硼酸衍生物功能化荧光探针在检测5‑羟甲基胞嘧啶中的应用的制作方法

本发明属于DNA中5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)的检测技术领域，具体涉及一种可特异性识别顺式二羟基结构的2-(4-二羟基硼烷)苯基-4-羧基喹啉(PBAQA)功能化荧光复合物传感材料(PBAQA-P_GMA)在检测DNA链中5hmC的应用。

背景技术：

5-甲基胞嘧啶(5mC)在调控基因表达、基因组印记和X染色体失活中起着至关重要的作用。近来发现，5mC在TET(ten eleven translocation)家族双加氧酶Fe²⁺/α-酮戊二酸的催化作用下可以被氧化为5hmC。5hmC作为一种1952年被发现至2009年才被再次发现进而得到广泛研究的新型胞嘧啶变异体，目前已经被公认为是继5mC之后的第六种碱基。该碱基在生物生理学过程中有着至关重要的作用。研究证明，5hmC是DNA去甲基化过程的重要中间产物，它可能是一种可以独立存在较稳定的表观遗传修饰。研究还发现，在一些癌症诸如肺癌、脑癌、肝癌、肾癌、皮肤癌、前列腺癌中5hmC的含量明显下降，证明其在癌症发展过程中扮演者重要的角色。除此之外，5hmC在亨廷顿舞蹈症、骨髓增生异常综合症、阿尔兹海默症这些疾病中的分布也表现出异常。这些发现均预示5hmC将可能成为一种疾病诊断、处理和治疗的新兴生物学标志。

目前很多特定的技术已经被用于检测组织中的5hmC，包括薄层色谱法、高效液相色谱串联二级质谱法、同位素标记法、抗原抗体酶联免疫技术等，但这些方法存在一些无法克服的缺点，比如需要用到放射性元素，无论是对人体还是环境都有害，检测仪器昂贵，操作繁琐等。基于此逐渐出现了光谱法检测5hmC，如：将5hmC中的羟甲基氧化为醛基，通过醛基将一些荧光基团标记到DNA链上进行荧光检测；氧化后通过荧光共振能量转移法进行荧光检测；通过糖基化反应将含有叠氮基团的糖基转移到5hmC DNA链上，通过生物素标记、链霉亲和素标记法进行荧光标记等。但这些荧光方法需要至少两步提纯过程，从而增大了DNA的损失率，而且操作过程繁琐，有些难以避免背景因素干扰。

公开号为CN 104483295A的发明专利申请公开了一种基于硼酸衍生物功能化荧光探针检测糖蛋白等二醇类物质的方法，该方法操作简单，检测灵敏度高。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题在于为硼酸衍生物功能化荧光探针提供一种新的应用。

解决上述技术问题所采用的技术方案是：硼酸衍生物功能化荧光探针在检测5-羟甲基胞嘧啶中的应用，所述硼酸衍生物功能化荧光探针是表面固载2-(4-二羟基硼烷)苯基-4-羧基喹啉的聚甲基丙烯酸环氧丙酯纳米微球，其中聚甲基丙烯酸环氧丙酯纳米微球的粒径为150～400nm。

上述硼酸衍生物功能化荧光探针的制备方法为：将聚甲基丙烯酸环氧丙酯纳米微球(P_GMA)溶解于蒸馏水中，并加入过量乙二胺，在氮气保护下，80℃反应完全后，离心、洗涤、干燥，得到氨基功能化的P_GMA；将氨基功能化的P_GMA分散于无水乙醇中，并依次加入2-(4-二羟基硼烷)苯基-4-羧基喹啉(PBAQA)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，其中氨基功能化的P_GMA与PBAQA、EDC、NHS的摩尔量比为4:4:9:9，超声分散均匀，40℃反应完全后，离心分离，产物依次用超纯水、无水乙醇和乙腈洗涤，自然干燥，得到表面固载2-(4-二羟基硼烷)苯基-4-羧基喹啉的聚甲基丙烯酸环氧丙酯纳米微球(PBAQA-P_GMA)，即硼酸衍生物功能化荧光探针。

上述的硼酸衍生物功能化荧光探针在检测5-羟甲基胞嘧啶中的应用，具体检测方法由下述步骤组成：

1、将5-羟甲基化胞嘧啶DNA标准样品与尿苷二磷酸葡萄糖在T4β-葡萄糖基转移酶的催化作用下，25～37℃反应1～2小时，分离提纯产物，得到5-糖基化胞嘧啶DNA。

2、将硼酸衍生物功能化荧光探针与5-糖基化胞嘧啶DNA加入pH＝7.4的磷酸缓冲液中，室温震荡反应，用荧光光谱仪测量不同浓度5-糖基化胞嘧啶DNA对应体系的荧光强度，绘制F-F₀值随5-糖基化胞嘧啶DNA浓度变化的标准曲线。

3、按照步骤2的方法用荧光光谱仪测量待测DNA样品的荧光强度，根据待测DNA样品的F-F₀值，结合标准曲线的线性方程即可高选择性识别5-羟甲基胞嘧啶DNA并确定待测DNA样品中5-羟甲基胞嘧啶的含量。

上述步骤2中，优选磷酸缓冲液中硼酸衍生物功能化荧光探针的初始浓度为0.2～1mg/mL。

本发明将PBAQA通过EDC/NHS接枝到氨基功能化的P_GMA表面，从而得到兼具荧光性质和特异性识别二醇物质的硼酸衍生物功能化荧光探针，该荧光探针能够特异性吸附糖基化后的5-羟甲基胞嘧啶，既解决了DNA序列中胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶由于结构相似难以区分检测的问题，又为光谱法检测5-羟甲基胞嘧啶提供了新方法，且该方法简单、快速、灵敏度高，克服了已有方法测量仪器复杂、昂贵、操作繁琐等弊端，同时与其他一些检测方法相比还可以实现对5-糖基化胞嘧啶的富集，降低检出限，使5-糖基化胞嘧啶的检出限降低至0.16nmol/L。

附图说明

图1是正常DNA的MALDI-TOF MS图。

图2是5-羟甲基胞嘧啶DNA的MALDI-TOF MS图。

图3是糖基化处理的正常DNA的MALDI-TOF MS图。

图4是5-糖基化胞嘧啶DNA的MALDI-TOF MS图。

图5是荧光强度随5-糖基化胞嘧啶DNA浓度变化的荧光光谱图。

图6是F-F₀值随5-糖基化胞嘧啶DNA浓度变化的标准曲线。

图7是PBAQA-P_GMA对糖基化的5-羟甲基胞嘧啶DNA的特异性识别荧光图。

图8是PBAQA-P_GMA对糖基化的5-甲基胞嘧啶DNA的荧光检测图。

图9是PBAQA-P_GMA对糖基化的正常DNA的荧光检测图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。

下面实施例中所用的硼酸衍生物功能化荧光探针由下述方法制备得到：

将粒径为200nm的P_GMA溶解于30mL蒸馏水中，并加入30mL乙二胺，在氮气保护下，80℃反应12小时，反应完后，离心分离，所得产物用蒸馏水洗涤3次后，60℃干燥，得到氨基功能化的P_GMA。将0.058g氨基功能化的P_GMA(0.4mmol)分散于40mL无水乙醇中，并依次加入0.12g PBAQA(0.4mmol)、0.115g EDC(0.9mmol)、0.069g(0.9mmol)NHS，超声分散均匀，40℃反应7小时，反应完后，离心分离，所得产物依次用超纯水、无水乙醇和乙腈洗涤，自然干燥，得到PBAQA-P_GMA，即硼酸衍生物功能化荧光探针。

实施例1

硼酸衍生物功能化荧光探针在检测5-羟甲基胞嘧啶中的应用，具体检测方法由下述步骤组成：

1、将5-羟甲基胞嘧啶DNA(碱基序列5'-CTTAAGCCG(5hmC)AGGTACCTTCC-3'，分子量为6372.2)标准样品溶于超纯水中，配制成100μmol/L 5-羟甲基胞嘧啶DNA水溶液。将1μL 10000U/mL T4-β-葡萄糖基转移酶溶液加入32μL 1.25×NEBuffer4中，并加入1μL 2mmol/L尿苷二磷酸葡萄糖、10μL 100μmol/L 5-羟甲基胞嘧啶DNA水溶液，混合均匀后，37℃反应1小时，反应结束后，恢复到常温，向反应溶液中加入等体积的萃取液(萃取液是苯酚、氯仿、异戊醇的体积比为25:24:1的混合液，pH值为8.0)，剧烈震荡混匀15分钟，离心分离10分钟，取上层清液用等体积萃取液重复离心洗涤，使T4β-葡萄糖基转移酶、尿苷二磷酸葡萄糖去除干净，然后加入其2倍体积的-20℃无水乙醇，混合均匀，于-20℃静置1小时后，常温离心分离20分钟，移除上清液，用体积分数为75％的乙醇水溶液洗涤，离心分离20分钟，移除上清液，常温干燥，得到5-糖基化胞嘧啶DNA。

按照上述方法对正常DNA(碱基序列5'-CGGTACCTGCGGCTTAAGCC-3'，分子量为6094)进行糖基化处理。

采用基质辅助激光解析串联飞行时间质谱仪(MALDI-TOF MS)对正常DNA、糖基化处理的正常DNA、5-羟甲基胞嘧啶DNA、5-糖基化胞嘧啶DNA分别进行表征，结果见图1～4。由图可见，在m/z＝6133处为正常DNA片段的加钾离子峰，在m/z＝6410.2处是5-羟甲基胞嘧啶DNA片段的加钾正离子峰，在m/z＝6115处是糖基化处理的正常DNA片段的加钠减氢正离子峰，在m/z＝6510.2处为成功标记尿苷二磷酸葡萄糖糖基部分(分子量为160)的5-羟甲基胞嘧啶DNA片段的减钠正离子峰，证明对5-羟甲基胞嘧啶DNA的糖基标记成功。

2、将硼酸衍生物功能化荧光探针和步骤1得到的5-糖基化胞嘧啶DNA分别溶于超纯水中，配制成2mg/mL荧光探针悬浮液和1μmol/L 5-糖基化胞嘧啶DNA水溶液；取20μL 2mg/mL荧光探针悬浮液加入pH＝7.4的磷酸缓冲液中，并加入不同体积的1μmol/L 5-糖基化胞嘧啶DNA，分别得到200μL 5-糖基化胞嘧啶DNA浓度为0、5、10、20、25、50、72nmol/L的反应溶液，室温震荡反应30分钟，采用F-7000型(日立)荧光分光光度(激发波长281nm，发射波长415nm，光电倍增管高压为450V，激发和发射狭缝宽度均为5.0nm)测量不同浓度5-糖基化胞嘧啶DNA对应体系的荧光强度，结果见图5，绘制F-F₀值随5-糖基化胞嘧啶DNA浓度变化的标准曲线，结果见图6。

由图5可见，随着5-糖基化胞嘧啶DNA浓度的增大荧光信号逐渐增强。由图6可见，标准曲线的线性方程为：y＝0.4481x+5.659，其中y代表F-F₀值，x代表5-糖基化胞嘧啶DNA浓度，R＝0.9854，说明5-糖基化胞嘧啶DNA浓度与F-F₀值呈现良好的线性关系。经计算，该硼酸衍生物功能化荧光探针对5-糖基化胞嘧啶DNA的检出限为1.6nmol/L。

3、按照步骤2的方法用荧光光谱仪测量待测DNA样品的荧光强度，根据待测DNA样品的F-F₀值，结合标准曲线的线性方程即可高选择性识别5-羟甲基胞嘧啶DNA并确定待测DNA样品中5-羟甲基胞嘧啶DNA的浓度。

为了证明本发明的有益效果，发明人按照实施例1的方法，分别采用硼酸衍生物功能化荧光探针对浓度72nmol/L的正常DNA(碱基序列5'-CGGTACCTGCGGCTTAAGCC-3')、5-甲基胞嘧啶DNA(碱基序列5'-ATCGTTGAT(5mC)ACGTCTAGCTG-3')、5-羟甲基胞嘧啶DNA(碱基序列5'-CTTAAGCCG(5hmC)AGGTACCTTCC-3')糖基化处理后的产物进行荧光检测，并以未加检测物的溶液做空白对照实验，结果见图7～9。

如图7所示，该荧光探针与糖基化的5-羟甲基胞嘧啶DNA(5gmC-DNA)反应后荧光强度明显增强，表现出了对5-羟甲基胞嘧啶DNA良好的选择性；而与糖基化的5-甲基胞嘧啶DNA(G-5mC-DNA，见图8)、糖基化后的正常DNA(G-C-DNA，见图9)在相同条件下进行反应基本没有荧光增强现象，说明胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶不会影响到DNA链中5-羟甲基胞嘧啶的检测，即本发明的硼酸衍生物功能化荧光探针可以特异性检测DNA序列中的5-羟甲基胞嘧啶。