自动完成目标单细胞获取，能够处理极少数目细胞的样 本，能够实现极低的靶细胞损失率，能够实现自动化操作，同时装置的成本明显低于其他现 有设备。
【附图说明】
[0030] 图1是本实用新型所述单细胞自动化获取装置一【具体实施方式】的结构示意图；
[0031] 图2是本实用新型所述单细胞定位微孔膜一【具体实施方式】的结构示意图；
[0032] 图3是本实用新型所述多孔膜和滤膜一【具体实施方式】的结构示意图；
[0033]图4a和图4b是本实用新型所述单细胞定位微孔膜工作过程显微镜图；
[0034]图5a和图5b是本实用新型所述单细胞定位微孔膜获取目标细胞的过程示意图。 [0035]图中所示：1_支架，21-第三平台，22-破膜针，31-第一平台，32-384孔板，41-第二 平台，42-单细胞定位微孔膜，421-多孔膜，422-滤膜，423-通孔，424-微孔，5-显微镜，6-目 标细胞。
【具体实施方式】
[0036]下面结合具体实施例，进一步阐述本实用新型。应理解，这些实施例仅用于说明本 实用新型而不用于限制本实用新型的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通 常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0037]实施例1单细胞自动化获取装置
[0038] 如图1所示，所述单细胞自动化获取装置包括支架1、设置在支架1上的破膜机构、 位于所述破膜机构2下方的第一平台31和设置在所述破膜机构、所述第一平台31之间的第 二平台41和显微镜5，所述破膜机构2包括第三平台21和固定在第三平台21上破膜针22，所 述第一平台31上设置容器-384孔板32，所述第二平台41上设置单细胞定位微孔膜42。
[0039] 所述第一平台31在电机驱动下可沿X向和Y向运动，行程为10cm，精度为5μπι，所述 第二平台41在电机驱动下可沿X向和Υ向运动，行程为10cm，精度为Ιμπι，所述第三平台21在 电机驱动下可沿Ζ向运动，行程为5cm，精度为5μηι。
[0040] 如图2和3所示，上述单细胞定位微孔膜42包括两层，一层为多孔膜421，另一层为 滤膜422,所述孔膜421上开设有阵列分布的约10000个通孔423,所述通孔423内滤膜422设 有一个微孔424,所述通孔423直径为70μπι，深度为50μπι，所述滤膜422的厚度为Ιμπι，所述微 孔424直径为5μπι。
[0041] 所述多孔膜421的材质为硅，所述滤膜422的材质为氮化硅。
[0042] 实施例2应用试验-单细胞回收与测序实验
[0043] 将100个非小细胞肺癌细胞Η1975用染料Vybrant DiI(Life Tehnologies)染色后 与1000个未染色的白细胞混合并用磷酸盐缓冲液稀释至1毫升，制成样品细胞悬液，采用实 施例1的单细胞自动化获取装置捕获其中目标细胞6即H1975细胞，以此样品阐述其工作原 理和过程。
[0044] 将样品细胞悬液施于所述单细胞定位微孔膜42上，由于重力液体流出而细胞被截 留在微孔424上。由于细胞悬液中细胞的数目远小于通孔423的数目，根据泊松分布可知，如 图4a所示，在每个通孔423内的基本都是单个细胞，细胞位于微孔424上，用荧光显微镜可以 识别并记录H1975细胞的位置。如图5a所示，电机驱动所述第二平台41做水平运动，将H1975 细胞所处的通孔423置于所述破膜针22的正下方，其中破膜针22对准了靠近通孔423边缘的 位置，同时电机驱动所述第一平台31，将希望获取目标细胞6的孔移至破膜针22正下方，对 准单细胞定位微孔膜42上H1975细胞所在的通孔423处。然后，如图5b所示，电机驱动所述第 三平台21沿Z向向下运动，固定在第三平台21上的破膜针22冲击多孔膜421底部的具有机械 脆性的滤膜422,使其碎裂，滤膜422和其上的目标细胞6-起落入下方的384孔板32的孔中， 从而实现单细胞回收，此时如图4b所示，单细胞定位微孔膜42的通孔423处已无滤膜422和 目标细胞6。
[0045] 循环操作以上步骤，可将单细胞定位微孔膜42上截获的各种类型单细胞回收人 384孔板的各个可寻址的孔内，然后分别进行后续处理检测和分析。
[0046]为证实该方法的可行性，对回收的目标细胞6进行如下后续处理。
[0047] 384孔板的孔中事先添加了4微升磷酸缓冲液。然后采用REPLI-g Single Cell Kit(Qiagen，USA)试剂盒将目标细胞6裂解与全基因组进行放大。具体步骤为，在含有目标 细胞6的孔中加入3微升变性液65 °C高温孵育10分钟后，加入3微升终止缓冲液终止变性。然 后，依次加入29微升反应液、2微升phi 29DNA聚合酶，并补水至体积50微升，30度反应8小时， 最后65°C高温继续反应3分钟使酶失活，终止整个放大过程。酚氯仿乙醇沉淀进行提纯后用 于后续的目的基因扩增。
[0048] 我们检测EGFR基因20外显子中的L858R突变以及21外显子中的T790M突变，选择退 火温度59°C，30个循环。实验结果显示，所回收的目标细胞6成功扩增出EGFR基因的20、21外 显子，并通过Sanger测序检测到目标细胞6具有L858R和T790M突变，从而证明了该技术的可 行性。
【主权项】
1. 一种单细胞定位微孔膜，其特征在于，包括开设有若干通孔的多孔膜和覆盖所述通 孔的滤膜，所述通孔内滤膜上设有至少一个微孔，所述微孔直径为3-8μπι，所述滤膜的厚度 为0·5-2μηι 〇2. 根据权利要求1所述一种单细胞定位微孔膜，其特征在于，所述多孔膜的材质为硅， 所述滤膜的材质为氮化硅。3. 根据权利要求1所述一种单细胞定位微孔膜，其特征在于，所述多孔膜上通孔呈阵列 分布，数量为10000-100000个。4. 根据权利要求1所述一种单细胞定位微孔膜，其特征在于，所述多孔膜上的通孔直径 为 20-100μηι。5. -种单细胞自动化获取装置，其特征在于，包括支架、设置在支架上的破膜机构、位 于所述破膜机构下方的第一平台和设置在所述破膜机构和所述第一平台之间的第二平台， 所述第一平台和第二平台在ΧΥ向平面平移，所述破膜机构在Ζ向竖直运动，所述第一平台上 设置容器，所述第二平台上设置权利要求1-4任一所述单细胞定位微孔膜。6. 根据权利要求5所述一种单细胞自动化获取装置，其特征在于，所述容器为微孔板。7. 根据权利要求5所述一种单细胞自动化获取装置，其特征在于，所述破膜机构的运动 精度为〇 · 1-1〇μπι，所述第二平台的运动精度为0 · 1_5μπι，所述第一平台的运动精度为0 · 1-10 μηι〇8. 根据权利要求5所述一种单细胞自动化获取装置，其特征在于，所述单细胞自动化获 取装置还包括显微镜。9. 根据权利要求5所述一种单细胞自动化获取装置，其特征在于，所述破膜机构包括第 三平台和固定在第三平台上破膜针，所述第三平台沿Ζ向运动。
【专利摘要】本实用新型涉及单细胞定位微孔膜和单细胞自动化获取装置。所述单细胞定位微孔膜，包括开设有若干通孔的多孔膜和覆盖所述通孔的滤膜，所述通孔内滤膜上设有至少一个微孔。所述单细胞自动化获取装置，包括支架、设置在支架上的破膜机构、位于所述破膜机构下方的第一平台和设置在所述破膜机构和所述第一平台之间的第二平台，所述第一平台和第二平台在XY向平面平移，所述破膜机构在Z向竖直运动，所述第一平台上设置容器，所述第二平台上设置上述单细胞定位微孔膜。本实用新型提供的技术方案可准确、可靠、自动完成目标单细胞获取，处理极少数目细胞的样本，实现极低损失率，能够实现自动化操作，同时装置的成本明显低于其他现有设备。
【IPC分类】B01D69/02, B01D71/02, C12M1/00, C12M1/12
【公开号】CN205368351
【申请号】CN201521103903
【发明人】阎灼辉
【申请人】苏州浚惠生物科技有限公司
【公开日】2016年7月6日
【申请日】2015年12月28日