1-N-F:
[0089] TACATATTAGGGTTCAACAGAATATAAATCGTTGCACAAACGTACGCTGCAGGTCGACECO1-N-R:
[0090] CATTTTTCCAGTGTCCCTTCTCGCTGTCTTTTCGAAAGAGATCGATGAATTCGAGCTCGTECO1-C-F:
[0091] TACATATTAGGGTTCAACAGAATATAAATCGTTGCACAAATCGATGAATTCGAGCTCGT
[0092] ECO1-C-R:CATTTTTCCAGTGTCCCTTCTCGCTGTCTTTTCGAAAGAGCGTACGCTGCAGGTCGAC
[0093] pTEF-NL-F:GCATACATGGTGCAAAATTATGG
[0094] pTEF-NL-R:GAAAGAAGAACCTCAGTGGC
[0095] pTEF-NR-F:GATGCTCGAT GAGTTTTTCTAA
[0096] pTEF-NR-R:CCAAAACGGTTCTAATACTATAG
[0097] tTEF-CL-F:GCATACATGGTGCAAAATTATGG
[0098] tTEF-CL-R:GATGCTCGATGAGTTTTTCTAA
[0099] tTEF-CR-F:5 ' GAAAGAAGAACCTCAGTGGC
[0100] tTEF-CR-R:5 ' CCAAAACGGTTCTAATACTATAG
[0101] ECO1-F:GCTACAACGGACATCAACAT
[0102] ECO1-R:TGCACTCTCAGTACAATCTGGTTTAG TTCCTCACCTTGTC
[0103] CX:GCTACAACGGACATCAACAT
[0104] 1、针对非基因敲除背景菌株EC01基因，分别设计以上两对与EC01同向（EC01-N)和 反向（EC01-C)的引物，引物3'末端序列有20bp与pTEF(正向整合)或tTEF(反向整合)序列配 对，5'末端有~40bp的靶向基因序列。
[0105] 2、按照实施例5的方法，以质粒携带有EC01及其侧翼的PDH735及正向或反向两对 引物将 pTEF-AOI-pTRPl-kan-tTEF 和 pTEF-AOI-pADHl-nat-tTE 扩增下来。
[0106] 3、通过酵母转化，将上述4个双向整合的整合卡盒，各自转化至非基因敲除背景菌 株中。
[0107] 4、通过G418或cloNAT抗性培养基进行筛选，对于同向整合，获得约500个G418抗性 的转化子，随机挑选其中16转化子进行PCR鉴定，针对上下游结点选用引物pTEF-NL-F/R、 pTEF-CL-F/R、tTEF-NL-F/R、tTEF-CL-F/R进行上下游完整性检测，其中100 %为下游完整整 合，6.2%为上游完整整合。随机挑选4个仅下游完整整合的转化子，用引物EC01-F/R进行 PCR扩增，对其PCR产物用引物CX进行测序，发现其中1个丢失了 L96S突变位点，1个同时丢失 了L96S和E177A突变位点，仅有两个完整保留了三个突变位点。对于反向整合，获得约200个 G418抗性的转化子，随机挑选16个转化子进行PCR鉴定，100 %为上下游完整整合，随机挑选 其中4的PCR产物用引物CX进行测序，发现所有的转化子都保留了三个突变位点。图6为本实 施例中非基因敲除背景下通过正反两个方向整合ecol基因的完整性对比图。
【主权项】
1. 一种酿酒酵母等位基因高效整合质粒系统，其特征在于，所述系统包括4种酿酒酵母 等位基因整合质粒分别为pDH735、pDH818、pDH824和pDH825;其中，pDH735携带的整合卡盒 为：pTEF-attPl-ccdB-CAT-attP2-pTRPl-kan-tTEF;pDH818 携带的整合卡盒为：pT-attPl-ccdB-CAT-attP2-pTRPl-kan-tTEF; pDH824 携带的整合卡盒为：pTEF-attPl-ccdB-CAT-attP2-pADHl-nat-tTEF;pDH825 携带的整合卡盒为：pT-attPl-ccdB-CAT-attP2-pADHl-nat-tTEF〇2. 根据权利要求1所述的一种酿酒酵母等位基因高效整合质粒系统，其特征在于，所述 PDH735的构建方法包括： 将质粒PD0NR221中的attPl-ccdB-CAT-attP2分成上、下游两段分别克隆到pDH734的 pTEF-pTRPl-kan-tTEF卡盒中，构建pTEF-attPl-ccdB-CAT-attP2-pTRPl-kan-tTEF整合卡 盒，所获质粒即为PDH735; 所述PDH818的构建方法包括:将质粒pDH735中的attPl-ccdB-CAT-attP2卡盒克隆到质 粒PDH817中，构建pTEF-attPl-ccdB-CAT-attP2-pTRPl-kan-tTEF整合卡盒，所获质粒即为 PDH818； 所述PDH824的构建方法包括:将质粒pDH735中的attPl-ccdB-CAT-attP2卡盒克隆到质 粒PDH823中，构建pTEF-attPl-ccdB-CAT-attP2-pADHl-nat-tTEF整合卡盒，所获质粒即为 PDH824； 所述PDH825的构建方法包括:将质粒pDH818中的pT启动子及attPl-ccdB-CAT-attP2克 隆到PDH823中，构建pT-attPl-ccdB-CAT-attP2-pADHl-nat-tTEF卡盒，所获质粒即为 PDH825； 其中，质粒PDH734是在pFA6a-kanMX基础上，导入了含有EM7启动子及TRP1启动子的 pTEF-pTRPl-kan-tTEF卡盒；pDH817质粒是在pDH734基础上改造得到，pT启动子仅含有 PDH734上pTEF的前148bp的序列；将ADH1启动子克隆到pAG25中，构建pTEF-pADHl-nat-tTEF 卡盒，所获质粒命名为PDH823。3. -种如权利要求1所述的酿酒酵母等位基因高效整合质粒系统的应用，其特征在于， 应用于酿酒酵母的等位基因高效整合。4. 根据权利要求3所述的一种酿酒酵母等位基因高效整合质粒系统的应用，其特征在 于，所述酿酒酵母的等位基因高效整合方法，包括： (1) 构建4种基于不同用于酿酒酵母等位基因整合的卡盒的酿酒酵母等位基因整合质 粒； (2) 将待研究的靶向基因及其侧翼克隆到步骤(1)中的质粒的整合卡盒中； (3) 针对基因敲除背景的酵母菌株，利用酶切将步骤(2)中的整合卡盒从质粒中释放出 来，转入基因敲除背景的酵母菌株中进行同源重组替换原敲除基因座上的筛选标记基因， 并筛选鉴定； 针对转入非基因敲除背景的酵母菌株，设计两对与内源靶基因同向和反向的引物，以 携带相应靶基因的高效整合质粒为模板，利用PCR将携带有多个突变位点的靶基因的卡盒 扩增出来，转入非基因敲除背景的酵母菌株中，同向或反向的替换酵母基因组上的内源靶 基因，并分别通过PCR检测正确整合效率，同时检测靶基因多个突变位点，分析完整性。5. 根据权利要求4所述的一种酿酒酵母等位基因高效整合质粒系统的应用，其特征在 于，所述步骤(2)中克隆方式为PCR克隆技术。6. 根据权利要求4所述的一种酿酒酵母等位基因高效整合质粒系统的应用，其特征在 于，所述步骤(3)中基因敲除背景的酿酒酵母菌株的基因座上具有pTEF和tTEF侧翼的筛选 标记基因；所述酶切采用限制性内切酶Notl;所述筛选标记基因包括URAMX;所述筛选为 G418或NAT抗性培养基筛选;所述鉴定为转化子发孢子所产生的单倍体子代进行抗G418或 NAT表型鉴定;所述验证为URA缺陷培养基筛选验证。7. 根据权利要求4所述的一种酿酒酵母等位基因高效整合质粒系统的应用，其特征在 于，所述步骤(3)中同向的替换酵母基因组上的内源靶基因时，用于获得整合卡盒的上游引 物5 '末端与靶向基因上游序列互补，上游引物3 '末端与pTEF互补，下游引物5 '末端与靶向 基因下游序列互补，3'末端与tTEF序列互补;所述反向的替换酵母基因组上的内源靶基因 时，上游引物5'末端与靶向基因下游序列互补，下游引物5'末端与靶向基因上游序列互补。8. 根据权利要求7所述的一种酿酒酵母等位基因高效整合质粒系统的应用，其特征在 于，所述引物的3'末端与pTEF或tTEF配对的序列长度为20bp，引物的5'末端与靶向基因上 下游配对的序列长度为40bp。9. 根据权利要求4所述的一种酿酒酵母等位基因高效整合质粒系统的应用，其特征在 于，所述步骤(3)中分析完整性是利用PCR技术检测各阳性克隆中靶基因左右两翼结合位点 的完整率。
【专利摘要】本发明涉及一种酿酒酵母等位基因高效整合质粒系统及其应用，所述系统包括4种酿酒酵母等位基因整合质粒分别为pDH735、pDH818、pDH824和pDH825。所述系统应用于酿酒酵母的等位基因高效整合，整合方法包括：构建4种基于不同用于酿酒酵母等位基因整合的卡盒的酿酒酵母等位基因整合质粒；将待研究的靶向基因及其侧翼克隆到质粒的整合卡盒中；将整合卡盒释放或扩增出来，转入基因敲除背景或者非基因敲除背景的酿酒酵母菌株中，筛选鉴定整合效果。本发明高效、便捷、高通量、适用范围更广的等位基因整合方法；尤其是适用于酿酒酵母基因组的快速、大通量的等位基因整合。
【IPC分类】C12N15/81
【公开号】CN105602983
【申请号】CN201610052533
【发明人】黄志伟, 房志家, 沈裕虎, 孟晓卿, 魏红岩
【申请人】东华大学, 中国科学院西北高原生物研究所
【公开日】2016年5月25日
【申请日】2016年1月26日