含砜基的双光子荧光染料的制作方法
【专利摘要】一类含砜基的双光子荧光染料，具有通式I的结构，如附图1。该类荧光染料在活细胞中非谷胱甘肽区域内具有较低的荧光背景，在活细胞中谷胱甘肽区域内具有较强的荧光信号，且对活细胞内谷胱甘肽具有很强的专一性标记。这类化合物具有一定水平的水溶性，同时具有良好的细胞膜通透性。并且还具有较大的有效的双光子吸收截面。本发明的这类化合物同时还具有较低的生物毒性、光毒性、光漂白性。其光谱范围与生物样品的光谱范围有足够大的差异。
【专利说明】含砜基的双光子荧光染料
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一类含砜基的双光子荧光染料、其制备方法，以及利用该类荧光染料 对肿瘤活细胞或组织中谷胱甘肽的识别及定量检测。
【背景技术】
[0002] 谷胱甘肽（glutathione，GSH)是一种含Y-酰胺键和巯基的三肽，由谷氨酸、半胱 氨酸和甘氨酸结合。存在于几乎身体的每一个细胞。机体新陈代谢产生的过多自由基会损 伤生物膜，侵袭生命大分子，加快机体衰老，并诱发肿瘤或动脉粥样硬化的产生。谷胱甘肽 主要生理作用即作为体内一种重要的抗氧化剂，清除掉人体内的自由基，保护许多蛋白质 和酶等分子中的巯基。此外，细胞内的谷胱甘肽还能帮助保持正常的免疫系统的功能，具有 抗氧化作用和整合解毒作用。所以建立一种简便的、快速的、有效的、灵敏的细胞内谷胱甘 肽检测方法是十分必要的。
[0003] 现有识别及检测谷胱甘肽的方法主要有：酶分析法、DTNB法等。但上述方法在实 际成像应用中存在以下缺陷：对谷胱甘肽的特异选择性、无法实现活体成像等。荧光标记的 光学分子成像的出现为现存的问题提供了一种很好的解决方法。目前，菲啶类（EB、PI)、吖 啶类（A0)、咪唑类（Hoechst、DAPI)和花菁家族类（Cy、T0T0、SYT0)等荧光染料在基因组学 技术、核酸定量检测、血细胞分析等领域中都起到了重要的作用。然而，用于活细胞及组织 内的谷胱甘肽检测和标记的荧光染料与探针还相对较少，且识别和检测性能较差。同时，含 巯基的生物小分子结构和反应活性的相似性，往往使得一般检测谷胱甘肽的荧光染料对半 胱氨酸和高半胱氨酸产生相同或相似的响应。因此，发展高选择性检测谷胱甘肽的荧光传 感器和染料仍然存在巨大挑战。
[0004] 随着显微成像技术的发展，荧光染料在显微成像研宄中已经成为最重要的依附 工具。其中双光子荧光染料与传统的单光子荧光染料相比，双光子荧光染料具有显著 优势：近红外激发、暗场成像、避免荧光漂白和光致毒、定靶激发、高横向分辨率与纵向 分辨率、降低生物组织吸光系数及降低组织自发荧光干扰等（Nature，1999,2:989-996 ; Science, 1997,275:530.AngewandteChemieInternationalEdition, 2001,40:2098.)，因 此双光子荧光染料为生物显微成像提供了一个崭新的平台。而对细胞内的谷胱甘肽的标记 成像、其活体内分布成像以及组织深度成像的专一性双光子荧光染料还相对较少，开发专 一性好的标记肿瘤的双光子荧光探针是实现双光子肿瘤成像的关键。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的，首先在于提供一类含砜基的双光子荧光染料，所述染料具有通式I 的结构（附图1):
[0006]
[0007] 通式I中：
【权利要求】
1. 含砜基的双光子荧光染料，具有通式I的结构：
通式I中： 所述的R1选自：
所述的R2选自：
所述的R3选自：
所述的L1、LjPL3各自独立地选自：Cn烧基、-O(CH2) n-、- (CH2)n0-、-O(CH2)n0-、-NH(CH2) n-、- (CH2)nNH-、-NH(CH2)nNH-、-N(CH3) (CH2) n-、- (CH2)nN(CH3)-、-N(CH3) (CH2)nN(CH3)-，其中 n是1-8的整数。
2. 权利要求1所述的含砜基的双光子荧光染料，其特征在于：所述的Ri选自：
3. 权利要求1所述的含砜基的双光子荧光染料，其特征在于：所述的R2为：
4. 权利要求1所述的含砜基的双光子荧光染料，其特征在于：所述的LJPL2各自独立 选自-0 (CH2)n0-、-NH(CH2)nNH-、-N(CH3) (CH2)n-或-N(CH3) (CH2)nN(CH3)。
5. 权利要求1所述的含砜基的双光子荧光染料，其特征在于：所述的L3选自-(CH2) n-、-(CHCH3)n-或-(CH3CCH3)η-ο
6. 权利悪龙I所沭的含砸,某的^/光子w光塾料·洗白ik合物A,-A"，
7. 权利要求1所述的含砜基的双光子荧光染料的制备方法，包括如下步骤： 1. R3-Br与H-L3-H按摩尔比1:1-1: 5反应，制备化合物R3-L3-H; 反应温度为60-KKTC，反应时间为1-14小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙 酮、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物； 2. HO-R1-Br与R3-L3-H按摩尔比 1:1-1:3 反应，制备化合物R3-L3-R1-Br; 反应温度为60-160°C，反应时间为1-14小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙 酮、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物； 3) 将步骤2)中制备得到的化合物R3-L3-R1-Br与H-L1-H按照摩尔比1:1-1:5反应，制 备化合物RfL3-R1-L1-H: 反应温度为60-175?，反应时间为1-10小时，反应溶剂为乙醇、乙二醇单甲醚或其混 合物； 4. R2-OH与H-L2-H按照摩尔比1:1-1:5反应，制备化合物R2-L2-H: 反应温度为25-KKTC，反应时间为1-7小时，反应溶剂为乙醇、乙腈、丙酮或其混合物； 5) 使化合物R3-L3-R1-L1-IR2-L2-H与二氯亚砜按照摩尔比1:1:1-1:1:5反应，制备化 合物I:
反应温度为-15°C?25°C，反应时间为0. 2-3.O小时，反应溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、 丙酮、N，N-二甲基甲酰胺或其混合物。
8. 权利要求1-6中任一权利要求所述的含砜基的双光子荧光染料在生物检测与标记 中的应用。
9. 权利要求8所述的含砜基的双光子荧光染料在生物检测与标记中的应用，其特征在 于所述的生物检测与标记目标物为谷胱甘肽。
【文档编号】C09B57/08GK104448899SQ201410664580
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年11月20日 优先权日:2014年11月20日
【发明者】仉华, 王彩霞, 王魁, 蒋涛, 王歌, 蒋凯 申请人:河南师范大学