/L卡那霉素Kan)，摇床(180rpm，28°C)振荡培养24h后，取50μ1 菌液加入到50ml YEP培养基中(含20mg/L Rif，50mg/L Kan)，摇床(180rpm，28°C)振荡培养12h后，观察其菌液浓度，并测其OD6qq值，直到菌液0D600 = 0.5。
[0040]3.小麦的遗传转化
[0041]将准备好的小麦材料放入YEP农杆菌菌液，按200yl/L的浓度加入表面活性剂(SILWET1-77)以及lml/L的浓度加入乙酰丁香酮(AS)，于15Kpa压强下真空处理5min，倒掉菌液，置于干净培养皿中，加入少许水，为了农杆菌携带的质粒能整合到植物基因组中，放置于25°C黑暗条件下培养3d，(因为光照会使得农杆菌的质粒脱落，转化率就会降低，另外植物切割以后较为脆弱，暗培养能帮助其恢复到正常的生长状态。)
[0042]4.转基因小麦植株鉴定。
[0043]将培养后的小麦移栽到土壤中，常规肥水管理。等待其生长，并对其小麦幼嫩叶片以及幼穗进行GUS组织化学染色检测，具体方法如下:剪取小麦幼嫩叶片或幼穗少许，放入
1.5mlPCR管中，加入20ul的X-Gluc(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖苷)染色液，37 °C放置12h，吸出X-Gluc，加入200ul的乙醇(75 % )溶液，将其叶绿素脱尽，与对照组对照，筛选出蓝色的阳性植株。见图3、图4、图5所示。即叶片，幼穗显示为蓝色的阳性小麦为转基因植株。结果表明，共GUS组织化学染色处理小麦幼穗162株，其中18株幼穗染液呈蓝色，阳性植株占
I1.1%。
[0044]转基因植株PCR检测
[0045]取⑶S染色检测呈阳性的植株，采用DNAsecure Plant Kit(TIANGEN公司)试剂盒提取小麦叶片的DNA。具体方法如下:
[0046](I)取⑶S检测阳性的小麦新鲜叶片10mg，剪碎至研钵中，加入液氮，充分研磨。
[0047](2)将研磨后的叶片，加入装有400μ1缓冲液LPl和6μ1 RNase A(10mg/ml)的2ml离心管，旋祸振荡lmin，室温放置lOmin。
[0048](3)加入130μ1缓冲液LP2，移液枪吹打混匀，旋涡振荡Imin。
[0049 ] (4)12, OOOrpm离心5min，将上清移至新的2ml离心管中。
[0050](5)加入1.5倍体积的缓冲液LP3，立即充分振荡混匀15sec，直至出现絮状沉淀。
[0051](6)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12，OOOrpm离心30sec，倒掉废液，吸附柱CB3放入收集管中。
[0052](7)向吸附柱CB3中加入600μ1漂洗液PW ,12, OOOrpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
[0053](8)重复上一步操作。
[0054](9)将吸附柱CB3放回收集管中，12，000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
[0055](1)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μ1洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12，OOOrpm离心2min，将溶液收集到离心管中。
[0056]农杆菌质粒提取，采用TIANGEN公司质粒小提试剂盒提取，具体方法如下:
[0057](I)柱平衡步骤:向吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)加入500yL的平衡液BL，12，OOOrpm离心Imin，倒掉收集管中的废液，吸附柱放回收集管中。
[0〇58] (2)取过夜培养的菌液1-5ml，加入离心管中，12 ,OOOrpm离心Imin，吸取上清。
[0059](3)向留有菌体沉淀的离心管中加入250yL溶液Pl，使用移液器或漩涡振荡器彻底悬浮细菌沉淀。
[0060](4)向离心管中加入250yL溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。
[0061 ] (5)向离心管中加入350yL溶液P3，立即温和地上下翻转6_8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12，OOOrpm离心1min，此时在离心管底部形成沉淀。
[0062](6)将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP 3中(吸附柱放入收集管中)，注意尽量不要吸出沉淀。12，OOOrpm离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP 3放入收集管中。
[0063](7)向吸附柱CP 3中加入600yL漂洗液PW，12,OOOrpm离心30_60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP 3放入收集管中。
[0064](8)重复步骤(7)。
[0065](9)将吸附柱CP 3放入收集管中，12，000rpm离心2min，去除吸附柱中残余的漂洗液。
[0066](10)将吸附柱CP 3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50_100μ1洗脱缓冲液EB，室温放置2min,12,OOOrpm离心Imin，将质粒溶液收集到离心管中。
[0067]对EUCHIT1基因进行PCR检测，分别将转基因小麦DNA，农杆菌质粒产物，野生型小麦DNA作为模板进行PCR扩增；其基因引物由上海英俊生物有限公司合成。引物序列为:Forward:5，-CGGGATCCCGATGGCGAAGACTAGTAGAAACGCAC-3，:Reverse primer:5,-CGGAATTCCGTATGGAACCCATAAATCTCAGGAAG-3，pcr 反应程序为:预热 98°C 1S ；(98°C10S； 55 °C30S ； 72 °C lmin) 30 个循环反应;72 °C 延伸 5min; 4°C 保存。
[0068]PCR反应完毕后，取5μ1扩增产物，I %的琼脂糖凝胶电泳中电泳，B1-Rad凝胶成像系统仪下观察并照相。见图6。利用特异性引物对筛选获得的小麦植株进行PCR扩增，得到大小约为100bp左右的目标条带，表明农杆菌携带的几丁质酶基因已经成功导入到小麦植株中。
【主权项】
1.一种快速高效的农杆菌介导小麦茎尖遗传转化方法，采用以下步骤: 1)取小麦成熟种子萌发，得到其发芽期个体，低温处理； 2)以发芽期的小麦个体作为实验材料，横切其部分胚芽，将裸露的茎尖分生组织作为遗传转化受体； 3)通过真空渗透处理的方式，将农杆菌导入小麦茎尖分生组织细胞，使农杆菌携带的目的基因的T-DNA插入植物基因组； 4)将小麦移入适宜生长的土壤，对其进行常规管理，并对其进行鉴定，挑选出转基因小麦植株。2.根据权利要求1所述的方法，所述小麦种子萌发的方法为无需消毒处理，直接以20-25 °C自来水浸泡破肚露白后置于培养皿中于20-25 °C催芽生根。3.根据权利要求1所述的方法，所述低温处理为4°C低温保存试验材料36-48小时。4.根据权利要求3所述的方法，所述低温处理时胚芽长度为1.5-2.0cm05.根据权利要求1所述的方法，所述遗传转化受体是带有完整胚根、胚乳的切除胚芽后的茎尖分生组织。6.根据权利要求1所述的方法，所述步骤(3)真空渗透处理方法为将暴露出茎尖分生组织的小麦材料用YEP液体培养基培养的农杆菌菌液浸泡，抽真空处理。7.根据权利要求6所述的方法，所述YEP农杆菌菌液其OD_为0.5，农杆菌菌液中加入乙酰丁香酮和表面活性剂SiIwet L-77。8.根据权利要求6所述的方法，所述抽真空处理的条件为:1.5Kpa压强下浸泡5min。9.根据权利要求1所述的方法，所述农杆菌为根瘤农杆菌菌株LBA4404，携带有杜仲几丁质酶基因EuCHITI及卡那霉素(Kanamycin Monosulfate)抗性基因的pSH-35S_CHITl载体。10.根据权利要求1所述的方法，所述小麦品种为紫粒麦。
【专利摘要】本发明公开一种快速高效的农杆菌介导的小麦茎尖遗传转化方法，该方法的主要步骤包括：采用小麦成熟种子，经过水浸种、催芽后冷处理，横切其胚芽鞘，裸露出茎尖，作为转化受体材料，通过农杆菌的真空处理介导进行遗传转化，将转化的材料置于适宜生长环境，待植株生长后，通过转基因的鉴定，从而获得转基因小麦植株。本发明方法无需进行小麦愈伤组织的培养，减少了各种因素对小麦遗传转化的影响，避免了组织培养过程玻璃化，褐化，细胞突变等问题，优化了小麦遗传转化的条件，降低小麦遗传转化的经济成本，有效克服了小麦基因型对转化效率的制约，可快速大量的获得转基因小麦植株，对培育优质新品种小麦以及进行小麦遗传转化研究具有重大价值。
【IPC分类】A01H5/00, C12N15/82
【公开号】CN105602984
【申请号】CN201610202826
【发明人】赵德刚, 董璇, 丁延庆
【申请人】贵州大学
【公开日】2016年5月25日
【申请日】2016年4月5日