一种酿酒酵母等位基因高效整合质粒系统及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于遗传学领域中的酵母等位基因整合技术领域，特别涉及一种酿酒酵母 等位基因高效整合质粒系统及其应用。
【背景技术】
[0002]随着质谱技术(mass spectrometry)的进步，使得我们能够利用质谱快速、高通量 的鉴定基因的转录、修饰。而对与基因进行功能分析则需要对无修饰和(或)模拟修饰的等 位基因突变体进行表型鉴定。对于酿酒酵母，这种等位基因可以通过携带相应的缺失或条 件性等位基因的着丝粒质粒来进行分析。然而，为了避免质粒携带等位基因时因拷贝数量 和(或)错误转录调控激活而引起的潜在问题，有时从原基因座上表达整合的等位基因更合 适。
[0003] -些有关整合或敲除酵母基因座上等位基因的方法已有报道。其中的大多数方法 都需要在基等位基因整合后剔除一个选择性或反向选择性的筛选标记。这使得以通过高通 量分析基因间相互作用来研究基因功能为专长的技术如合成遗传阵列（synthetic genetic array，SGA)和基于基因芯片的合成致死阵列分析(diploid based synthetic lethality analysis on microarrays，dSLAM)变得无所适从。虽然PCR介导的标记融合方 法能通过选择性标记来产生等位基因整合，但是由于基因的异质性和相对较低的整合效 率，特别是这些标记距离等位基因突变位置相对较远使得高通量基因研究难以进行。
[0004] 最近，二倍体重组技术的兴起使该问题得以解决，二倍体重组技术是一种实用性 强的技术，可用于基因敲除背景下的酵母等位基因整合。但该技术需要一些关键组件一一 整合卡盒，这种卡盒的5 '和3 '端各具有一半的KanMX模块，中间的含有靶基因(Α0Ι)的侧翼 序列和作为筛选标记的URA3。整个卡盒通过基因克隆技术克隆到Τ0Ρ0克隆载体中，随后通 过酶切将卡盒从Τ0Ρ0克隆中释放出来。随着卡盒被转化至基因敲除背景下的酵母菌株 (AOI/aoi Δ : :kanMX)中，Α0Ι及URA3替换Α0Ι基因座上的KanMX序列，使突变菌株具备URA+同 时丧失kan抗性，从而获得等位基因整合菌株。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种酿酒酵母等位基因高效整合质粒系统及 其应用，该质粒系统用于酿酒酵母等位基因高效整合高效、便捷、高通量、适用范围更广。
[0006] 本发明的一种酿酒酵母等位基因高效整合质粒系统，所述系统包括4种不同的酿 酒酵母等位基因整合质粒分别为pDH735、pDH818、pDH824和pDH825;其中，pDH735携带的整 合卡盒为：pTEF-attPl-ccdB-CAT-attP2-pTRPl-kan-tTEF; pDH818 携带的整合卡盒为：pT-attPl-ccdB-CAT-attP2-pTRPl-kan-tTEF;pDH824 携带的整合卡盒为：pTEF-attPl-ccdB-CAT-attP2-pADHl-nat-tTEF;pDH825 携带的整合卡盒为：pT-attPl-ccdB-CAT-attP2-pADHl-nat-tTEF 〇
[0007] 所述质粒pDH735是在质粒pFA6a-kanMX及pDH734基础上加以改造而来的。其中质 粒PDH734是在pFA6a-kanMX基础上，利用了不依赖基因序列和连接反应的克隆技术 (Sequence and Ligation Independent Cloning，SLIC)，导入了含有EM7启动子及TRP1 启 动子的 pTEF-pTRPl-kan-tTEF 卡盒。在 pDH734 基础上，将质粒 pD0NR221 中的 attPl-ccdB-CAT-attP2分成上、下游两段分别克隆到pDH734的pTEF-pTRPl-kan-tTEF卡盒中，构建pTEF-attPl-ccdB-CAT-attP2-pTRPl-kan-tTEF 整合卡盒，所获质粒即为 pDH735。
[0008] 所述质粒PDH818是在质粒pFA6a-kanMX及PDH817基础上加以改造而来的。其中 PDH817质粒是在pDH734基础上加以改造而来的，其pT启动子仅含有pDH734上pTEF的前 148bp的序列。在pDH817质粒基础上，将质粒pDH735中的attPl-ccdB-CAT-attP2卡盒克隆到 质粒PDH817中，构建pTEF-attPl-ccdB-CAT-attP2-pTRPl-kan-tTEF整合卡盒，所获质粒即 为PDH818。
[0009] 所述质粒PDH824是在质粒pAG25及pDH823基础上加以改造而来的。利用SLIC技术 将ADH1启动子克隆到pAG25中，构建pTEF-pADHl-nat-tTEF卡盒，所获质粒命名为pDH823，在 PDH823质粒基础上，将质粒pDH735中的attPl-ccdB-CAT-attP2卡盒克隆到质粒pDH823中， 构建 pTEF-attPl-ccdB-CAT-attP2-pADHl-nat-tTEF 整合卡盒，所获质粒即为 pDH824。
[0010] 所述质粒PDH824是在质粒pDH823基础上加以改造而来的。将质粒pDH818中的pT启 动子及attPl-ccdB-CAT-attP2克隆到pDH823中，构建pT-attPl-ccdB-CAT-attP2-pADHl-nat-tTEF卡盒，所获质粒即为pDH825。
[0011] 本发明的一种酿酒酵母等位基因高效整合质粒系统的应用，所述系统应用于酿酒 酵母的等位基因高效整合。
[0012] 所述酿酒酵母的等位基因高效整合方法，包括：
[0013] (1)构建4种基于不同用于酿酒酵母等位基因整合的卡盒的酿酒酵母等位基因整 合质粒；
[0014] (2)将待研究的靶向基因及其侧翼克隆到步骤(1)中的质粒的整合卡盒中；
[0015] (3)针对基因敲除背景的酵母菌株，利用酶切将步骤(2)中的整合卡盒从质粒中释 放出来，转入基因敲除背景的酵母菌株中进行同源重组替换原敲除基因座上的筛选标记基 因，并筛选鉴定；
[0016] 针对转入非基因敲除背景的酵母菌株，设计两对与内源靶基因同向和反向的引 物，以携带相应靶基因的高效整合质粒为模板，利用PCR将携带有多个突变位点的靶基因的 卡盒扩增出来，转入非基因敲除背景的酵母菌株中，同向或反向的替换酵母基因组上的内 源靶基因，并分别通过PCR检测正确整合效率，同时检测靶基因多个突变位点，分析完整性。
[0017] 所述步骤⑵中克隆方式为常规PCR克隆技术。
[0018] 所述步骤(3)中基因敲除背景的酿酒酵母菌株为产业化突变菌株，突变基因座上 具有pTEF和tTEF侧翼的筛选标记基因；所述酶切采用限制性内切酶Notl;所述筛选标记基 因包括URAMX;所述筛选为G418或NAT抗性培养基筛选;所述鉴定为转化子发孢子所产生的 单倍体子代进行抗G418或NAT表型鉴定;所述验证为URA缺陷培养基筛选验证。
[0019] 所述步骤(3)中同向的替换酵母基因组上的内源靶基因时，用于获得整合卡盒的 上游引物5 '末端与靶向基因上游序列互补，上游引物3 '末端与pTEF互补，下游引物5 '末端 与靶向基因下游序列互补，3'末端与tTEF序列互补;所述反向的替换酵母基因组上的内源 靶基因时，上游引物5'末端与靶向基因下游序列互补，下游引物5'末端与靶向基因上游序 列互补。
[0020] 所述引物的3 '末端与pTEF或tTEF配对的序列长度为20bp，引物的5 '末端与靶向基 因上下游配对的序列长度为40bp。
[0021] 所述步骤(3)中分析完整性是利用PCR技术检测各阳性克隆中靶基因左右两翼结 合位点的完整率。
[0022] 本发明的酿酒酵母的等位基因高效整合质粒系统用于基因高效整合，具体包括如 下步骤:设计并构建4种含有不同酵母等位基因整合卡盒的质粒;通过常规PCR克隆技术将 靶向基因及其侧翼克隆到质粒的整合卡盒中；针对基因敲除背景的酵母菌株，选择常规限 制酶酶切技术将整合卡盒从质粒中释放出来，转入基因敲除背景的酵母菌株中，筛选鉴定； 针对非基因敲除背景的酵母菌株，则选择常规PCR技术将整合卡盒从质粒中释放出来，转入 非基因敲除背景的酵母菌株中，筛选、验证及鉴定。该酿酒酵母的等位基因高效整合质粒系 统能够高效、精确的将待研究的等位基因整合到基因组中，该系统的应用将改善现有的酵 母基因功能相关研究技术。
[0023] 本发明涉及基因整合载体的构建，多种基因背景下的等位基因整合方法及菌种基 因工程改造;尤其是适用于酿酒酵母基因组的快速、大通量的等位基因整合方法。
[0024] 有益效果
[0025] 本发明的方法克服现有等位基因整合存在的不足，是一种高效、便捷、高通量、适 用范围更广的等位基因整合方法;尤其是适用于酿酒酵母基因组的快速、大通量的等位基 因整合。
【附图说明】
[0026] 图1为本发明中4种等位基因整合的质粒图谱；
[0027]图2为本发明中Α0Ι克隆到整合卡盒的多种途径；
[0028] 图3为本发明中基因敲除背景下的整合卡盒获取途径及整合方式；
[0029] 图4为实施例5和实施例6中基因敲除背景下ecol和smc整合效率对比；
[0030] 图5为本发明中非基因敲除背景下的整合卡盒获取途径及整合方式；
[0031]图6为实施例7中非基因敲除背景下通过正反两个方向整合ecol基因的完整性对 比。
【具体实施方式】
[0032] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授