的内容之后，本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。
[0033] 实施例1
[0034] 质粒pDH735的构建。
[0035] 1、设计引物
[0036] EM7-F：TCTCACATCACATCCGAACATAAACAACCATGGTCAGTCTAGATGTTGACAATTAATCATCGG C
[0037] EM7-R：TGCACTCTCAGTACAATCTGGTTTAG TTCCTCACCTTGTC
[0038] TRP1-F:GACAAGGTGAGGAACTAAACC AGATTGTACTGAGAGTGCA
[0039] TRP1-R:CCTCGAAACGTGAGTCTTTTCCTTACCCATACTCCAAGCTGCCTTTGTGT
[0040] ATTP1-F:CATGCCATGGCTCGAGCAAATAATGATTTTATTTTGACTGA [0041 ] ATTP1-R:GCGTGGATCCGGCTTACTA
[0042] ATTP2-F:TAGTAAGCCGGATCCACGC
[0043] ATTP2-R:GCTCTAGACAATTGCAAATAATGATTTTATTTTGACTGA
[0044] 2、以酵母基因组DNA作为模板、EM7-F和EM7-R作为扩增引物，使用常规PCR体系及 反应程序进行PCR扩增，获得EM7启动子的PCR产物。同样以酵母基因组DNA作为模板、TRP 1-F 和TRP1-R作为扩增引物，扩增出TRP1启动子的PCR产物。再将EM7启动子及TRP1启动子的PCR 产物进行纯化回收。
[0045] 3、将纯化后的EM7启动子及TRP1启动子的PCR产物、pFA6a-kanMX进行Ncol酶切，通 过SLIC技术将EM7启动子及TRP1启动子克隆到pFA6a-kanMX质粒中，构建pTEF-pTRPl-kan-tTEF卡盒，经卡那霉素筛选后获得正确质粒，所获得质粒即为命名为pDH734。
[0046] 4、以pD0NR221质粒作为模板、ATTP1-F和ATTP1-R作为扩增引物，使用常规PCR体系 及反应程序进行PCR扩增，获得attPl-ccdB-CAT-attP2卡盒上半段的PCR产物。同样以 PD0NR221质粒作为模板、ATTP2-F和ATTP2-R作为扩增引物，获得attPl-ccdB-CAT-attP2卡 盒下半段的PCR产物。再将attPl-ccdB-CAT-attP2卡盒上、下半段的PCR产物进行纯化回收。 [0047] 5、将纯化后的attPl-ccdB-CAT_attP2卡盒上、下半段的PCR产物分别经过Ncol/ BamHI (上半段)和BamHI/XbaI(下半段)双酶切后连接到pDH734的pTEF-pTRPl-kan-tTEF卡 盒中，构建pTEF-attPl-ccdB-CAT-attP2-pTRPl-kan-tTEF整合卡盒，经卡那霉素筛选后获 得正确质粒，所获得质粒即为命名为PDH735，该质粒全长为6749bp。
[0048] 实施例2
[0049] 质粒pDH818的构建。
[0050] 1、设计引物
[0051 ] PT-F:GAATTCTCGAGCCTAGGACTGTCAAGGAGGGTATTC [0052] PT-R:GAATTCTCGAGTAAGGAAAAGACTCACGTTTC
[0053] 2、以质粒pFA6a-kanMX为模板、PT-F和PT-R作为扩增引物，使用常规PCR体系及反 应程序进行PCR扩增，获得pFA6a-kanMX的PCR产物，再将PCR产物进行纯化回收。
[0054] 3、将纯化后的pFA6a-kanMX的PCR产物进行Xhol单酶切，酶切产物进一步进行纯化 回收。
[0055] 4、将纯化后的酶切产物经T4连接酶的作用下进行自连，经卡那霉素筛选后获得正 确质粒，所获质粒命名为PDH817。
[0056] 5、将质粒 pDH735 与 pDH817 进行 XhoI/SacI 双酶切，获得 attPl-ccdB-CAT-attP2-pTRP 1卡盒及线性化的pDH817，酶切产物经纯化经T4连接酶的催化，连接到质粒pDH817中， 构建pTEF-attPl-ccdB-CAT-attP2-pTRPl-kan-tTEF整合卡盒，经卡那霉素筛选后获得正确 质粒，所获质粒即为PDH818，该质粒全长6440bp。
[0057] 实施例3
[0058] 质粒pDH824的构建。
[0059] 1、设计引物
[0060] ADH1-F:
[0061] TTCTCACATCACATCCGAACATAAACAACCATGGTCAGTCTAGACTTGATAGCCATCATCATATC
[0062] ADH1-R:GTAAGCCGTGTCGTCAAGAGTGGTACCCATTGTATATGAGATAGTTGATTG
[0063] 2、以酵母基因组DNA为模板、ADH1-F和ADH1-R作为扩增引物，按照实施例1的方法 将ADH1启动子克隆到pAG25中，构建pTEF-pADHl-nat-tTEF卡盒，所获质粒命名为pDH823。 [0064] 3、对pDH735质粒进行Ascl/Xbal双酶切获得attPl-ccdB-CAT_attP2卡盒，按照实 施例3的方法将attPl-ccdB-CAT-attP2卡盒亚克隆到质粒pDH823中，构建pTEF-attPl-ccdB-CAT-attP2-pADHl-nat-tTEF 整合卡盒，所获质粒即为 pDH824，全长6629bp。
[0065] 实施例4
[0066] 质粒pDH825的构建。
[0067] 1、按照实施例2的方法，将质粒pDH818进行Ascl/Xbal获得pT和attPl-ccdB-CAT- attP2卡盒，按照实施例3的方法，将获得的pT和attPl-ccdB-CAT-attP2卡盒亚克隆到 PDH823中，构建pT-attPl-ccdB-CAT-attP2-pADHl-nat-tTEF卡盒，所获质粒即为pDH825,全 长6320bp。
[0068] 实施例5
[0069] 基因敲除背景菌株ECOl/ecol Δ : :URA3MX等位基因的整合。
[0070] 1、设计引物
[0071] EC01-1F:CGAACATAAACAACCATGGCTGAAATGCCAGAATTGATAATGTA
[0072] EC01-1R:TGCCGATGATTAATTGTCAACATCGTAATCCAACTTCCCATGC
[0073] EC01-2F:CGAACATAAACAACCATGGCTGAAATGCCAGAATTGATAATGTA
[0074] EC01-2R:CGATATGATGATGGCTATCAAGTCGTAATCCAACTTCCCATGC
[0075] 2、以酵母基因组DNA为模板、E⑶1-1F和EC01-1F作为扩增引物，使用常规PCR体系 及反应程序进行PCR扩增，获得EC015 '末端上游及3 '末端各500bp的序列的PCR产物。PCR产 物进行纯化回收。将纯化后的PCR产物、pDH735进行Xhol/Xbal双酶切，再利用T5超保真外切 酶介导的DNA组装技术将EC01及其侧翼克隆到pDH735中。同样，以酵母基因组DNA为模板、 EC01-2F和EC01-2F作为扩增引物，按照同样的方法将EC01及其侧翼克隆到pDH824中。
[0076] 3、通过对携带有EC01及其侧翼的pDH735、pDH824质粒进行Notl酶切J#pTEF-ecolts-pTRPl-kan-t TEF和pTEF-ecolts-pADHl-nat-tTEF整合卡盒从载体中释放出来。 [0077] 4、通过酵母转化，将pTEF-ecolts-pTRPl-kan-tTEF和pTEF-ecolts-pADHl-nat-tTEF整合卡盒转至ECOl/ecol Δ : :URA3MX突变菌株中。
[0078] 5、通过G418或cloNAT抗性培养基进行筛选，获得约100个G418抗性和约300个 cloNAT抗性的酵母转化子，经SC-URA验证，发现其中72%的G418抗性转化子和84.1%的 cloNAT抗性的转化子同时为URA3缺陷。本实施例中基因敲除背景下ecol整合效率如图4所 不。
[0079] 实施例6 [0080] 1、设计引物
[0081 ] SMC3-F:CGAACATAAACAACCATGGCTG GTATTTTGGCAAGGATTCAG
[0082] SMC3-R:TGCCGATGATTAATTGTCAACATGATGACTCAGGGGATTCATCT
[0083] 2、按照实施例5的方法将SMC3克隆到pDH735中。
[0084] 3、针对基因敲除背景菌株SMC3/smc3 Δ : :URA3MX等位基因的整合，按照实施例1的 方法进行smc3等位基因的整合。不同的是将获得的pTEF-ecolts-pTRPl-kan-tTEF整合卡盒 转至SMC3/smc3 Δ : :URA3MX突变菌株中。通过G418抗性培养基进行筛选，获得约50个G418抗 性转化子，经SC-URA验证，发现其中约20.4%同时为URA缺陷。本实施例中基因敲除背景下 smc整合效率如图4所示。
[0085] 实施例7
[0086] 非基因敲除背景菌株等位基因整合。
[0087] 1、设计引物
[0088] EC0