一种快速区分iltv、ibv、mg和ms的多重荧光免疫分析方法及试剂的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种快速区分ILTV、IBV、MG和MS的多重荧光免疫分析方法及试剂。本发明操作简单，通过PCR获得目标扩增片段，然后将扩增产物、荧光编码微球和链霉亲和素?藻红蛋白进行杂交，然后通过检测仪读取MFI值，分辩不同类型的病原。本发明方法，能够同时对鸡传染性喉气管炎病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体进行准确检测，而且特异性强，灵敏度高，重复性好。与传统检测方法相比，本发明方法实现了对同一样本中的多种不同目的分子同时进行检测，样本用量少，操作简单、快速，可大大降低检测成本。本发明的灵活性好，可以根据需要在此基础上加减检测病原的种类。
【专利说明】
-种快速区分I LTV、I BV、MG和MS的多重黄光免疫分析方法及 试剂
技术领域
[0001] 本发明属于养殖业的病原检测领域，具体设及一种快速区分鸡传染性喉气管炎病 毒(ILTV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、鸡毒支原体(MG)和鸡滑液囊支原体(MS)的多重巧 光免疫分析方法及试剂。
【背景技术】
[0002] 随着市场对禽类的需求不断增多，养禽业得到迅猛的发展，养禽业集约化程度不 断提高，禽呼吸道病原的感染呈逐年上升趋势。禽的呼吸道疾病一直是导致养禽业重大经 济损失的主要因素。鸡呼吸道疾病的病原有其复杂性，它可有病毒、支原体W及细菌引起发 病，在临床上还会出现各种混合感染。运些疾病的产生在养鸡生产中不容忽视。鸡的呼吸道 疾病经常发生，各种日龄的鸡均可感染甚至导致死亡，成年鸡产蛋会下降，同时鸡的呼吸道 疾病发病率高，容易引起多种疾病的继发感染，例如支原体会诱发鸡的肺炎和气囊炎，所W 积极预防和及时治疗呼吸道疾病有着重大的意义。
[0003] 鸡传染性喉气管炎病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体 是重要的禽呼吸道病原，临床症状和病理变化极为相似，在临床和组织病理学上很难区分。 鸡呼吸道疾病多是混合感染，在临床上容易造成误诊，其鉴别诊断通常需借助实验室诊断 技术，病毒的分离和鉴定、血清学试验、酶联免疫吸附试验W及分子生物学诊断。传统的检 测方法敏感性低，特异性差，不易检测出混合感染，而且操作方法繁琐，不利于疾病的及时 诊断治疗，造成重大的经济损失。
[0004] 随着分子生物学的快速发展，多重PCR已广泛应用于禽病混合感染的鉴别诊断，其 原理是设计能够同时扩增出多种待测病原特定片段大小的多对引物，在PCR反应体系中加 入多对引物，能够对多种病原进行鉴别诊断。多重RT-PCR因其灵敏性、特异性和操作的简单 性被广泛应用于禽病的混合感，但结果判定需要电泳，费时费力，且反应产物容易产生污染 而导致假阳性，而多重PCR是靠片段的大小来区别的，一般到了Ξ重W上，片段大小差别大， 其每种病毒的扩增效率不一样，造成结果存在偏差。巧光定量PCR技术融合了 PCR的多种优 点，通过直接检测PCR反应过程中巧光信号的变化实现对目的分子的定量，不需要电泳检 测，并且整个过程完全闭管式操作，污染机率降低，避免了常规PCR容易造成的假阳性问题。 相对常规PCR，巧光定量PCR在敏感性、特异性与速度等方面具有优势，但在实际应用中，当 样品量非常大时，单重巧光PCR在成本和时间方面就存在一定的劣势，而建立一个多重巧光 PCR方法比单重的要复杂得多，其对试剂和引物的要求更高，同时需要保证不同探针所标记 的巧光基团间无相互干扰，使用的巧光定量PCR仪具有相应的多个检测通道，使实验难度加 大。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种快速区分鸡传染性喉气管炎病毒（ILTV)、鸡传染性支 气管炎病毒(IBV)、鸡毒支原体(MG)和鸡滑液囊支原体(MS)的多重巧光免疫分析的引物。
[0006] 本发明的另一目的在于提供一种快速区分鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)、鸡传染 性支气管炎病毒（IBV)、鸡毒支原体(MG)和鸡滑液囊支原体(MS)的多重巧光免疫分析的试 剂。
[0007] 本发明的再一目的在于提供一种快速区分鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)、鸡传染 性支气管炎病毒（IBV)、鸡毒支原体(MG)和鸡滑液囊支原体(MS)的多重巧光免疫分析的方 法。
[0008] 本发明所采取的技术方案是： 一种快速区分ILTV、IBV、MG和MS的多重巧光免疫分析的引物，所述引物核巧酸序列如 下所示： 引物L2:5'-TCATCGTGCTCGGTGTCC-3'（SEQ ID N0:2); 引物B1:5'-AATCACGCTCAAGTTCAAGGC-3'（SEQ ID N0:3)， 引物82:5'-6〔417617〇：1'押〇：1^41'(：-3'（沈9 10側：4); 引物Gl:5'-CTTACAGATTACAGGAGCAG-3'（沈Q ID N0:5)， 引物G2:5'-AAGCATTTCATTTGTTTTAC-3'（SEQ ID N0:6); 引物51:5'-47^6〔46(：了46了6〔46了66-3'（沈9 10側：7)， 引物52:5'-1'17646647^1^46了41'176-3'（沈9 10側：8)。
[0009] 进一步的，所述引物LI和L2其中一条引物的5'端被生物素化； 所述引物B1和B2其中一条引物的5'端被生物素化； 所述引物G1和G2其中一条引物的5'端被生物素化； 所述引物S1和S2其中一条引物的5'端被生物素化。
[0010] 进一步的，所述引物L1和L2、B1和B2、G1和G2、S1和S2中未被生物素化的引物的5' 端连接有tag序列，所述tag序列能与巧光编码微球中带有的anti-tag序列互补配对。
[0011] 进一步的，所述引物L1和L2、B1和B2、G1和G2、S1和S2运4组引物对中连接的tag序 列选自SEQ ID N0:9~12所示的化g序列，且该4组引物对中连接的化g序列互不相同。
[0012] 一种快速区分ILTV、IBV、MG和MS的多重巧光免疫分析的试剂，该试剂中含有上述 任一所述引物。
[0013] 进一步的，上述试剂中还含有链霉亲和素-藻红蛋白复合物、4种编码不同巧光色 的巧光编码微球。
[0014] 进一步的，所述巧光编码微球中还含有与引物中tag序列互补配对的anti-tag序 列，编码不同巧光色的巧光编码微球中含有的anti-tag序列互不相同。
[001引一种快速区分ILTV、IBV、MG和MS的多重巧光免疫分析的方法，包括如下步骤： 1) 从样品中提取病毒RNA或/和DNA; 2) W提取的病毒RNA或/和DNA为模板，用上述任一所述的引物进行RT-PCR扩增； 3) 将上步扩增产物、4种编码不同巧光色的巧光编码微球、链霉亲和素-藻红蛋白进行 杂义； 4) 杂交结束后，通过Luminex系统对杂交产物进行检测分析，确定其病原的类型； 上述方法用于非疾病的诊断和治疗。
[0016] 进一步的，步骤2)中RT-PCR扩增的反应体系为： 5 X buffer 4μΙ dNTP 0.8μΙ 引物混合液 化L 酶 0.8yL 模板 山L dd 出 0 11.化1 Total 20yL 进一步的，步骤2)中RT-PCR扩增的反应程序为：50°C反转录30min; 94°C预变性15min; 94°C 变性 30s，60°C 退火 25s，72°C 延伸 20s;循环 35 次;72°C 终延伸 lOmin。
[0017] 进一步的，步骤3)中所述杂交的反应体系和程序为： 4种巧光编码微球 2化L 链霉亲和素-藻红蛋白 75yL 扩增产物 5yL 总体积 100yl^;37°C 反应 30min。
[001引本发明的有益效果是： 1)本发明方法可W同时对鸡传染性喉气管炎病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡毒支原 体和鸡滑液囊支原体进行检测，本发明通过RT-PCR获得目标扩增片段，再将扩增产物、巧光 编码微球和链霉亲和素-藻红蛋白（SA-PE)进行杂交，然后通过检测仪读取MFI值时，分辩不 同类型的病原。
[0019] 2)本发明方法能够同时对鸡传染性喉气管炎病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡毒 支原体和鸡滑液囊支原体进行准确检测，而且特异性强，灵敏度高，重复性好。与传统检测 方法相比，本发明方法实现了对同一样本中的多种不同目的分子同时进行检测，样本用量 少，操作简单、快速，可大大降低检测成本。本发明能保证相同的复性溫度和杂交效率，且有 效避免不同检测物标记的微球之间交叉杂交。
【附图说明】
[0020] 图1是鸡传染性喉气管炎病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡毒支原体和鸡滑液囊支 原体及人工模拟的四重感染的RT-PCR的电泳图； 图2是鸡传染性喉气管炎病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体 及人工模拟的四重感染的多重巧光免疫分析方法检测实验结果图； 图3是鸡传染性喉气管炎病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体 的多重巧光免疫分析方法检测特异性实验结果图； 图4是鸡传染性喉气管炎病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体 的多重巧光免疫分析方法检测灵敏度实验结果图； 图5是鸡传染性喉气管炎病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体 的多重巧光免疫分析方法临床检测实验结果图。
【具体实施方式】
[0021] 一种快速区分ILTV、IBV、MG和MS的多重巧光免疫分析的引物，所述引物核巧酸序 列如下所示： 引物L2:5'-TCATCGTGCTCGGTGTCC-3'（SEQ ID N0:2); 引物B1:5'-AATCACGCTCAAGTTCAAGGC-3'（SEQ ID N0:3)， 引物82:5'-6〔417617〇：1'押〇：1^41'(：-3'（沈9 10側：4); 引物Gl:5'-CTTACAGATTACAGGAGCAG-3'（沈Q ID N0:5)， 引物G2:5'-AAGCATTTCATTTGTTTTAC-3'（SEQ ID N0:6); 引物51:5'-47^6〔46(：了46了6〔46了66-3'（沈9 10側：7)， 引物52:5'-1'17646647^1^46了41'176-3'（沈9 10側：8)。
[0022] 优选的，所述引物LI和L2其中一条引物的5'端被生物素化； 所述引物B1和B2其中一条引物的5'端被生物素化； 所述引物G1和G2其中一条引物的5'端被生物素化； 所述引物S1和S2其中一条引物的5'端被生物素化。
[0023] 优选的，所述引物L1和L2、B1和B2、G1和G2、S1和S2中未被生物素化的引物的5'端 连接有tag序列，所述tag序列能与巧光编码微球中带有的anti-tag序列互补配对。
[0024] 优选的，所述引物L1和L2、B1和B2、G1和G2、S1和S2运4组引物对中连接的tag序列 选自SEQ ID N0:9~12所示的化g序列，且该4组引物对中连接的化g序列互不相同。
[0025] 一种快速区分ILTV、IBV、MG和MS的多重巧光免疫分析的试剂，该试剂中含有上述 任一所述引物。
[0026] 优选的，上述试剂中还含有链霉亲和素-藻红蛋白复合物、4种编码不同巧光色的 巧光编码微球。
[0027] 优选的，所述巧光编码微球中还含有与引物中tag序列互补配对的anti-tag序列， 编码不同巧光色的巧光编码微球中含有的anti-tag序列互不相同。
[002引一种快速区分ILTV、IBV、MG和MS的多重巧光免疫分析的方法，包括如下步骤： 1) 从样品中提取病毒RNA或/和DNA; 2) W提取的病毒RNA或/和DNA为模板，用上述任一所述的引物进行RT-PCR扩增； 3) 将上步扩增产物、4种编码不同巧光色的巧光编码微球、链霉亲和素-藻红蛋白进行 杂义； 4) 杂交结束后，通过Luminex系统对杂交产物进行检测分析，确定其病原的类型； 上述方法用于非疾病的诊断和治疗。
[0029]优选的，步骤2)中RT-PCR扩增的反应体系为： 5 X buffer 4μΙ dNTP 0.8μΙ 引物混合液 化L 酶 0.8yL 模板 山L dd 出 0 11.化1 Total 20yL 优选的，步骤2)中RT-PCR扩增的反应程序为：50°C反转录30min;94°C预变性15min;94 。(:变性30s，60°C退火25s，72°C延伸20s;循环35次;72°C终延伸lOmin。
[0030] 优选的，步骤3)中所述杂交的反应体系和程序为： 4种巧光编码微球 2化L 链霉亲和素-藻红蛋白 75yL 扩增产物 5yL 总体积 100yl^;37°C 反应 30min。
[0031] 优选的，步骤3)中4种编码不同巧光色的巧光编码微球中还含有与引物中tag序列 互补配对的anti-tag序列，4种巧光编码微球中含有的anti-tag序列互不相同。
[0032] 下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
[0033] 实施例1引物 经过对所设计的大量引物进行筛选后，发现引物对L1和L2、B1和B2、G1和G2、S1和S2对 同时快检测鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、鸡毒支原体(MG) 和鸡滑液囊支原体(MS)的效果最好，其碱基序列如下所示。
[0034] 引物L1:ACTGTGTAAAGCAGGCCAAGGTCTGT(沈Q ID N0:1); 引物L2:AACAATCAATTTGGCACAATGCC(SEQ ID N0:2); 引物S1:CCCAGCCATATACTCAGTCGTGC(沈Q ID N0:3); 引物S2:TCCACAACTTTTGTGACAGGACAC(沈Q ID N0:4); 引物P1:AGATCACAGAGCCCGTCAAAAT(沈Q ID N0:5); 引物P2:GCATATAACATCCAATACGAGTTTGAA(SEQ ID N0:6); 引物R1:ACGTCTCAAATACACTCTGATAC(沈Q ID N0:7); 引物R2:TTCCAATCKGGAGATTGCAAGTTG(沈Q ID N0:8)。
[0035] 本发明采用多重巧光免疫分析的方法对4种ILTV、IBV、MG和MS病原进行区分，故将 上述引物作进一步的修饰，W满足相应的操作要求。其中引物L1、B1、G1和S1的5'端连接有 tag序列，所连接的化g序列分别为： 引物L1 的tag序列为：5'-ATCTCAATTACAATAACACACAAA-3'（沈Q ID N0:9); 引物B1 的tag序列为：5'-ATTAAACAACTCTTAACTACACAA-3'（沈Q ID N0:10); 引物G1 的tag序列为：5'-CACTACACATTTATCATAACAAAT-3'（沈Q ID N0:11); 引物SI的化g序列为：5'-CTTTCTTAATACATTACAACATAC-3'（SEQ ID N0:12)。
[0036] 另外，引物L2、B2、G2和S2的5 '端还添加有生物素标记。
[0037] 实施例2用于快速区分鸡传染性喉气管炎病毒（ILTV)、鸡传染性支气管炎病毒 (IBV)、鸡毒支原体(MG)和鸡滑液囊支原体(MS)的多重巧光免疫分析试剂 该试剂包括W下组分： (1) 实施例1所设计的用于多重巧光免疫分析的引物； (2) 4种编码不同巧光色的包含有anti-tag序列的巧光编码微球，所述anti-tag序列能 相应地与多重巧光免疫分析引物中的tag序列互补配对;4种微球均购自luminex公司，其中 11；1'￥、18￥、]\15和]\16分别对应的巧光编码微球号为^46-4067、]\0'46-4036、]\0'46-4025和]\0'八6- 042。
[003引（3)链霉亲和素-藻红蛋白复合物。
[0039] 实施例3 ILTV、IBV、MS和MG的多重巧光免疫分析方法检测方法的建立 (1)比^、18￥、]\18和]\?；质粒的构建 用天根的核酸自动抽取仪分别提取ILTV、IBV、MG、MS病原的RNA/DNA，分别用引物对L1 和L2、B1和B2、G1和G2、S1和S2进行RT-PCR扩增，将扩增产物分别进行琼脂糖凝胶电泳检测 并切胶纯化，将纯化后的cDNA分别连接至PMD-19T载体中，将连接产物转化至D册a感受态细 胞，挑选单克隆，进行菌落PCR鉴定，将鉴定为阳性菌的菌落进行质粒抽提，送测序。
[0040] (2)质粒PCR扩增 用实施例1所述的引物分别对比^、18￥、15、16引物进行单重、四重^斗0?扩增。
[0041] 上游引物混合液的制备:将L1、B1、G1和S1W摩尔比1:1:1:1比例进行混合;下游引 物混合液的制备:将L2、B2、G2和S2W摩尔比1:1:1:1比例进行混合。利用ILTV、IBV、MS、MG4 种病原的特异性模板，W及比1'￥、18￥、15、16四重模板，对上述四种病毒的特应性区域进行 扩增。其中四重模板的制备:将四种质粒W体积比1:1:1:1的比例进行混合。
[0042] PCR扩增反应体系如下：
扩增的反应程序为:94°C预变性5min;94°C变性30s，60°C退火25s，72°C延伸20s;循环 35 次；72°C 终延伸 lOmin。
[0043] 电泳检测结果:将上述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，其电泳图如图1所示。Μ: DL2000bp DNA marker，1: IBV，2:1LTV，3:MG，4:MS，5:对IBV+ILTV+MS+MG进行的四重PCR，6: PCR空白对照。从图1中可W看出，ILTV的扩增产物大小约为l"bp，IBV的扩增产物大小约为 16化p，MG的扩增产物大小约为133bp，MS的扩增产物大小约为14化P，由于运四种病毒的扩 增产物大小相近，所W四重PCR扩增产物的电泳条带无法分辨。
[0044] (3)将所得的PCR产物与巧光编码微球工作液、链霉亲和素藻红蛋白（SA-PE)工作 液杂交，包括W下步骤： 分别包被有特异的anti-tag序列的4种微球，其中anti-tag序列能相应地与ILTV、IBV、 MS和MG四种病毒引物上的tag序列互补配对。四种微球均购自luminex公司，具体的ILTV、 IBV、MS 和 MG 分别对应的巧光编码微球号为 MTAG-A067、MTAG-A036、MTAG-A025 和 MTAG-042。
[0045] 巧光编码微球工作液的制备：将2500个/μ1巧光编码微球用1 . 1 X Tm Hybrdization Buffer稀释到化1约含有125个/种巧光编码微球。
[0046] SA-PE工作液制备：将Img/ml SA-PE用 1 XTm Hybrdization Buffer稀释到lOyg/y Ιο
[0047] 充分重悬巧光编码微球工作液，每个样品孔和背景孔加入微球工作液20μ1，样品 孔中加入扣1 PCR产物，背景孔中加入扣1 PCR blank产物，再加入75μ1的SA-阳工作液，充 分混匀，于金属加热器中37°C解育30min。
[004引依照检测仪Luminex 200仪器的说明将杂交后的50μ1上述反应液进行检测，结果 如图2所示，图中"ILTV+IBV+MS+M护表示四重PCR结果；"ILTr、"IBr、"MG"、"MS"分别对 ILTV、IBV、MG、MS进行的单重PCR;从图2中可W看出，虽然四重模板的扩增产物无法用电泳 分辨，但用检测仪Luminex 200仪器读取MFI值时，明显分辩不同类型的病原。
[0049] 结果判断标准(注:该判断标准仅供参考，亦可对结果判断标准进行调整)如下： 最低检测阔值(cutoff值)的确定:选取10头健康鸡组织样品(每个样品平行重复3次）， 分别读取MFI值并计算其平均值和标准差。W平均值加3倍标准差的MIF值设定其为cutoff 值。本发明所获得cutoff值为381.3，因此将本发明的cutoff值定为400。只有检测样品的 MFI值高于400时，该实验数据才能进行有效分析。
[0050] 待测样本的分析判断：1)当待测样本的MFI值>400时，判断为阳性样本;2)待测样 本的MFI值《400时，判断为阴性，需要进行重复实验或采取其他检测方法进一步验证。
[0051 ] 实施例4 ILTV、IBV、MS和MG的多重巧光免疫分析检测特异性实验 分别用鸡传染性喉气管炎病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡滑液囊支原体、鸡毒支原 体、禽流感病毒、新城疫病毒、传染性法氏囊病毒、禽白血病病毒、禽传染性贫血病毒、马立 克病毒作为模板进行多重巧光免疫分析检测。实验结果如图3所示，只有传染性喉气管炎病 毒、传染性支气管炎病毒、滑液囊支原体、鸡毒支原体为阳性，其他的均为阴性，说明检测体 系特异性良好。
[0化2] 实施例5: ILTV、IBV、MS和MG的多重巧光免疫分析检测灵敏性实验 将制备的质粒进行定量，采用10倍稀释法进行稀释，稀释至lQicopies/μΙ，用上述建立 的多重巧光免疫分析方法进行检测。ILTV、IBV、MS和MG的多重巧光免疫分析检测灵敏性实 验结果如图4所示，实验结果表明，所有病原的灵敏度检出限为102copies/yl。
[0053] 实施例6:样品的检测 从鸡场采集的喉气管、肺、肾、肝样品，用天根核酸自动抽取仪提取RNA/DNA，使用 Qiagen的RT-PCR kit进行扩增，WRNA/DNA作为模板，采用上述比^、18￥、15、16的多重巧光 免疫分析检测方法进行检测，扩增产物与巧光编码微球和SA-PE杂交，在Luminex 200检测 仪上读数。具体步骤参照实施例3,实验结果如图5所示。
[0054] 经普通PCR检测实验结果表明，样品1、2、3、5、6、12、21为阴性样本;4、7、9、10、14、 17、18、19、20为鸡传染性喉气管炎病毒样品;5、11为鸡滑液囊支原体样品；13为鸡传染性支 气管炎病毒样品;8、15、16为鸡毒支原体样品。通过测序分析，结果一致。
[0055] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种快速区分ILTV、IBV、MG和MS的多重荧光免疫分析的引物，所述引物核苷酸序列 如下所示： 引物L1:5'-GCAGCGAAAAGAAGGC-3'（SEQIDN0:1)， 引物L2:5'-TCATCGTGCTCGGTGTCC-3'（SEQ ID N0:2); 引物B1:5'-AATCACGCTCAAGTTCAAGGC-3'（SEQ ID N0:3)， 引物B2:5'-GCATTGTTCCTCTCCTCATC-3'（SEQIDN0:4); 引物G1:5'-CTTACAGATTACAGGAGCAG-3'（SEQ ID N0:5)， 引物G2:5'-AAGCATTTCATTTGTTTTAC-3'（SEQIDN0:6); 引物S1:5'-ATTAGCAGCTAGTGCAGTGG-3'（SEQ ID N0:7)， 引物S2:5'-TTTGAGGATTATCAGTATTTG-3'（SEQ ID N0:8)。2. 根据权利要求1所述的引物，其特征在于： 所述引物L1和L2其中一条引物的5'端被生物素化； 所述引物B1和B2其中一条引物的5 '端被生物素化； 所述引物G1和G2其中一条引物的5'端被生物素化； 所述引物S1和S2其中一条引物的5'端被生物素化。3. 根据利要求1所述的引物，其特征在于，所述引物L1和L2、B1和B2、G1和G2、S1和S2中 未被生物素化的引物的5 '端连接有tag序列，所述tag序列能与焚光编码微球中带有的 anti-tag序列互补配对。4. 根据权利要求1或3所述的引物，其特征在于，所述引物L1和L2、B1和B2、G1和G2、S1和 S2这4组引物对中连接的tag序列选自SEQ ID NO: 9~12所示的tag序列，且该4组引物对中连 接的tag序列互不相同。5. -种快速区分ILTV、IBV、MG和MS的多重荧光免疫分析的试剂，其特征在于，该试剂中 含有权利要求1~4任一所述引物。6. 根据权利要求5所述的试剂，其特征在于，该试剂中还含有链霉亲和素-藻红蛋白复 合物、4种编码不同荧光色的荧光编码微球。7. 根据权利要求5所述的试剂，其特征在于，所述荧光编码微球中还含有与引物中tag序列 互补配对的anti-tag序列，编码不同焚光色的焚光编码微球中含有的anti-tag序列互不相同。8. -种快速区分ILTV、IBV、MS和MS的多重荧光免疫分析的方法，其特征在于，包括如下步骤： 1) 从样品中提取病毒RNA或/和DNA; 2) 以提取的病毒RNA或/和DNA为模板，用权利要求1~4任一所述的引物进行RT-PCR扩增； 3) 将上步扩增产物、4种编码不同荧光色的荧光编码微球、链霉亲和素-藻红蛋白进行杂交； 4) 杂交结束后，通过Luminex系统对杂交产物进行检测分析，确定其病原的类型； 上述方法用于非疾病的诊断和治疗。9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于:步骤2)中RT-PCR扩增的反应体系为： 5. buffer 4yL dNTP 0.8yL 引物混合液 2nL 酶 0.8yL 模板 lyL ddH20 11.4pL Total 20pL； 步骤2)中RT-PCR扩增的反应程序为：50°C反转录30min; 94°C预变性15min; 94°C变性 30s，60°C 退火 25s，72°C 延伸 20s;循环 35 次；72°C 终延伸 lOmin。10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于:步骤3 )中所述杂交的反应体系和程序为： 4种荧光编码微球 2〇tiL 链霉亲和素-藻红蛋白 75tiL 扩增产物 5仙 总体积 100yL;37°C 反应 30min。
【文档编号】C12Q1/70GK106011313SQ201610573183
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月19日
【发明人】郭鹏举, 朱余军, 丛峰, 黄韧, 陈梅丽
【申请人】广东省实验动物监测所