addgene) 的Xbal和BamHI位点得到的载体；
[0166] pHAGE-ELL(C595A)为将 ELL(C595A)编码基因插入 pHAGE-CMV-MCS-IZsGreen 载体 的Xbal和BamHI位点得到的载体；
[0167] ELL-shRNA为将ELL short hairpin RNA的编码序列CAACACCAACTACAGCCAGGA插入 pLKO. 1载体(Sigma-Aldrich)上得到的载体；
[0168] 将上述各载体分别和包装载体pSPAX2(Addgene)，pMD2.G(Addgene)转染HEK293T 细胞，转染后8小时，将培养基更换为含有10%FBS的新鲜DMEM培养基。40小时后，从培养基 中收集病毒，得到表达对照慢病毒、表达ELL的慢病毒、表达ELL(C595A)的慢病毒、表达 scrambled的慢病毒和表达ELL-shRNA的慢病毒。过滤，并转染HCT116细胞。上述含有病毒的 培养基中加入P〇 lybrene (8yg/mL)以提高感染效率。
[0169] 结果如下：
[0170] 与转染pHAGE-control的对照组细胞相比，转染pHAGE-ELL的HCT116细胞增殖速度 从第二天起明显下降（图5A)。用Western bo 11 (图5C)证实ELL在HCT116细胞中的表达。与此 相反，转染pHAGE-ELL(C595A)的HCT116细胞系的增殖速度与对照组细胞相似（图5D)。克隆 形成实验也验证了上述结果（图5E)。转染pHAGE-ELL(C595A)的HCT116细胞系的表达通过 Western blot分析（图5F)证实。相反，稳定敲降ELL的细胞系(转染ELL-shRNA的细胞）与对 照组细胞(转染scramb 1 ed的细胞)相比增殖速度加快（图5G、5H)。对ELL-shRNA的介导的敲 降效率通过Western blot分析(图51)证实。
[0171] 此外，利用Rati细胞(含野生型c-Myc)和H015.19(从Rati细胞而来，但缺失c-Myc) 验证了ELL对细胞增殖的影响是否依赖于c-Myc。转染pHAGE-ELL的Rati细胞增殖速度明显 低于pHAGE Control转染的Rati细胞（图5J)。然而，转染pHAGE-ELL的H015.19细胞增殖速度 与转染了PHAGE Control的H015.19细胞无显著差别（图5K)。
[0172] 因此，ELL可以抑制细胞的增殖，这种抑制作用可能是由它介导c-Myc的降解来实 现的。ELL (C595A)不能抑制细胞的增殖。
[0173] 上述Rati细胞和H015.19细胞记载在如下文献中：
[0174] Mateyak MK,0baya AJ,Adachi S,Sedivy JM.Phenotypes of c-Myc-deficient rat fibroblasts isolated by targeted homologous recombination.Cell growth& differentiation:the molecular biology journal of the American Association for Cancer Research 8,1039-1048(1997);或Yuan J，Minter_Dykhouse K,Lou Z.A c-Myc-SIRT1 feedback loop regulates cell growth and transformation.The Journal of cell biology 185,203-211(2009)。
[0175] 实施例3、ELL抑制结肠移植瘤的肿瘤生长
[0176] 将实施例2中转染pHAGE-contro 1的HT116细胞、转染pHAGE-ELL的HT116细胞和转 染pHAGE-ELL(C595A)的HT116细胞进行移植瘤生长实验:将15只雄性裸鼠随机分成3组，每 组5只，三组裸鼠分别皮下注射上述三种不同的细胞系，每只裸鼠注射的细胞量为2 X106 个。从第三周起，每周测量肿瘤的长宽高并使用V = Ji.abC/6(FlatZ等人2010)计算肿瘤体 积。6周后，处死裸鼠，测量肿瘤的重量并对相应的基因表达进行分析。肺部组织经过HE染色 后进行组织学分析。
[0177] 肿瘤体积结果如图6A和6B，过表达ELL(C595A)的HCT116细胞（转染pHAGE-ELL (C595A)的HT116细胞）肿瘤生长速度与对照组(转染pHAGE-control的HT116细胞)几乎相 同，而过表达ELL的HCT116细胞(转染pHAGE-ELL的HT116细胞）只形成一个很小的肿瘤。
[0178] 肿瘤重量分析也表明，对照组（转染pHAGE-control的HT116细胞）和过表达ELL (C595A)突变体的HCT116细胞(转染pHAGE-ELL(C595A)的HT116细胞）的肿瘤之间无明显差 异（图6C)。过表达ELL的HCT116细胞(转染pHAGE-ELL的HT116细胞）和过表达ELL(C595A)突 变体的HCT116细胞(转染pHAGE-ELL(C595A)的HT116细胞）的肿瘤表达通过Western blot分 析(图6D)证实。
[0179] 这些数据表明，ELL可以抑制结肠肿瘤移植瘤的生长。
[0180]实施例4、ELL在作为肿瘤标志物中的应用
[0181] 利用上海佐诚生物科技有限公司提供的90个结肠癌组织芯片（产品号：HCol-Adel80Sur-04)，86个正常组织为对照。利用ELL抗体和c-Myc抗体进行免疫组织化学染色 后，在显微镜下拍照，根据染色的深浅进行定量分析;检测ELL蛋白和c-Myc蛋白在结肠癌组 织和正常组织中的表达。
[0182] 结果如图6所示，ELL在正常组织中高表达，而在癌组织中的表达显著降低（图6E， 6G)。与之相反，c-Myc的表达，在癌组织中高表达，而在正常组织中，表达量很低（图6E，6F)。
[0183] 这些数据表明，ELL的表达可能可以作为结肠癌临床诊断的分子标记。
【主权项】
1. ELL蛋白或其截短体在如下1)-5)至少一种中的应用： 1) 制备降解c-My c蛋白产品； 2) 作为E3泛素酶连接酶； 3) 制备抑制肿瘤细胞增殖产品； 4) 制备抑制肿瘤形成产品； 5) 作为肿瘤诊断和/或鉴定的分子标记； 所述ELL蛋白截短体的氨基酸序列为ELL蛋白氨基酸序列中包含第583-614位氨基酸残 基的任一区段。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于:所述ELL蛋白的氨基酸序列为序列表中序 列4; 所述c-Myc蛋白的氨基酸序列为序列2; 所述ELL蛋白截短体为如下1 )-6)中任一种： 1) 所示的ELL蛋白截短体的氨基酸序列为序列4第46-621位； 2) 所示的ELL蛋白截短体的氨基酸序列为序列4第447-621位； 3) 所示的ELL蛋白截短体的氨基酸序列为序列4第509-621位； 4) 所示的ELL蛋白截短体的氨基酸序列为序列4第466-621位； 5) 所示的ELL蛋白截短体的氨基酸序列为序列4第447-621位； 6) 所示的蛋白的氨基酸序列为序列4第583-614位。3. 根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于： 所述肿瘤为结肠癌;所述肿瘤细胞为结肠癌细胞。4. 根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于:所述产品为试剂盒或药物。5. 如下1 )-5)任一种产品，其包括ELL蛋白或其截短体； 1) 降解c-My c蛋白产品； 2) 作为E3泛素酶连接酶； 3) 抑制肿瘤细胞增殖产品； 4) 抑制肿瘤形成产品； 5) 作为肿瘤诊断和/或鉴定的分子标记； 所述ELL蛋白截短体的氨基酸序列为ELL蛋白氨基酸序列中包含第583-614位氨基酸残 基的任一区段。6. 根据权利要求5所述的产品，其特征在于： 所述ELL蛋白的氣基酸序列为序列表中序列4; 所述c-Myc蛋白的氨基酸序列为序列2; 所述ELL蛋白截短体为如下1 )-6)中任一种： 1) 所示的ELL蛋白截短体的氨基酸序列为序列4第46-621位； 2) 所示的ELL蛋白截短体的氨基酸序列为序列4第447-621位； 3) 所示的ELL蛋白截短体的氨基酸序列为序列4第509-621位； 4) 所示的ELL蛋白截短体的氨基酸序列为序列4第466-621位； 5) 所示的ELL蛋白截短体的氨基酸序列为序列4第447-621位； 6) 所示的蛋白的氨基酸序列为序列4第583-614位。7. 根据权利要求5或6所述的产品，其特征在于： 所述肿瘤为结肠癌;所述肿瘤细胞为结肠癌细胞。8. 根据权利要求5-7中任一所述的产品，其特征在于:所述产品为试剂盒或药物。9. 一种蛋白质，其为如下1)_6)中任一种： 1) 所示的蛋白的氨基酸序列为序列4第46-621位； 2) 所示的蛋白的氨基酸序列为序列4第447-621位； 3) 所示的蛋白的氨基酸序列为序列4第509-621位； 4) 所示的蛋白的氨基酸序列为序列4第466-621位； 5) 所示的蛋白的氨基酸序列为序列4第447-621位； 6) 所示的蛋白的氨基酸序列为序列4第583-614位。
【专利摘要】本发明公开了ELL作为E3泛素连接酶的应用，本发明提供了ELL蛋白或其截短体在如下1)-6)至少一种中的应用：1)制备降解c-Myc蛋白产品；2)作为E3泛素酶连接酶；3)制备抑制肿瘤细胞增殖产品；4)制备抑制肿瘤形成产品；5)制备鉴定或辅助鉴定待测组织是否为肿瘤组织产品；6)制备鉴定或辅助鉴定待测患者是否为肿瘤患者产品。本发明的实验证明了，本发明发现ELL结合c-Myc并诱导其通过蛋白酶体降解，体内和体外的研究均表明ELL具有E3泛素连接酶的特征，ELL可以抑制肿瘤细胞增殖和肿瘤形成，并可作为肿瘤临床诊断的分子标记，作为一种新型的c-Myc的E3泛素连接酶，且可以制备抑制肿瘤的药物或试剂盒，以及诊断肿瘤的试剂盒。
【IPC分类】A61P35/00, G01N33/573, G01N33/574, A61K38/43, C12N9/00
【公开号】CN105602910
【申请号】CN201610003565
【发明人】肖武汉, 陈瑜, 姬伟, 周迟
【申请人】中国科学院水生生物研究所
【公开日】2016年5月25日
【申请日】2016年1月5日