可逆指示生理酸性环境的近红外荧光基团的制作方法

本发明属分子影像试剂领域，涉及可逆指示生理酸性环境的近红外荧光基团；具体涉及可对生理酸性环境瞬时、可逆、高灵敏度指示的近红外荧光基团，该类荧光基团信号在生理中性条件下处于淬灭状态，在生理/病理酸性条件下其荧光信号瞬时显著增强，而当酸性环境再次发生改变，其信号强度可发生可逆变化；所述荧光基团具有pH灵敏度高、响应速度快、可逆指示、吸光系数和量子产率高、光化学性质稳定等特点。

背景技术：

现有技术公开了在光镜下可观察细胞的大小及形态、细胞器、染色体等。电子显微镜的发明开启了研究细胞超微结构的新纪元，如观察粗面内质网、滑面内质网和核糖体等。随着近年来新的影像学设备及技术的不断涌现，现代细胞生物学、分子生物学技术空前的进步和发展，高靶向性及灵敏度的分子探针和高时空分辨率小动物成像设备的发展等为分子影像学提供了条件。所述分子影像学是一门涉及影像学与现代分子生物学及其他学科的新兴交叉学科，其是从分子或细胞水平上成像从而达到认识疾病、阐明病变组织生物过程变化、病变细胞基因表达、代谢活性高低、病变细胞是否存活以及细胞内生物活动的状态等目的的科学。分子影像学的发展为疾病早期诊断、治疗和机制研究提供了实时、动态信息；常用的分子影像学方法主要包括光学成像、超声成像(ultrasound)、计算机断层摄影(computed tomography，CT)、核磁共振(magnetic resonance imaging，MRI)、正电子衍射成像(positron-emission tomography，PET)和单光子衍射(single-photon-emission computed tomography，SPECT)等。相对于其他活体成像技术，如超声、计算机断层摄影、核磁共振、正电子衍射成像、单光子衍射等，光学成像具有若干独特的优点，如操作简便、结果直观、测量快速、灵敏度高及费用低廉等；该技术已广泛应用于生命科学、医学研究及药物研发等领域。

所述光学成像具超高灵敏度、信号收集时间短、无电离辐射、运行成本低等优点；然而，由于可见光(400–700nm)受到光信号在组织中的强吸收、散射、反射和信号衰减等因素的限制，只能在组织表面或亚表面成像(1-3mm)；而生物内源性分子血红蛋白、水、脂质等内源性分子在650-900nm近红外波长范围内的吸光率较低，加之活体组织在这一波长区域自发 荧光较低，因此，近红外光可穿透较深的组织(≤2cm)并得到信噪比较高的图像。

研究公开了有机小分子荧光探针是一类利用探针与目标物作用后通过荧光光谱(包括荧光强度、荧光激发与发射波长、荧光寿命和荧光偏振/各向异性等)改变实现对目标物进行探测的有机荧光功能染料。有机小分子荧光探针一般由两部分组成：荧光基团以及与受体专一性和高亲和力结合的配体或者反应位点；与其它检测方法相比，有机小分子荧光探针具有高的灵敏度、较好的选择性、操作方便、设备依赖小以及检测方法多样等优点，且与荧光显微成像技术相结合，能方便的用于目标分子的原位适时无损伤检测。

利用分析物参与的温和化学反应导致探针的光物理性质发生改变是目前设计专一性荧光探针常用的方法。所述反应型荧光探针是指利用特定的化学反应对客体分子进行识别，即形成或破坏主客体分子之间强的相互作用而改变探针分子取代基的供、给电子能力或者共轭程度等，使探针体系的荧光性能(如波长、荧光强度等)发生改变从而达到对客体分子检测的目的。传统的pH敏感荧光探针即是根据此原理，利用可切断的pH敏感活性键的在一定pH下发生键断裂，导致光物理过程扰动的一类分子荧光探针；该类探针的特点是探针与目标物(H⁺)发生不可逆的化学反应，因而能测量累积荧光强度，灵敏度大大提高；但是，上述探针的缺点是不能用于监控细胞或活体中相关分析物的动态变化。

随着分子荧光探针中涉及的信号传递机制的发展，一类新型的基于分子内电荷转移效应的分子荧光探针引起广泛关注。分子内电荷转移(ICT)是指具有推拉电子结构的分子在激发态时发生分子内电子转移，造成分子内正负电荷分离的过程。一般来说，ICT类探针分子通常由给电子基团(羟基、氨基等)和拉电子基团(醛基、苯并噻唑等)通过共轭π键相连，形成具有“推-拉”作用的大共轭体系。所述ICT类探针的识别基团与客体络合或者与客体发生化学反应后，会对荧光团电子的推-拉作用产生影响；当探针分子中供电子部分(或拉电子部分)的供(或拉)电子能力增强时，探针分子的HOMO/LUMO能级差变小，进而导致探针的吸收光谱发生红移，而荧光发射光谱随染料和分析物的不同，荧光强度可能增强、减弱或者荧光波长红移；反之，荧光团的推-拉作用被抑制，HOMO/LUMO能级差变大，其吸收波长将发生蓝移，而荧光发射光谱随染料和分析物的不同，荧光强度可能增强、减弱或者荧光波长蓝移。基于上述理论，诞生了一类新型pH敏感分子探针。pH敏感的供电子基团在不同pH条件下，可与H⁺发生可逆结合，从而影响其供电子能力，导致荧光光谱发生变化。相较于传统pH敏感分子探针基于活性键断裂产生的荧光信号变化，该类探针的荧光信号变化是可逆的，可用于动态监控细胞或生物体内pH的改变。

细胞内pH在细胞生长、细胞内吞作用、细胞粘连、受体介导的信号传导、酶活性、离子传输和平衡、各类炎症以及肿瘤的生长等方面起着重要的作用。在生物体环境中定量检测质子的含量在细胞分析或诊断过程中起着关键作用；因此，通过合成可逆指示生理pH的近红外荧光基团，有望在活体状态下为生理酸性环境肿瘤、缺血、炎症等病灶高信噪比示踪，且能动态监测生理酸性环境pH变化，对疗效进行实时评估。

综上所述，本申请的发明人拟提供可对生理酸性环境可瞬时、可逆、高灵敏度指示的近红外荧光基团；该荧光基团在生理中性条件下其信号处于淬灭状态，而在生理酸性环境中其荧光迅速增强；同时，其信号能够根据pH变化可逆进行指示。与现有的商品化传统近红外荧光基团相比，本发明所述荧光基团将具有pH灵敏度高、信噪比高、吸光系数及量子产率高、荧光波长适合、能够对生理pH变化可逆监测等优点。迄今，尚未见所述pH敏感近红外荧光探针的报道。

技术实现要素：

本发明的目的是提供可逆指示生理酸性环境的近红外荧光基团，尤其是可对生理酸性环境快速、可逆、高灵敏度监测的近红外荧光基团；所述的近红外荧光基团其信号在生理中性条件下处于淬灭状态，在生理/病理酸性条件下其荧光信号瞬时显著增强，而当酸性环境再次发生改变，其信号强度可发生可逆变化。

本发明中，所述的可逆指示生理酸性环境的近红外荧光基团(可逆指示生理pH的近红外荧光基团)，其具有如下通式：

R₁-IRB-R₂

其中，IRB为花箐类近红外荧光基团；R₁为花箐类荧光基团一端引入的pH敏感供电子叔胺基团；R₂为花箐类荧光基团另一端引入的供电子/吸电子基团或H；

其具有如式(Ⅰ)所示的结构：

其中：

R₁为pH敏感叔胺基团，通式为–NR₂，其中R为氢，烷基，芳香基等；

R₂为①同R1(D-π-D)；②吸电子基团(D-π-A)；③氢(D-π)；

R₃为羧基或者磺酸基；

X^-为氯离子，溴离子，碘离子或ClO₄^-；

n是1，2，3，4，5，6，7或8；

本发明中，所述卤素包括氯，溴，碘等；

本发明中，所述烷基包括甲基，乙基，丙基，异丙基，丁基，异丁基等；

本发明中，所述芳香基包括苯基，萘基，取代苯基等；

本发明中，所述吸电子基团包括氟，氯，溴，硝基，氰基，磺酸基等；

本发明中，所述可逆指示生理酸性环境的近红外荧光基团中位通过C-C键修饰有对羧基苯，从而提高荧光基团的光化学稳定性并显著改善光物理性质；

本发明中，所述可逆指示生理酸性环境的近红外荧光基团中位通过C-C键修饰有对羧基苯，对羧基进行修饰，包括酯化，酰胺化等。

本发明还提供了所述可逆指示生理酸性环境的近红外荧光基团(可逆指示生理pH变化的近红外荧光基团)的制备方法，其特征在于，包括步骤：以花箐类荧光基团为母体，对羧酸苯基通过碳-碳键(C-C键)取代荧光基团中位，构建两端均修饰有供电子基团D-π-D结构；或，一端含有供电子基团，另一端未修饰D-π结构；或，一端为供电子基团，另一端为吸电子基团D-π-A结构的电子推拉体系的荧光基团；

本发明所述近红外荧光基团以两端修饰有供电子(pH敏感叔胺)/吸电子基团的花箐类染料IRB为母体，利用Suzuki-Miyaura反应，在零价钯配合物催化下，与IRB上的烯丙基氯反应，将对苯基羧酸通过碳-碳键(C-C键)引入到荧光基团中；其合成路线如下：

本发明公开了所述可逆指示生理酸性环境的近红外荧光基团(pH敏感可逆近红外荧光基团)的合成、表征以及光学性质，并进行了实验验证，结果显示，所述的近红外荧光基团均能高灵敏度、瞬时、可逆指示生理pH变化；该类近红外荧光基团不但能实现生理酸性环境的高信噪比示踪，还能通过监测肿瘤、缺血、炎症等疾病相关的生理酸性环境变化对疗效进行实时评估。

附图说明

图1为本发明中所述化合物2的1H NMR核磁图。

图2为本发明中所述化合物3的1H NMR核磁图。

图3为本发明中所述化合物5的1H NMR核磁图。

图4为本发明中所述化合物6的1H NMR核磁图。

图5为本发明中所述化合物7的1H NMR核磁图。

图6为本发明中所述化合物8的1H NMR核磁图。

图7为本发明中所述化合物10的1H NMR核磁图。

图8为本发明中所述化合物11的1H NMR核磁图。

图9为本发明中所述化合物11的1H NMR核磁图。

图10为本发明中所述化合物14的1H NMR核磁图。

图11为本发明中所述化合物15的1H NMR核磁图。

图12为本发明中所述化合物16的1H NMR核磁图。

图13为本发明中所述荧光化合物7(A),8(B),12(C),16(D)在不同pH值缓冲溶液中的吸收光谱图。

图14为本发明中所述荧光化合物7(A),8(B),12(C),16(D)在不同pH值缓冲溶液中的发射光谱图。

图15显示了本发明中所述荧光化合物7、8、12、16在pH 2.4和荧光化合物7、8、12、16在pH 7.4缓冲溶液中的吸光度与浓度比值摩尔吸光系数，其中，

A:荧光化合物7在pH 2.4缓冲溶液中的吸光度与浓度比值摩尔吸光系数，

B:荧光化合物8在pH 2.4缓冲溶液中的吸光度与浓度比值摩尔吸光系数，

C:荧光化合物12在pH 2.4缓冲溶液中的吸光度与浓度比值摩尔吸光系数，

D:荧光化合物16在pH 2.4缓冲溶液中的吸光度与浓度比值摩尔吸光系数，

E:荧光化合物7在pH 7.4缓冲溶液中的吸光度与浓度比值摩尔吸光系数，

F:荧光化合物8在pH 7.4缓冲溶液中的吸光度与浓度比值摩尔吸光系数，

G:荧光化合物12在pH 7.4缓冲溶液中的吸光度与浓度比值摩尔吸光系数，

H：荧光化合物16在pH 7.4缓冲溶液中的吸光度与浓度比值摩尔吸光系数。

图16显示了本发明中所述荧光化合物7、8、12、16在pH 4.0缓冲溶液中稳定性。

图17显示了本发明中所述荧光化合物7、8、12、16在pH 7.4和pH 4.0的循环，荧光信号pH响应可逆性，其中，

A:荧光化合物7在pH 7.4和pH 4.0的循环，

B:荧光化合物8在pH 7.4和pH 4.0的循环，

C:荧光化合物12在pH 7.4和pH 4.0的循环，

D:荧光化合物16在pH 7.4和pH 4.0的循环。

图18显示了本发明中所述荧光化合物7、8、12、16在pH 7.4和pH 4.0的缓冲溶液中响应专一性考察，其中，

A:荧光化合物7在pH 7.4和pH 4.0的缓冲溶液中响应专一性，

B:荧光化合物8在pH 7.4和pH 4.0的缓冲溶液中响应专一性，

C:荧光化合物12在pH 7.4和pH 4.0的缓冲溶液中响应专一性，

D:荧光化合物16在pH 7.4和pH 4.0的缓冲溶液中响应专一性。

图19为本发明中所述荧光化合物7、8、12、16在pH 4.0–pH 6.0缓冲溶液中的光学成像以及半定量图，其中，

A:荧光化合物7、8、12、16在pH 4.0–pH 6.0缓冲溶液中的光学成像，

B:荧光化合物7、8、12、16在pH 4.0–pH 6.0缓冲溶液中的半定量图。

具体实施方式

通过下述实施例将有助于进一步理解本发明，但并不限制本发明的内容。

实施例1合成化合物1

在冰水浴条件下将DMF(4mL)溶于DCM(4mL)中，得到溶液<1>；以及将POCl₃(3.6mL)溶于DCM(4mL)中，得到溶液<2>；当溶液<1>与<2>冷却至零度时，将<2>缓慢滴入<1>中得溶液<3>。将环己酮(980mg，10mmol)溶于DCM(3mL)中，同样在冰浴条件下，将其滴入到<3>中得溶液<4>，待<4>完全溶解后，移至65℃油浴，回流3h。反应完全后，待其冷却至室温后，小心倒至冰(25g)中，室温放置溶化后，转移至分液漏斗静置分层。将底层排弃。过滤上层溶液得黄色沉淀，以冰水洗净即为双醛，化合物1(1.37g，79.6％)。

实施例2合成化合物2

将5-硝基-2.3.3-三甲基吲哚(205mg，1mmol)和氯化亚锡(1.58g，7mmol)溶于32％盐酸中，室温搅拌16h。反应完毕，加入5M氢氧化钠溶液，调节pH至10。以二氯甲烷萃 取3次，得二氯甲烷层溶液，旋干得纯品胺基吲哚，化合物2(128.2mg，73.2％)；所述化合物2的¹H NMR核磁图如图1所示。

实施例3合成化合物3

将5-胺基-2.3.3-三甲基吲哚(175.1mg，1mmol)、二碳酸二叔丁基甲酯(261.9mg，1.2mmol)和碳酸氢钠(168.0mg，2mmol)溶于2mL(二氧六环:水＝1:1)溶液中，45℃油浴，搅拌，回流12h。反应完毕，冷却至室温后，旋干。产物以柱层层析硅胶(300-400目)纯化，石油醚:乙酸乙酯＝1:1洗脱，收集产物化合物3(226.08mg，82.1％)；所述化合物3的¹H NMR核磁图如图2所示。

实施例4合成化合物4

将5-Boc胺基-2.3.3-三甲基吲哚(275.3mg，1mmol)和丁磺酸内酯(1.09g，8mmol)溶于2mL邻二氯苯溶液中，110℃油浴，搅拌，回流13h。反应完毕，冷却至室温后，将其滴入450mL乙醚中沉淀，过滤得粗产物。产物以柱层层析硅胶(300-400目)纯化，甲醇:二氯甲烷(10％-30％)梯度洗脱收集产物化合物4(189.9mg，46.3％)。

实施例5合成化合物5

将化合物4(410.1mg，1mmol)和化合物1(86.1mg，0.5mmol)及乙酸钠(41.1mg，0.5mmol)溶于6mL乙酸酐中70℃油浴加热40min，氮气保护。反应完毕冷却后，乙醚沉淀得绿色固体产物。产物以柱层层析硅胶(300-400目)纯化，甲醇:二氯甲烷(10％-30％)梯度洗脱收集产物化合物(525.3mg，53.7％)；所述化合物5的¹H NMR核磁图如图3所示。

实施例6合成化合物6

将化合物5，IR-DiBoc(391.3mg，0.4mmol)，碳酸钾(118.8mg，0.86mmol)和对羧基苯硼酸(119.4mg，0.72mmol)加入到2mL水中，反应温度调至60℃，之后加入四(三苯基膦)钯(26.5mg，0.023mmol)加入搅拌，反应6h后薄层色谱板显示有大极性的产物生成。产物以柱层层析硅胶(300-400目)纯化，甲醇:二氯甲烷(10％-30％)梯度洗脱收集产物绿色固体化合物6，IRB-Boc(244.4mg，57.4％)；所述化合物6的¹H NMR核磁图如图4所示。

实施例7合成化合物7

将化合6，IRB-DiBoc(53.3mg，0.05mmol)，加入到4mL CH₂Cl₂中，之后加入2mL三氟乙酸搅拌，氮气保护，室温反应3h后，旋干，产物以柱层层析硅胶(300-400目)纯化，甲醇:二氯甲烷(10％-40％)梯度洗脱，收集得绿色固体化合物(36.1mg，83.5％)；所述化合物7的¹H NMR核磁图如图5所示。

实施例8合成化合物8

将化合物7，IRB-DiNH2(43.2mg，0.05mmol)用1mL DMF溶解，加入1mL N-N-二异丙基乙胺，再加入溴代乙烷(5.45g，50mmol)，氮气保护，35℃避光反应48小时。反应完毕，旋干。产物以柱层层析硅胶(300-400目)纯化，甲醇:二氯甲烷(10％-20％)梯度洗脱，收集得绿色固体化合物IRB-DiEtN(20.4mg，41.6％)；所述化合物8的¹H NMR核磁图如图6所示。

实施例9合成化合物9

将2.3.3-三甲基吲哚(160.1mg，1mmol)和丁磺酸内酯(1.09g，8mmol)溶于2mL邻二氯苯溶液中，110℃油浴，搅拌，回流13h。反应完毕，冷却至室温后，将其滴入450mL乙醚中沉淀，过滤得粗产物。产物以柱层层析硅胶(300-400目)纯化，甲醇:二氯甲烷(10％-30％)梯度洗脱收集产物化合物4(172.4mg，58.4％)。

实施例10合成化合物10

将化合物9(304.6mg，1.1mmol)和化合物1(172.1mg，1mmol)及乙酸钠(82.1mg，1mmol)溶于6mL乙酸酐中70℃油浴加热，将化合物4(410.1mg，1mmol)溶于3mL乙 酸酐，逐滴加入。反应40min，氮气保护。反应完毕冷却后，乙醚沉淀得绿色固体产物。产物以柱层层析硅胶(300-400目)纯化，甲醇:二氯甲烷(10％-30％)梯度洗脱收集产物化合物(348.7mg，41.5％)；所述化合物10的¹H NMR核磁图如图7所示。

实施例11合成化合物11

将化合物10，IR-Boc(336.1mg，0.4mmol)，碳酸钾(118.8mg，0.86mmol)和对羧基苯硼酸(119.4mg，0.72mmol)加入到2mL水中，反应温度调至60℃，之后加入四(三苯基膦)钯(26，5mg，0.023mmol)加入搅拌，反应6h后薄层色谱板显示有大极性的产物生成。产物以柱层层析硅胶(300-400目)纯化，甲醇:二氯甲烷(10％-30％)梯度洗脱收集产物绿色固体化合物6，IRB-Boc(234.9mg，63.4％)；所述化合物11的¹H NMR核磁图如图8所示。

实施例12合成化合物12

将化合6，IRB-Boc(46.3mg，0.05mmol)，加入到4mL CH₂Cl₂中，之后加入2mL三氟乙酸搅拌，氮气保护，室温反应3h后，旋干，产物以柱层层析硅胶(300-400目)纯化，甲醇:二氯甲烷(10％-40％)梯度洗脱，收集得绿色固体化合物(35.2mg，85.2％)；所述化合物12的¹H NMR核磁图如图9所示。

实施例13合成化合物13

将5-氯-2.3.3-三甲基吲哚(194.1mg，1mmol)和丁磺酸内酯(1.09g，8mmol)溶于2mL邻二氯苯溶液中，110℃油浴，搅拌，回流13h。反应完毕，冷却至室温后，将其滴入450mL乙醚中沉淀，过滤得粗产物。产物以柱层层析硅胶(300-400目)纯化，甲醇:二氯甲烷(10％-30％)梯度洗脱收集产物化合物13(127.1mg，38.6％)。

实施例14合成化合物14

将化合物13(362.0mg，1.1mmol)和化合物1(172.1mg，1mmol)及乙酸钠(82.1mg，1mmol)溶于6mL乙酸酐中70℃油浴加热，将化合物4(410.1mg，1mmol)溶于3mL乙酸酐，逐滴加入。反应40min，氮气保护。反应完毕冷却后，乙醚沉淀得绿色固体产物。产物以柱层层析硅胶(300-400目)纯化，甲醇:二氯甲烷(10％-30％)梯度洗脱收集产物化合物(417.3mg，47.9％)；所述化合物14的¹H NMR核磁图如图10所示。

实施例15合成化合物15

将化合物14，IR-Boc-Cl(349.7mg，0.4mmol)，碳酸钾(118.8mg，0.86mmol)和对羧基苯硼酸(119.4mg，0.72mmol)加入到2mL水中，反应温度调至60℃，之后加入四(三苯基膦)钯(26，5mg，0.023mmol)加入搅拌，反应6h后薄层色谱板显示有大极性的产物生成。产物以柱层层析硅胶(300-400目)纯化，甲醇:二氯甲烷(10％-30％)梯度洗 脱收集产物绿色固体化合物6，IRB-Boc-Cl(207.1mg，53.9％)；所述化合物15的¹H NMR核磁图如图11所示。

实施例16合成化合物16

将化合15，IRB-Boc-Cl(48.0mg，0.05mmol)，加入到4mL CH₂Cl₂中，之后加入2mL三氟乙酸搅拌，氮气保护，室温反应3h后，旋干，产物以柱层层析硅胶(300-400目)纯化，甲醇:二氯甲烷(10％-40％)梯度洗脱，收集得绿色固体化合物(37.6mg，87.4％)；所述化合物16的¹H NMR核磁图如图12所示。

实施例17荧光化合物7,8,12,16吸收光谱

荧光探针的吸收光谱通过SHIMADZU UV-2550分光光度计进行测量。首先配制荧光化合物7,8,12,16的DMSO标准母液(10mM/L)。与室温平衡后，分别用pH 2.4-pH 7.4(ΔpH＝0.2)柠檬酸-碳酸氢二钠缓冲溶液，稀释成1μM，立即取3mL样品加入石英比色皿中(10×10mm)，扫描速度为中速，采样间隔为1nm，狭缝宽度为5.0nm，测量波长为400-900nm。以origin软件处理数据,荧光化合物7,8,12,16的吸收光谱如图13所示。

实施例18荧光化合物7,8,12,16发射光谱

荧光探针的发射光谱通过配备有光电倍增管的SHIMADZU-5301PC荧光分光光度计进行测量。首先配制荧光探针荧光化合物7,8,12,16的DMSO标准母液(10mM/L)。与室温平衡后，分别用pH 2.4-pH 7.4(ΔpH＝0.2)柠檬酸-碳酸氢二钠缓冲溶液，稀释成1μM，立即取3mL样品加入石英比色皿中(10×10mm)，扫描速度设置为中速，激发波长为750nm，测量波长为770到900nm，激发/发射狭缝宽度为5/5nm,灵敏度为低。以荧光强度对pH作图可得其在不同酸性条件下荧光强度变化，以origin软件处理数据，荧光荧光化合物7,8,12,16的发射光谱如图14所示。

实施例19荧光化合物7,8,12,16在不同pH缓冲溶液中的摩尔吸收系数及量子产率

首先配制荧光化合物7,8,12,16的DMSO标准母液(10mM/L)；与室温平衡后，分别用pH2.4和pH 7.4柠檬酸-碳酸氢二钠缓冲溶液，稀释成0，0.2，0.4，0.6，0.8，1μM，立即取3mL样品加入石英比色皿中(10×10mm)，分别测定其在最大吸收处的吸光度，并在其最大吸收 波长处激发，测定其在两种pH，不同浓度下的荧光发射图谱，计算荧光强度曲线下面积；根据朗伯—比尔定律计算荧光化合物7,8,12,16摩尔吸光系数，以荧光染料ICG(DMSO，φ＝0.13)为标准，计算荧光化合物7,8,12,16量子产率；荧光化合物7,8,12,16的摩尔吸光系数及量子产率如图15及表1所示；

表1荧光化合物7,8,12,16在水溶液中的主要光学参数

实施例20荧光化合物7,8,12,16在pH 4.0缓冲溶液中的稳定性

首先配制荧光化合物7,8,12,16的DMSO标准母液(10mM/L)；与室温平衡后，用pH 4.0柠檬酸-碳酸氢二钠缓冲溶液，稀释成1μM，立即取3mL样品加入石英比色皿中(10×10mm)，每5min在750nm处激发，785nm处收集荧光信号，测定其在1h内荧光强度的变化；荧光化合物7,8,12,16在pH 4.0缓冲溶液中的稳定性如图16所示。

实施例21荧光化合物7,8,12,16在缓冲溶液中的pH可逆性

首先配制荧光化合物7,8,12,16的DMSO标准母液(10mM/L)；与室温平衡后，用柠檬酸-碳酸氢二钠缓冲溶液稀释，配置1μM样品溶液，加酸、碱调节pH，使溶液pH值在7.4和4.0循环，并测定每一循环点处荧光化合物7,8,12,16的荧光强度；荧光化合物7,8,12,16在不同pH缓冲溶液中的可逆性如图17所示。

实施例22荧光化合物7,8,12,16在pH响应选择性

首先配置分别含有K⁺,Ca²⁺,Mg²⁺,Zn²⁺,Co²⁺,Fe³⁺,Fe²⁺,NH₄⁺,Cys,Pro,Gly,His,H₂O₂(200ΜμM/L)的pH 7.4和pH 4.0柠檬酸-碳酸氢二钠缓冲溶液；配制荧光化合物7,8,12,16的DMSO标准母液(10mM/L)，与室温平衡后，加入上述缓冲溶液稀释为1μM样品溶液，并测定荧光化合物7,8,12,16的荧光强度；荧光化合物7,8,12,16在pH 7.4和pH 4.0缓冲溶液中的对离子以及氨基酸的响应选择性考如图18所示。

实施例23荧光化合物7,8,12,16在pH 4.0-pH 6.0缓冲溶液中的光学成像研究

将荧光化合物7,8,12,16分别用缓冲溶液(pH 4.0-pH 6.0，ΔpH＝0.2)稀释至10μ M，室温下迅速取100μl加入到96孔中。以IVIS Spectrum小动物活体成像(实验参数为：激发波长740nm，荧光发射滤片800nm,曝光时间自动)；荧光强度用ImageJ软件半定量后作图。荧光化合物7,8,12,16在pH 4.0-pH 6.0缓冲溶液中的光学成像如图19所示。