消化后，用含10%小牛血清的培养液配 制成浓度为5000个/mL的细胞悬液，W每孔19化L接种于96孔培养板中，使待测细胞密度至 1000~10000孔(边缘孔用无菌PBS填充）；
[0075] (2)5%C02,37°C解育2地，至细胞单层铺满孔底，每孔加入一定浓度梯度的药物10 yL，每个浓度梯度设4个复孔；
[0076] (3) 5 % C〇2，37 °C解育48小时，倒置显微镜下观察；
[0077] (4)每孔加入10化的MTT溶液(5mg/mL PBS，即0.5%MTT)，继续培养地；
[0078] (5)终止培养，小屯、吸去孔内培养液，每孔加入15化L的DMS0充分溶解甲琐沉淀，振 荡器混匀后，在酶标仪用波长为570nm，参比波长为450nm测定各孔的光密度值；
[0079] (6)同时设置调零孔(培养基、MTT、DMS0)，对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介 质、培养液、MTT、DMS0)。
[0080] (7)根据测得的光密度值(0D值），来判断活细胞数量，0D值越大，细胞活性越强。利 用公式：
[0081]
[0082] 计算化合物对肿瘤细胞生长的抑制率，再WBliss法分别计算各受试化合物对几 种肿瘤细胞株的IC50值。其结果如W下表2所示。
[0083] 表2:配体L和配合物1对不同肿瘤细胞株的IC50值(μΜ)
[0084]
[0085] 从基于ICso值的抗肿瘤活性测试结果来看，配合物1对多种人肿瘤细胞株均显示出 很强的增殖抑制活性，显著高于配体L。其中，配合物1对人肝癌细胞化P-G2和人肺癌细胞 NCI-H460的抑制作用最强，其IC5Q值分别为9.89 ± 0.47和14.25 ± 1.64μΜ，活性与配体L相比 提高了 3.4~10.9倍W上；且其活性也显著高于顺销，相对于顺销，配合物1分别提高了约 1.4和1.3倍。另一方面，配合物1对人正常肝脏细胞化-7702的细胞毒性仍然较小，与配体L 相当，且显著低于顺销，显示出对肿瘤细胞良好的毒性选择性。
[0086] 二、配合物1在化P-G2细胞内对端粒酶的抑制作用：
[0087] 1、细胞培养和加药方式
[0088] 所选细胞株为化P-G2细胞，药物作用时间为24小时，药物终浓度为1 ΟμΜ，细胞培养 和加药方式等其他步骤参照前述步骤进行。
[0089] 2、端粒酶提取和抑制实验
[0090] 端粒酶提取盒采用北京中西远大公司的端粒酶提取盒，货号NKJ1加 LM，-20°C保 存。
[0091] 2.1、端粒酶提取
[0092] 配合物1作用后，从Hep-G2细胞抽取端粒酶提取液，端粒酶的银染实验（TRAP- silver staining assay)参照Reed等人（Reed,J.E.;et al.J.Am.Chem.Soc.,2006,128: 5992-5993.)报道的方法进行。详细步骤如下：
[0093] (1)收集不少于1X106个细胞(约为6孔板的1-2孔细胞量），离屯、2000巧m，5min，离 屯、收集细胞，预冷的PBS洗涂后于冰浴上研磨匀浆；
[0094] (2)加入ImL冰冷的Wash buffer(使用前每毫升PBS中加入化L(lmol/L)的DTT)，重 悬上述样品，置冰上5111；[]1，4"€离屯、（3,000巧111，5111；[]1)，弃上清；
[0095] (3)加入40化冰冷的Lysis buffer(用前每ImL Lysis buffer中加入0.扣L PMSF 和0.扣L0-琉基乙醇）悬浮沉淀，满旋振荡10s，置冰上45min，4°C，离屯、（13，00化pm，30min) 取上清；
[0096] (4)上清转移至新的EP管中（必要时测定总蛋白浓度）WLysis buffer调浓度10μ g/yL，于-20 °C保存备用；
[0097] 2.2、PCR 扩增
[009引（1)吸取扣 L 10 X TRAP buffer，另加入化 L dNTPsayL Taq-DNA polymerase，化1 TS primer，2化端粒酶提取物，然后加入39化灭菌超纯水，于室溫下保溫30min;
[0099] (2)加入化L CX primer混匀，在扩增仪上进行30个循环，94°C预热5min，设置循环 参数如下:94°C变性30s;50°C退火30s;72°C延伸90s;最后72°C延伸5min，4°C保存产物并尽 快电泳。
[0100] 2.3、聚丙締酷胺凝胶电泳
[0101] (1)制备12%非变性聚丙締酷胺凝胶（lOmL):包括30%Acr-Bis(29: l)4mL、H2〇 (4.92mL)、10 X TBE (ImL)、10 % APS (70yL)和 10化的 TEMED。
[0102] (2)取化L PCR产物加上化L lOX上样缓冲液，于电压180V，12%非变性聚丙締酷 胺凝胶垂直电泳预跑45min，在电压220V，12%非变性聚丙締酷胺凝胶垂直电泳化；
[0103] 2.4、硝酸银染色
[0104] (1)将凝胶置10%乙酸固定30min，去离子水漂洗3次，每次5min;
[0105] (2)将凝胶置于0.2g/L硫代硫酸钢浸泡Imin，去离子水漂洗3次，每次30s;
[0106] (3)将凝胶置于硝酸银染液染色30min，去离子水漂洗30s;
[0107] (4)将凝胶置于显色液中显色10-15min左右直到条带显色完全为止；
[0108] (5)最后将凝胶置于10%乙酸浸泡5min终止反应。
[0109] 2.5、结果判断与数据处理：
[0110] PCR扩增产物W硝酸银染色，出现6bp或间隔6bp整数倍的梯形条带为阳性结果，W 凝胶成像软件测定条带，得出各标本的相对吸光度I0D值代表端粒酶活性。阳性条带WGel proA.O版凝胶光密度分析软件进行分析，测其I0D(integrated optical density)累积光 密度，每次均设有空白对照组。计算公式如下：
[0111]
[0112] 计算化合物对化P-G2肿瘤细胞中端粒酶的抑制率，其实验结果如W下图3所示。
[0113] 从端粒酶实验结果可W看出，在人肝癌细胞化P-G2中，配合物1(10μΜ)对端粒酶的 抑制作用高达56.97%，其抑制作用远远大于同等浓度下的顺销(抑制率为17.89);与本申 请人已经报道的1-氮杂苯并蔥酬与6-径基氧化异阿朴啡的销（II)配合物的端粒酶抑制活 性相比（抑制率分别为40.28%和43.96%)，也显著提高，充分说明配合物1对端粒酶具有了 更高的祀向作用，是一种较好的端粒酶抑制剂。
[0114] 综上所述，本发明所述的配合物1表现出优异的体外抗肿瘤活性和选择性，对肿瘤 细胞的细胞毒性优于配体L，具有良好的潜在药用价值，是一种较好的端粒酶抑制剂。
【主权项】
1. 下式(I)所示化合物或其药学上可接受的盐：2. 权利要求1所述化合物的合成方法，其特征在于:取9-氨基氧化异阿朴啡和二氯?二 (二甲基亚砜)合铂(II)，溶解于极性溶剂中，进行配位反应，即得到目标产物。3. 根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于包括以下步骤： 1) 取9-氨基氧化异阿朴啡和二氯?二(二甲基亚砜)合铂（II)，溶解于极性溶剂中，得 到混合溶液； 2) 所得混合溶液于常温至极性溶剂的回流温度范围内进行配位反应； 3) 将反应后溶液浓过滤，分离出固体，即得到目标产物。4. 根据权利要求2或3所述的合成方法，其特征在于:所述的极性溶剂为甲醇和乙腈的 组合，或者是甲醇和乙腈与选自丙酮和二甲基亚砜中的一种或两种的组合;所述甲醇的浓 度为50~90v/v % ;在极性溶剂的组成中，所述甲醇在极性溶剂中所占的比例为0.5~ 99.5v/v%，乙腈在极性溶剂中所占的比例为0.5~99.5v/v%，丙酮在极性溶剂中所占的比 例为0~99v/v%，二甲基亚砜在极性溶剂中所占的比例为0~99v/v%。5. 根据权利要求2或3所述的合成方法，其特征在于:配位反应在60°C至极性溶剂的回 流温度范围内进行。6. 权利要求1所述化合物或其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物中的应用。7. 以权利要求1所述化合物或其药学上可接受的盐为有效成分制备的抗肿瘤药物。8. 权利要求1所述化合物或其药学上可接受的盐在制备端粒酶抑制剂中的应用。9. 以权利要求1所述化合物或其药学上可接受的盐为有效成分制备的端粒酶抑制剂。
【专利摘要】本发明公开了一种9-氨基氧化异阿朴啡-铂(II)配合物及其合成方法和应用。该9-氨基氧化异阿朴啡-铂(II)配合物是以9-氨基氧化异阿朴啡和二氯·二(二甲基亚砜)合铂(II)为原料，在极性溶剂中进行配位反应，制得目标产物。申请人的研究表明，本发明所述配合物对端粒酶的抑制作用相对于现有的1-氮杂苯并蒽酮的铂(II)配合物和6-羟基氧化异阿朴啡的铂(II)配合物有明显提高，达到了56.97％，对端粒酶活性抑制作用明显；且该配合物对多种人肿瘤细胞株和一株正常肝细胞具有较好的选择性和显著的体外抗肿瘤活性。本发明所述配合物的结构式如下式(I)所示。
【IPC分类】A61K31/555, A61P35/00, C07F15/00
【公开号】CN105669763
【申请号】CN201511023582
【发明人】陈振锋, 梁宏, 刘延成, 蒙婷, 覃其品, 梁月兰, 伍宸旋
【申请人】广西师范大学
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2015年12月30日