专利名称：一种新型含香豆素荧光基团透明质酸衍生物的制备方法
技术领域：
本发明涉及于制备一种新型含香豆素透明质酸衍生物的方法，属于生物化学技术 领域。
背景技术：
透明质酸(hyaluronic acid，hyaluronan，HA)又名透明酸或玻璃酸是一种酸性黏 多糖，最早是由美国 Meyer (Meyer K, Palmer J W. The polysaccharide of the vitreous humor [J]. J. Biol. Chem. 1934，107 :629_634.)等从牛眼玻璃体中分离出来。HA是由 β-D-N-乙酰氨基葡萄糖和β-D-葡萄糖醛酸为结构单元的以β-1，3和β-1，4-糖苷链 交替连接而成的一种直链线型阴离子粘多糖。对不同组织来源的HA进行的结构测定表 明，其结构均一致，没有种属差异，只存在相对分子量的不同，范围为IO5-IO7,双糖单位数为 300-1100对。其结构如结构式1所示
<formula>formula see original document page 3</formula>结构式1HA广泛存在于动物和人体结缔组织细胞间质中，在眼玻璃体、皮肤、脐带、软骨和 关节滑液中含量较高。HA因其高度的黏弹性、独特的保湿性、优良的生物相容性和可降解 性，已被广泛应用于临床医学和高级化妆品。在医学领域，HA被广泛应用于关节疾病、眼科 手术、预防术后粘连、治疗烫伤以及作为药物传递系统的媒介和药用辅料等。透明质酸及其 衍生物作为药物载体，主要利用其良好的生物相容性和可降解性、高粘弹性以及与细胞表 面特异受体专一性结合的能力，以达到药物增稠、药物缓释、促进药物透皮能力及靶向性的 目的(李奇，王凤山等.中国药学杂志，2005，40 (7) :485-488)。天然HA具有诸多有点，但是对强酸、强碱、热、自由基及透明质酸酶敏感(Lapcik LJr, Lapcik L，De Smedt S, et al. Chemical Reviews, 1998,98(8) :2663_2684)，容易发生 降解，而限制其作为药物载体的应用。同时，透明质酸作为药物载体，因为透明质酸作为天 然高分子在滑液中大量存在，作为药物载体的透明质酸在人体中传输机理与人体滑液中存 在的天然透明质酸之间由于一定的相似性，很难区分，为了克服这些缺点，在保留透明质酸 优良特性的前提下，有必要通过化学改性以提高其稳定性及其他性能，同时对透明质酸的 活性部分进行适当的修饰，引入具有药物活性或非活性无毒的荧光基团，并利用荧光光谱 等分析技术研究透明质酸荧光衍生物对药物的包覆作用和药物释放作用及作为药物载体 的透明质酸荧光衍生物在模拟体液中的稳定性。透明质酸可进行化学修饰的4个部位分别为羟基、N-乙酰基、羧基以及还原 末端(胡帼颖，顾汉卿.透明质酸交联、酯化衍生物的制备及医学应用进展[J].透析与人工器官，2003，14(3) :30-46.)，其中末端修饰较少见。主要修饰方法有酯化、醚化(P. Mlcochova, V. Hajkova, B.Steiner. Preparation and characterization of biodegradable alkylether derivatives ofhyaluronan[J]. Carbohydrate Polymers, 2007,69 :344-352.)、交联、接枝等。经过改性后形成的HA衍生物，可赋予新的特性。对于我们提出的含香豆素透明质酸衍生物的合成未见文献报道。
发明内容
本发明采用医用透明质酸钠(Mw 2. OX IO6)和具有荧光性质的香豆素衍生物反 应，对透明质酸钠的羟基部位进行化学改性，以便赋予透明质酸荧光性能，根据不同的反应 时间和不同的反应温度制备出不同取代度的香豆素透明质酸衍生物，为下一阶段荧光示踪 法研究动物体内药物传输机理研究提供实验基础。本发明所解决的关键问题是提供制备含香豆素荧光基团透明质酸衍生物的方法。本发明的合成路线图如下反应式1所示
H。成 J 一。广滅^
123
QH3
R: H or -^^γ^ο'^^ο'^ο) OH反应式1为解决上述技术问题，所采用的具体方案如下首先以7-羟基-4-甲基香豆素为原料经过醚化反应得到环氧丙烷取代的香豆素， 然后将其再与透明质酸钠通过醚化反应制备出含有香豆素单元的透明质酸衍生物；其中所 述7-羟基-4-甲基香豆素与环氧丙烷的摩尔比为1 12. 75 ；透明质酸钠和香豆素衍生物 的摩尔配比为1 3-1 20;反应后的混合液装入透析袋内，透析时间为72h，然后用无水 乙醇沉析、冷冻干燥得到目标产物；其中所述的透明质酸钠，具有2，800, OOODa的平均分子 量其中所述的反应体系的pH为8-12 ；其中所述所用的溶剂为二甲亚砜和水的混合溶剂，且二甲亚砜和水的体积比为 4:1;其中所述反应温度30°C _40°C，反应时间为20h_50h，优选反应时间均为40h。本发明的有益效果是通过将香豆素荧光基团引入到难以检测的透明质酸上，在 保留透明质酸的天然结构的同时，又赋予其荧光性能，为透明质酸在动物或人体内相应的 药物代谢和药理等多方面的研究提供了实验基础。
其中图1为透明质酸Na-HA的1H匪R(500MHz，D20)谱图；图2为40°C透明质酸香 豆素衍生物3的1H NMR (500MHz, D2O)谱。
具体实施例方式本发明以4-甲基-7-羟基香豆素1为起始原料经过醚化反应先生成7-甲氧 基-4-甲基香豆素-1，2-环氧丙烷2，然后将其与透明质酸钠(Mw 2. 8 X IO6)经过醚化反 应，制备含有香豆素结构单元的透明质酸衍生物3。纯化后含环氧结构的香豆素2的1H 匪R(DMS0-d6)为δ 7. 71(d，J = 8. 8Hz，1H, Ar-H), 7. 02 (s, 1Η, Ar-H), 7. 01 (d, J = 8. 8Ηζ, 1Η, Ar-H) ,6. 22 (s, 1Η, CH)，4. 48 (dd，J = 10. 0，2. 5Hz，1Η，ArOCH2), 3. 96 (dd, J = 10.0， 5. OHz, 1Η, ArOCH2)，3. 37 (s, 1Η, 0CH)，2. 86-2. 88 (m, 1Η, OCH2)，2. 73-2. 74 (m, 1Η, OCH2)， 2. 40(s，3H，CH3)。我们同时做了透明质酸的1H NMR(D2O-Cl6)如图1。这样我们可以通过最终 透明质酸产物1H NMR中2. Oppm处乙酰胺上的甲基与所含香豆素结构单元2. 45ppm处甲基 的积分比计算出产物3中每个透明质酸结构单元中香豆素基团的取代度。我们考察了不同 温度下制备透明质酸衍生物3的反应情况(见具体实施例)，不同温度下通过将反应液后经 乙醇沉析处理得到产品的1HN MR图可知，在25°C下透明质酸的醚化反应没有发生，在30°C 下有透明质酸香豆素衍生物3生成，但在低场芳环附近的氢质子的积分为负值，可能是由 于产物中香豆素取代度太少造成的；在35°C下生成的透明质酸衍生物香豆素单元的取代 度约为3. 9% ；而在40°C下生成的透明质酸衍生物香豆素单元的取代度为5. 2% (图2)。香豆素衍生物2的合成方法将3. 5g(20mmol)羟甲基香豆素置于装有空气冷凝管、恒压滴液漏斗和温度计的 250mL的三口瓶中，加入IOOmL无水乙醇和5mL水溶解的1. 4g(25mmol)KOH的水溶液，搅拌 30min.。向该体系中滴加20mL环氧氯丙烷(255mmol)，滴加完毕后，将体系升温到60°C， 反应 3h(详细参考 Y L Chen, C M Lu, S J Lee, et al. Synthesis, antiproliferative, andvasorelaxing evaluations of coumarin α -methylene-y-butyrolactones[J]. BioorRanic & MedicinalChemistry，2005，20 (13) :5710_5716.)。将反应液倒入 IOOOmL 烧 杯中，往烧杯中不断加入水直至不再析出白色沉淀为止。过滤收集滤饼，然后用无水乙醇重 结晶得白色固体4-甲基-7-(2，3-环氧丙氧基)香豆素2.62g，产率为56%。实施例125mL圆底烧瓶中加人0. lg(0. 25mmol)透明质酸钠，然后加入12mL 二甲亚砜和 3mL水，强磁力搅拌使透明质酸钠溶解，逐滴加入0. IM NaOH溶液使混合溶液的pH = 8-12, 然后加入0. 173g(0. 75mmol),4-甲基_7_(2，3-环氧丙氧基)香豆素，反应在30°C反应20h。 将反应混合液装入透析袋内透析72h，透析液用乙醇沉析得白色固体，将固体冷冻真空干燥 后用1H NMR进行表征，通过比较2. Oppm(3H, -NHCOCH3)和2. 45ppm(3H，所引入的香豆素基 团上的-CH3)的信号计算出产物的取代度为1.8%。实施例225mL圆底烧瓶中加人0. lg(0. 25mmol)透明质酸钠，然后加入12mL 二甲亚砜和 3mL水，强磁力搅拌使透明质酸钠溶解，逐滴加入0. IM NaOH溶液使混合溶液的pH = 8-12, 然后加入0. 173g(0. 75mmol)香豆素衍生物2，反应在30°C反应30h。将反应混合液装入透 析袋内透析72h，透析液用乙醇沉析得白色固体，将固体冷冻真空干燥后用1HNMR进行表征， 通过比较2. Oppm(3H, -NHCOCH3)和2. 45ppm(3H，所引入的香豆素基团上的-CH3)的信号计 算出产物的取代度为2.4%。实施例3
25mL圆底烧瓶中加人0. lg(0. 25mmol)透明质酸钠，然后加入12mL 二甲亚砜和 3mL水，强磁力搅拌使透明质酸钠溶解，逐滴加入0. IM NaOH溶液使混合溶液的pH = 8-12, 然后加入0. 173g(0. 75mmol)香豆素衍生物2，反应在30°C反应40h。将反应混合液装入透 析袋内透析72h，透析液用乙醇沉析得白色固体，将固体冷冻真空干燥后用1HNMR进行表征， 通过比较2. Oppm(3H, -NHCOCH3)和2. 45ppm(3H，所引入的香豆素基团上的-CH3)的信号计 算出产物的取代度为3.6%。实施例425mL圆底烧瓶中加人0. Ig(0. 25mmol)透明质酸钠，然后加入12mL 二甲亚砜 和3mL水，强磁力搅拌使透明质酸钠溶解，逐滴加入0. IM NaOH溶液使混合溶液的pH = 8-12，然后加入香豆素衍生物2，反应在30°C反应50h。将反应混合液装入透析袋内透析 72h，透析液用乙醇沉析得白色固体，将固体冷冻真空干燥后用1HNMR进行表征，通过比较 2. Oppm(3H,-NHCOCH3)和2. 45ppm(3H，所引入的香豆素基团上的-CH3)的信号计算出产物的 取代度为3.4%。实施例525mL圆底烧瓶中加人0. Ig(0. 25mmol)透明质酸钠，然后加入12mL 二甲亚砜 和3mL水，强磁力搅拌使透明质酸钠溶解，逐滴加入0. IM NaOH溶液使混合溶液的pH = 8-12，然后加入香豆素衍生物2，反应在35°C反应40h 。将反应混合液装入透析袋内透析 72h，透析液用乙醇沉析得白色固体，将固体冷冻真空干燥后用1H NMR进行表征，通过比较 2. Oppm(3H,-NHCOCH3)和2. 45ppm(3H，所引入的香豆素基团上的-CH3)的信号计算出产物的 取代度为4.7%。实施例625mL圆底烧瓶中加人0. lg(0. 25mmol)透明质酸钠，然后加入12mL 二甲亚砜和 3mL水，强磁力搅拌使透明质酸钠溶解，逐滴加入0. IM NaOH溶液使混合溶液的pH = 8-12, 然后加入0. 173g(0. 75mmol)香豆素衍生物2，反应在40°C反应40h。将反应混合液装入透 析袋内透析72h，透析液用乙醇沉析得白色固体，将固体冷冻真空干燥后用1HNMR进行表征， 通过比较2. Oppm(3H, -NHCOCH3)和2. 45ppm(3H，所引入的香豆素基团上的-CH3)的信号计 算出产物的取代度为5.2%。
权利要求
一种制备新型透明质酸香豆素衍生物的方法，其特征在于首先以7-羟基-4-甲基香豆素为原料经过醚化反应得到环氧丙烷取代的香豆素，然后将其再与透明质酸钠通过醚化反应制备出含有香豆素单元的透明质酸衍生物；其中所述7-羟基-4-甲基香豆素与环氧丙烷的摩尔比为1∶12.75；透明质酸钠和香豆素衍生物的摩尔配比为1∶3-1∶20；其中所述反应温度30℃-40℃，反应时间为20h-50h；其中所述的反应体系的pH为8-12；其中所述所用的溶剂为二甲亚砜和水的混合溶剂，且二甲亚砜和水的体积比为4∶1；反应后的混合液装入透析袋内，透析时间为72h，然后用无水乙醇沉析、冷冻干燥得到目标产物。
2.根据权利要求1所述的一种制备新型透明质酸香豆素衍生物的方法，其特征在于其 中所述的透明质酸钠具有2，800, OOODa的平均分子量。
3.根据权利要求1所述的一种制备新型透明质酸香豆素衍生物的方法，其特征在于其 中所述的反应时间均为40h。
全文摘要
本发明涉及一种新型含香豆素透明质酸衍生物的合成方法，该方法以4-甲基-7-羟基香豆素为起始原料经过醚化反应先生成7-甲氧基-4-甲基香豆素-1，2-环氧丙烷，然后将其与透明质酸钠经过醚化反应，制备含有香豆素结构单元的透明质酸衍生物；反应后的混合液装入透析袋内，透析时间为72h，然后用无水乙醇沉析、冷冻干燥得到目标产物。本发明的有益效果是通过将香豆素荧光基团引入到难以检测的透明质酸上，在保留透明质酸的天然结构的同时，又赋予其荧光性能，为透明质酸在动物或人体内相应的药物代谢和药理等多方面的研究提供了实验基础。
文档编号C09K11/06GK101831006SQ20101018040
公开日2010年9月15日 申请日期2010年5月21日 优先权日2010年5月21日
发明者任振, 孙小强, 席海涛, 缪春宝 申请人:常州大学