一种用于可见光致细胞收割的钙钛矿薄膜器件及其制备方法和应用
【专利摘要】本发明公开了一种用于可见光致细胞收割的钙钛矿薄膜器件及其制备方法和应用，该钙钛矿复合薄膜器件为典型的“三明治”结构，自下而上依次包括导电基板、钙钛矿层、导电封闭层及蛋白层，所述的钙钛矿复合薄膜器件可高效吸收可见光并转化为电势，并具有良好的细胞相容性。将其用于可见光致细胞收割的方法是：以钙钛矿复合薄膜器件作为细胞培养表面进行细胞体外培养，再采用可见光照射该培养表面，细胞及细胞片层即可从上述器件表面脱附。本发明方法避免了传统酶解法对细胞功能造成的损伤。利用该方法可获得成骨细胞、心肌细胞等多种细胞片层，具有普适性，且实验条件温和，易操作，便于推广实施。
【专利说明】
一种用于可见光致细胞收割的钙钛矿薄膜器件及其制备方法和应用
技术领域
[0001]本发明属于组织工程领域，具体涉及一种用于可见光致细胞收割的钙钛矿复合薄膜器件及其制备方法，以及利用该钙钛矿复合薄膜器件进行可见光致获取体外培养的细胞及细胞片层的方法。
【背景技术】
[0002]随着生命科学的发展，机体由于损伤和病变造成的组织缺损被再生和替换已不再是梦想。组织工程技术的基本要素包括有良好应答特性的组织细胞、起支撑作用的细胞外基质以及促进细胞和组织再生的生物活性因子。而细胞片层组织工程可以实现这些目标。细胞片层不仅包括应答性良好的组织细胞，还可以保存组织所必须的细胞表面蛋白、细胞外基质环境及细胞间连接的完整。这些因素对组织工程修复是非常重要的。因此，如何以温和的非侵入式的方法获得完整的细胞片层对于细胞片层组织工程来说是关键问题。目前，大多数的细胞片层获取都是采用温敏系统，即通过降低温度改变材料表面的亲疏水性进而获得细胞片层。但长时间的低温在一定程度上会损伤细胞功能。近年来，一些其他的细胞收割方法也相继被报道，包括电致、磁致、PH改变及紫外光致细胞脱附等。事实上，在这些脱附过程中，也伴随着细胞质蛋白分子的调节而影响细胞功能。因此，更有效的及更易操纵的细胞收割方法对细胞片层技术的发展非常关键。
[0003]洪逸等采用光敏半导体二氧化钛通过紫外光照改变材料表面的亲疏水性成功获得细胞片层(Yi Hong , Mengf e i Yu , Wen j ian Weng , et a 1.Light-1nduced celldetachment for cell sheet technology ,B1materials，34(2013) 11-18)。但是，紫外光对细胞存在一定的毒性并可能造成基因突变，故这种方法也存在一定缺陷。因此，利用可见光实现细胞脱附受到关注。
[0004]可见光响应材料目前研究最多的是太阳能领域。太阳能是人类取之不尽的清洁能源，传统的太阳能电池材料即对可见光吸收，并可将其转化为电能。近年来，新兴的一种利用有机金属卤化物钙钛矿结构(CH3NH3PbX3Per0Vskite)作为吸光材料的全固态钙钛矿太阳能电池被称为太阳能技术中的一个重要突破。钙钛矿材料及器件的最大优势在于可以高效吸收可见光并实现光生载流子的激发、运输及分离等过程，并产生很高的开路电压。因此，选取对可见光响应的钙钛矿薄膜器件作为细胞培养表面，通过材料的制备工艺及可见光的强弱来调控光敏器件对可见光的响应及光电效应，研究可见光下材料与细胞或细胞与细胞之间的相互作用，对于细胞片层脱附、组织工程、细胞治疗等的发展都有重要的意义。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种用于可见光致细胞收割的钙钛矿复合薄膜器件及其制备方法和应用，该钙钛矿复合薄膜器件为典型的“三明治”结构，可高效吸收可见光并转化为电势，此外具有良好的细胞相容性。利用上述钙钛矿复合薄膜器件用于可见光下体外培养细胞收割，可在可见光条件下高效温和的获取低损伤的完整细胞片层。
[0006]本发明的用于可见光致细胞收割的钙钛矿复合薄膜器件采用典型的“三明治”结构，其自下而上依次包括导电基板、钙钛矿层、导电封闭层及蛋白层，所述的导电基板为导电玻璃、钽片或医用金属钛片，导电玻璃通常为ITO或FT0;所述的钙钛矿层为铅钙钛矿CH3NH3PbI3-xBrx或锡钙钛矿CH3NH3SnI3-XC1X，其中O彡X彡3，优选地，其厚度为300?lOOOnm，可以采用溶液一步沉积技术(如旋涂法)制备获得;所述的导电封闭层为Pt(其厚度优选为50nm)、Ag(其厚度优选为40nm)或Au层(其厚度优选为40nm)，可以通过真空蒸镀或旋涂法获得;所述的蛋白层为牛血清白蛋白、纤连蛋白或胶原蛋白，可通过物理吸附制备得到。
[0007]其制备方法如下:在洁净的导电基板上采用旋涂法制备钙钛矿层，干燥后在钙钛矿层上制备导电封闭层，将所得样品放入蛋白溶液中浸泡，在导电封闭层上物理吸附获得蛋白层，所述的蛋白溶液为牛血清白蛋白溶液、纤连蛋白溶液、胶原蛋白溶液。所述的蛋白溶液浓度通常为0.5mg/mL-2mg/mLo
[0008]利用上述的钙钛矿复合薄膜器件进行可见光致细胞收割的方法，是以钙钛矿复合薄膜器件作为细胞培养表面接种细胞并进行细胞体外培养，再采用可见光照射该培养表面，细胞及细胞片层即可从上述器件表面脱附。
[0009]所述细胞为在体外模拟生理环境下培养的贴壁细胞，包括成骨细胞、心肌细胞、成纤维细胞、成肌细胞、上皮细胞、内皮细胞及干细胞。
[0010]上述方法具体包括以下步骤:
[0011 ] a.在进行体外细胞培养前，将所述的钙钛矿复合薄膜器件以紫外光照或蒸气消毒方式消毒；
[0012]b.将上述器件作为体外细胞培养表面，在其表面以2 X 14?2 X 16个/cm2的密度种植细胞，加入细胞培养基，并放入37摄氏度恒温及5% 二氧化碳的细胞培养箱中培养I?14天；
[0013]c.将上述进行细胞培养后的培养表面移入PBS中，以波长为400?800纳米、强度50?300mW/cm2的可见光照射上述器件表面I?30分钟，即可将细胞或细胞片层从器件表面脱附。
[0014]本发明的方法选择在可见光照射下存在光伏效应的钙钛矿复合薄膜器件，其可以高效的吸收可见光并将其转化为电势，在细胞培养过程中将该器件作为细胞培养表面，所培养的细胞在经可见光照射后，表面发生光电转变，使得细胞自发从培养器具表面脱离，实现细胞脱附。
[0015]与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果:
[0016]本发明方法避免了传统酶解法细胞脱附时对细胞功能造成的损伤，具有高效的、低损伤、操作简便并且适用细胞范围广等特点，具有很强的实用性。对于散在的细胞，可使85 %以上的细胞脱附;对于细胞薄层，则可使细胞薄层完整脱附。
【附图说明】
[0017]图1为本发明的钙钛矿复合薄膜器件的结构示意图；
[0018]图2为实施例1中培养细胞在可见光光照前的激光共聚焦图。
[0019]图3为实施例1中培养细胞在可见光光照后的激光共聚焦图。
[0020]图4为光学显微镜获得的细胞片层再迀移图片。
【具体实施方式】
[0021]下面结合实施例和附图来详细说明本发明，但本发明并不仅限于此。
[0022]实施例1
[0023]将含有ITO导电层的玻璃基板依次用洗涤剂水溶液、去离子水、丙酮和异丙醇超声洗涤后，在基底上旋涂法制备CH3NH3PbI3钙钛矿层，其中旋涂参数为4000rpm/40s，干燥后将旋涂后的ITO玻璃基板置于加热台60°C退火处理10分钟，然后用真空蒸镀的方法制备表面Ag层。最后，将制备好的器件放入lmg/mL的牛血清白蛋白溶液中浸泡24h，得到物理吸附的蛋白层。所制备的器件，其I丐钛矿层厚度为300nm，Ag层厚度40nm，开路电压达到0.5V。说明此光敏器件具有明显的光伏效应。并以此基板作为细胞培养表面，进行大鼠骨髓间充质干细胞体外培养，接种密度为2 X 14个/cm2，放入37摄氏度恒温及5%二氧化碳的细胞培养箱中培养I天后，以波长为400?800纳米、强度50mW/cm2的可见光从细胞培养器皿顶部入射，照射20分钟，即可使91%细胞从表面脱离。图2和图3分别为采用激光共聚焦显微镜所观察到的实施例1中培养细胞在可见光照前、后的激光共聚焦显微图。对比图2和图3，可以看出经可见光照射后大量细胞脱离，说明可见光实现单细胞的脱附。
[0024]实施例2
[0025]在实施案例I所述CH3NH3PbI3钙钛矿光敏器件表面进行成骨细胞体外培养，接种密度为I X 15个/cm2，放入37摄氏度恒温及5%二氧化碳的细胞培养箱中培养7天后，细胞形成膜片，以波长为400?800纳米、强度lOOmW/cm2可见光从细胞培养器皿顶部入射，照射10分钟，即可使细胞片层从表面脱离。图4为采用光学显微镜所观察到的实施例2中培养细胞片层在可见光照后脱附再培养2天后的迀移图片。可以看出经可见光脱附后的细胞片层重新再培养后，能够很好的爬出新的细胞，并保持良好的细胞形态及活力，说明可见光脱附的细胞片层保持了良好的再迀移性能，这在组织工程中细胞片层的再应用是很关键的。
[0026]实施例3
[0027]将含有FTO导电层的玻璃基板依次用洗涤剂水溶液、去离子水、丙酮和异丙醇超声洗涤后，在基底上旋涂法制备CH3NH3PbI2Br钙钛矿层，其中旋涂参数为4000rpm/40s，干燥后将旋涂后的FTO玻璃基板置于加热台60°C退火处理10分钟，然后用真空蒸镀的方法制备表面Au层。最后，将制备好的器件放入lmg/mL的纤连蛋白溶液中浸泡24h，得到物理吸附的蛋白层。所制备的器件，其I丐钛矿层厚度为500nm，Au层厚度为40nm，开路电压达到0.45V。说明此光敏器件具有明显的光伏效应。并以此基板作为细胞培养表面。进行成纤维细胞体外培养，接种密度为5 X 14个/cm2，放入37摄氏度恒温及5%二氧化碳的细胞培养箱中培养I天后，以波长为400?800纳米、强度lOOmW/cm2的可见光从细胞培养器皿顶部入射，照射10分钟，即可使94 %细胞从表面脱离。
[0028]实施例4
[0029]在实施案例3所述CH3NH3PbI2Br钙钛矿光敏器件表面进行成纤维细胞体外培养，接种密度为5X 15个/cm2，放入37摄氏度恒温及5%二氧化碳的细胞培养箱中培养3天后，细胞形成膜片，以波长为400?800纳米、强度200mW/cm2可见光从细胞培养器皿顶部入射，照射8分钟，即可使细胞片层从表面脱离。
[0030]实施例5
[0031]将钽基板依次用洗涤剂水溶液、去离子水、丙酮和异丙醇超声洗涤后，在基底上旋涂法制备CH3NH3PbBr3钙钛矿层，其中旋涂参数为4000rpm/40s，干燥后将旋涂后的钽基板置于加热台60°C退火处理10分钟，然后用真空蒸镀的方法制备表面Pt层。最后，将制备好的器件放入lmg/mL的胶原蛋白溶液中浸泡24h，得到物理吸附的蛋白层。所制备的器件，其钙钛矿层厚度为1000nm，Pt层厚度为50nm，开路电压达到0.52V。说明此光敏器件具有明显的光伏效应。并以此基板作为细胞培养表面。进行心肌细胞体外培养，接种密度为6X 14个/cm2，放入37摄氏度恒温及5% 二氧化碳的细胞培养箱中培养I天后，以波长为400?800纳米、强度50mW/cm2的可见光从细胞培养器皿顶部入射，照射30分钟，即可使86%细胞从表面脱离。
[0032]实施例6
[0033]在实施案例5所述CH3NH3PbBr3钙钛矿光敏器件表面进行心肌细胞体外培养，接种密度为2X 15个/cm2，放入37摄氏度恒温及5%二氧化碳的细胞培养箱中培养7天后，细胞形成膜片，以波长为400?800纳米、强度50mW/cm2可见光从细胞培养器皿顶部入射，照射30分钟，即可使细胞片层从表面脱离。
[0034]实施例7
[0035]将医用金属钛基板依次用洗涤剂水溶液、去离子水、丙酮和异丙醇超声洗涤后，在基底上旋涂法制备CH3NH3SnI3钙钛矿层，其中旋涂参数为3000rpm/45s，干燥后将旋涂后的医用金属钛基板置于加热台100°C退火处理20分钟，然后用真空蒸镀的方法制备表面Pt层。最后，将制备好的器件放入2mg/mL的牛血清白蛋白溶液中浸泡12h，得到物理吸附的蛋白层。所制备的器件，其钙钛矿层厚度为500nm，Pt层厚度为50nm，并以此基板作为细胞培养表面。进行成肌细胞体外培养，接种密度为2 X 16个/cm2，放入37摄氏度恒温及5 % 二氧化碳的细胞培养箱中培养5天后，以波长为400?800纳米、强度150mW/cm2的可见光从细胞培养器皿顶部入射，照射8分钟，即可获得完整的细胞片层。
[0036]实施例8
[0037]在实施案例7所述CH3NH3SnI3钙钛矿光敏器件表面进行成肌细胞体外培养，接种密度为4X 14个/cm2，放入37摄氏度恒温及5%二氧化碳的细胞培养箱中培养I天后，以波长为400?800纳米、强度80mW/cm2可见光从细胞培养器皿顶部入射，照射25分钟，即可使91 %细胞从表面脱离。
[0038]实施例9
[0039]将医用金属钛基板依次用洗涤剂水溶液、去离子水、丙酮和异丙醇超声洗涤后，在基底上旋涂法制备CH3NH3SnI2Cl钙钛矿层，其中旋涂参数为3000rpm/45s，干燥后将旋涂后的医用金属钛基板置于加热台100°C退火处理20分钟，然后用真空蒸镀的方法制备表面Au层。最后，将制备好的器件放入2mg/mL的胶原蛋白溶液中浸泡12h，得到物理吸附的蛋白层。所制备的器件，其钙钛矿层厚度为300nm，Au层厚度为40nm。并以此基板作为细胞培养表面。进行上皮细胞体外培养，接种密度为5 X 15个/cm2，放入37摄氏度恒温及5 % 二氧化碳的细胞培养箱中培养3天后，细胞形成膜片，以波长为400?800纳米、强度80mW/cm2的可见光从细胞培养器皿顶部入射，照射5分钟，即可获得完整的细胞片层。
[0040]实施例10
[0041]在实施案例7所述CH3NH3SnI2Cl钙钛矿光敏器件表面进行上皮细胞体外培养，接种密度为5X 14个/cm2，放入37摄氏度恒温及5%二氧化碳的细胞培养箱中培养I天后，以波长为400?800纳米、强度180mW/cm2可见光从细胞培养器皿顶部入射，照射I分钟，即可使90%细胞从表面脱离。
[0042]实施例11
[0043]将医用金属钛基板依次用洗涤剂水溶液、去离子水、丙酮和异丙醇超声洗涤后，在基底上旋涂法制备CH3NH3SnCl3钙钛矿层，其中旋涂参数为3000rpm/45s，干燥后将旋涂后的医用金属钛基板置于加热台100°C退火处理20分钟，然后用真空蒸镀的方法制备表面Ag层。最后，将制备好的器件放入0.5mg/mL的牛血清白蛋白溶液中浸泡36h，得到物理吸附的蛋白层。所制备的器件，其钙钛矿层厚度为500nm，Ag层厚度为40nm。并以此基板作为细胞培养表面。进行内皮细胞体外培养，接种密度为2 X 15个/cm2，放入37摄氏度恒温及5 % 二氧化碳的细胞培养箱中培养3天后，细胞形成膜片，以波长为400?800纳米、强度10mW/cm2的可见光从细胞培养器皿顶部入射，照射15分钟，即可获得完整的细胞片层。
[0044]实施例12
[0045]在实施案例7所述CH3NH3SnCl3钙钛矿光敏器件表面进行内皮细胞体外培养，接种密度为6X 14个/cm2，放入37摄氏度恒温及5%二氧化碳的细胞培养箱中培养I天后，以波长为400?800纳米、强度100mW/cm2可见光从细胞培养器皿顶部入射，照射30分钟，即可使98%细胞从表面脱离。
【主权项】
1.一种用于可见光致细胞收割的钙钛矿复合薄膜器件，其特征在于，所述的钙钛矿复合薄膜器件自下而上依次包括导电基板、钙钛矿层、导电封闭层及蛋白层，所述的导电基板为导电玻璃、钽片或医用金属钛片;所述的钙钛矿层为铅钙钛矿CH3NH3PbIhBrx或锡钙钛矿CH3NH3SnI3-XC1X，其中O彡X彡3;所述的导电封闭层为Pt、Ag或Au层，所述的蛋白层为牛血清白蛋白、纤连蛋白或胶原蛋白层。2.根据权利要求1所述的用于可见光致细胞收割的钙钛矿复合薄膜器件，其特征在于，所述的钙钛矿层的厚度为300?100nm03.如权利要求1所述的用于可见光致细胞收割的钙钛矿复合薄膜器件，其特征在于，所述的导电封闭层为Pt，其膜层厚度为50nm。4.如权利要求1所述的用于可见光致细胞收割的钙钛矿复合薄膜器件，其特征在于，所述的导电封闭层为Ag，其膜层厚度为40nm。5.如权利要求1所述的用于可见光致细胞收割的钙钛矿复合薄膜器件，其特征在于，所述的导电封闭层为Au，其膜层厚度为40nm。6.如权利要求1-5任一项所述的用于可见光致细胞收割的钙钛矿复合薄膜器件的制备方法，其特征在于，包括如下步骤: 在洁净的导电基板上采用旋涂法制备钙钛矿层，干燥后在钙钛矿层上制备导电封闭层，将所得样品放入蛋白溶液中浸泡，在导电封闭层上物理吸附获得蛋白层，所述的蛋白溶液为牛血清白蛋白溶液、纤连蛋白溶液、胶原蛋白溶液。7.如权利要求6所述的钙钛矿复合薄膜器件的制备方法，其特征在于，所述的蛋白溶液浓度为0.5mg/mL-2mg/mL。8.将如权利要求1-5任一项所述的钙钛矿复合薄膜器件用于可见光致细胞收割的方法，其特征在于，以钙钛矿复合薄膜器件作为细胞培养表面接种细胞并进行细胞体外培养，再采用可见光照射该培养表面，细胞及细胞片层即可从上述器件表面脱附。9.如权利要求8所述的利用钙钛矿复合薄膜器件进行可见光致细胞收割的方法，其特征在于，所述的细胞为成骨细胞、心肌细胞、成纤维细胞、成肌细胞、上皮细胞、内皮细胞或干细胞。10.如权利要求8所述的利用钙钛矿复合薄膜器件进行可见光致细胞收割的方法，其特征在于，该方法具体包括以下步骤: a.在进行体外细胞培养前，将所述的钙钛矿复合薄膜器件以紫外光照或蒸气消毒方式消毒； b.将上述器件作为体外细胞培养表面，在其表面以2X 14?2 X 16个/cm2的密度种植细胞，加入细胞培养基，并放入37摄氏度恒温及5 % 二氧化碳的细胞培养箱中培养I?14天； c.将上述进行细胞培养后的培养表面移入PBS中，以波长为400?800纳米、强度50?300mW/cm2的可见光照射上述器件表面I?30分钟，即可将细胞或细胞片层从器件表面脱附。
【文档编号】C12N5/071GK106047692SQ201610428480
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月16日
【发明人】程逵, 王小召, 翁文剑
【申请人】浙江大学