一种包覆离子型铱配合物的聚合物纳米粒子及其制备方法和应用与流程

本发明属于有机光电功能材料技术领域，具体涉及一种包覆离子型铱配合物的聚乙二醇-聚乳酸纳米粒子及其制备方法，本发明还涉及所述纳米粒子在次氯酸根检测、细胞成像和生物标记中的应用。

背景技术：

聚合物的纳米粒子，相比于无机纳米材料具有很多的优点，具有水溶性好、生物相容性好、可生物降解的特点，常常作为疏水性有机材料的良好载体应用于生物成像和癌症治疗中。

众所周知，活性氧(Reactive oxygen species,ROS)是指分子氧在还原过程中产生的一系列中间产物，包括以自由基形式存在和不以自由基形式存在的具有高活性的中间产物，包括有超氧阴离子自由基、羟基自由基、过氧自由基、烷氧自由基、次氯酸、过氧化氢、单线态氧、过氧化氢自由基。氧分子是生物体代谢过程中的必需物质，而生物体内的ROS主要是由这些氧分子通过一系列化学反应产生的。分子氧是所有耗氧有机体维持其生命活动的必需组分。人体内的活性氧物种ROS主要是通过线粒体呼吸过程产生的氧气，同时，也可通过外部干扰诱导有机体内生成，例如外源性化学物质，传染剂和紫外线。ROS参与广泛的生理和病理过程，如信号转导，炎症，癌变和神经组织衰退性损伤。虽然在正常的细胞环境中产生ROS对于生命是必须的，但是当它们在外源性刺激下生成过量时，对有机体也是有危害的。过量的ROS通过生物分子的氧化引起的氧化应激，例如，脂质、蛋白质和DNA的氧化作用，并诱导细胞死亡。

ROS调节各种各样的生理过程。次氯酸(HOCl)，一个生物学意义的活性氧，是在活化白细胞内，通过髓过氧化酶催化过氧化氯离子产生的。在自然防御中，次氯酸也是一种重要的杀菌剂。然而，次氯酸水平的异常与许多炎症相关的疾病有着密切的联系，包括心血管疾病，人体红细胞的损伤，肺病，类风湿关节炎和癌症。所以，次氯酸的检测是非常重要的。目前，已经发展了许多检测次氯酸的方法，例如，电解法，电势法，分光光度法，化学发光检测等。WeiyingLin组合成了一种检测ClO^-的比率荧光探针，当作用于分析物时，荧光发射比率(I₅₀₉/I₄₃₉)的可从0.28增加到2.74，且具有较高的选择性(Chem.Eur.J.,2009,15,2305–2309)。此探针是基于荧光信号的检测。

相比于荧光信号，磷光信号检测具有以下优势：具有大的Stokes位移、可见光激发、良好的光稳定性、长的发射寿命、高的量子效率和发射波长易调节等。其中大的斯托克斯位移 可以很容易区分激发和发射，长的发射寿命可使用时间分辨技术与背景荧光信号相区分以提高检测的信噪比和灵敏度以及可使用可见光进行激发降低光漂白。因此，开发具有选择性的、可用于生物体检测的磷光探针具有重要意义。

技术实现要素：

鉴于现有技术中存在上述技术问题，本发明的目的是为了改善离子型材料的水溶性并保证其良好的发光强度，将离子型材料包覆于聚乙二醇-聚乳酸纳米材料中，并提出将这种纳米材料应用于次氯酸检测和生物成像中。本发明提供了一类水溶性好比油溶性好的两亲性聚合物聚乙二醇-聚乳酸和包覆于两亲性聚合物聚乙二醇-聚乳酸纳米粒子核内的磷光发射铱配合物，给出它们的制备方法，并提出这类配合物在次氯酸根检测、细胞成像以及生物标记中的应用。本发明采用的技术方案如下所述：

本发明提供一种包覆离子型铱配合物探针的聚乙二醇-聚乳酸纳米材料，所述的纳米材料包括两亲性聚合物聚乙二醇-聚乳酸和包覆于两亲性聚合物聚乙二醇-聚乳酸纳米粒子核内的离子型铱配合物探针，所述离子型铱配合物的结构通式如下：

其中，C^N配体选自下述结构中的一种：

其中，R选自H、CH₃(CH₂)₄CH₃、CH₃(CH₂)₁₀CH₃、CH₃(CH₂)₁₆CH₃中的一种。

上述纳米粒子的直径为80-110nm。

本发明还提供所述的包覆离子型铱配合物的聚乙二醇-聚乳酸纳米材料的制备方法，该方 法包括以下步骤：

A)用开环聚合的方法合成两亲性的聚合物聚乙二醇-聚乳酸，具体如下：加入干燥过的甲基封端的聚乙二醇，DL-丙交酯和溶于有机溶剂中的催化剂，70℃抽真空1h除水和甲苯，再密封反应体系，140-160℃反应2-5h得到两亲性聚合物聚乙二醇-聚乳酸；

B)自组装为包覆纳米离子，具体如下：取聚乙二醇-聚乳酸，离子型铱配合物溶于有机溶剂溶液中，将上述溶液缓慢地滴加到去离子水中形成聚合物纳米粒子并搅拌，再将上述混合液转移至截留分子量为14000的透析袋避光透析3天，除去有机溶剂四氢呋喃；最后用0.22μm的针头过滤器过滤掉没有包覆进聚合物纳米粒子中的铱配合物的聚集体。

所述纳米材料的制备方法一个可行的合成路线为：

其中，所述磷光发射的离子型铱配合物的制备方法的具体步骤为：

(1)铱二氯桥的制备：将C^N配体(所述C^N配体选自上述C^N结构中的一种)与三氯化铱在惰性气体保护下加入到乙二醇乙醚和水的混合溶液中，加热搅拌，制备得到二氯桥中间体；

(2)铱配合物中间体的制备：将得到的铱二氯桥中间体与含有肟基(-C＝N-OH)的N^N配体在二氯甲烷和甲醇混合液中惰性气体保护下50℃密闭反应5h，反应结束后冷却至室温，得到铱配合物中间体；所述N^N环金属配体的结构通式为：

(3)铱配合物探针的制备：在步骤(2)反应结束后的反应液中加入六氟磷酸钾继续反应8h后，分离提纯得到的铱配合物探针。

所述磷光发射的离子型铱配合物的制备方法一个可行的合成路线为(仅是本发明所述制备方法中的一个实施例，不代表本发明包含的所有技术方案)：

本发明所述制备方法中，首先，合成了一类用于检测次氯酸根(ClO^-)的含肟基团(C＝N-OH)的磷光铱配合物。其次，采用开环聚合的方法制备以聚乙二醇为引发剂得到两亲性聚合物聚乙二醇-聚乳酸(mPEG-PLA)，最后，通过纳米沉淀的方法，让铱配合物与两亲性聚合物通过自组装得到包覆离子型铱配合物的聚乙二醇-聚乳酸的纳米粒子。这种纳米粒子尺寸均一，生物相容性好，可以有效改善的离子型铱配合物水溶性。这种包覆离子型铱配合物的聚乙二醇-聚乳酸纳米粒子具有好的水溶性和生物相容性，并且具有较好的磷光发射。

磷光重金属铱配合物具有良好地光物理性质，例如较长的发射寿命、良好地光化学稳定性、室温下高的三线态光量子效率、易调节的发射波长、大的斯托克斯位移和可见光区激发等优点，当前，已经应用于电致发光和发光电化学池器件、生物传感等领域。相对于小分子有机荧光染料分子，磷光重金属配合物长的发射寿命可使用时间分辨技术与背景荧光信号相区分以提高检测的灵敏度和信噪比。本发明所述的铱配合物探针具有很好的应用前景，尤其是在生物细胞检测和成像领域。

所述的包覆离子型铱配合物的聚乙二醇-聚乳酸纳米材料，其特征在于该探针可应用于次氯酸根检测且具有优异的水溶性。

将上述包覆离子型铱配合物的聚乙二醇-聚乳酸纳米材料溶解在CH₃OH/H₂O(v/v,2:1)混合溶液中，逐次滴加到ClO^-的CH₃OH/H₂O混合溶液中，每次滴加ClO^-后均加热搅拌以使ClO^-与上述纳米材料充分反应，并测试其荧光发射光谱。通过分析荧光发射光谱可以看到，在光波波长为600nm附近，上述纳米材料的溶液本身发光很弱，随着ClO^-的加入，纳米材料的溶液的荧光光谱立刻发生了变化，伴随着ClO^-滴加浓度的升高，纳米材料溶液的荧光光谱发生蓝移且荧光强度逐渐升高。当ClO^-的滴加浓度当量达到30eq.时，滴定达到终点，再继续滴加ClO^-，光谱则不再发生变化。

可见本发明所述的纳米材料对次氯酸根的响应性非常明显，具有很好的灵敏度和很低的 检测最低限。这是因为上述纳米材料包覆的铱配合物探针本身只有很低的荧光效果，但是，在次氯酸根的强氧化作用下，上述铱配合物探针上的含肟基团(-C＝N-OH)被氧化为羧基(-COOH)，生成一种新的铱配合物，该铱配合物具有很强的荧光效应。于是，即使只有很少的次氯酸根，在荧光效应的对比下，也很容易得到明显的检测结果。

在上述纳米材料溶解在CH₃OH/H₂O(v/v,2:1)混合溶液分别加入过量的NaClO₃、CuCl₂、LiClO₃、AlCl₃、MgCl₂、Na₂CO₃、Na₂SO₄、NaOAc、ZnCl₂、H₂O₂、NaNO₂、NaClO溶液，分别测其发射光谱。通过对比可知，其他离子均对发射光谱的强度和发射波长均无明显影响，即所述纳米材料对ClO^-有较好的选择性。

另外，包覆在离子型铱配合物外面的聚乙二醇-聚乳酸材料是常见的具有优异水溶性的聚合物材料，那么，上述包覆离子型铱配合物的聚乙二醇-聚乳酸纳米材料具有优异的水溶性

综上可知，本发明所述的细胞膜靶向的磷光铱配合物探针可应用于次氯酸根检测，并具有优异的水溶性，这对深入研究ClO^-在生物体体内的生理和毒理作用具有重要意义。

所述的包覆离子型铱配合物探针应用于细胞标记和成像。

培养好的两组Hela细胞，其中一组用所述纳米材料的溶液孵育，并用培养液洗涤3次，作为空白对照组；另一组用纳米材料的溶液孵育，并滴加ClO^-溶液，并用培养基洗涤3次，作为实验组。使用共聚焦显微镜对两组细胞拍照，对比两组细胞的照片可见，对照组细胞膜上基本没有荧光发射，而实验组细胞胞膜内有较强的磷光发射。

另外，所述纳米离子尺寸为80-110nm左右，易于与细胞发生相互作用，进而通过胞吞进入细胞内部，实现细胞成像的目的；所述纳米材料中包覆的铱配合物及被次氯酸根氧化后得到的铱配合的荧光效应均可使用可见光激发，可以避免使用紫外激发光源对活体生物细胞的潜在光损伤，这样有利于探针应用于活体细胞靶向的次氯酸根的光成像测定、细胞成像和生物标记领域。

所述的包覆离子型铱配合物的聚乙二醇-聚乳酸纳米材料，其特征在于，该聚合物纳米材料应用于时间分辨寿命成像。

本发明具有如下有益效果：1、所述纳米材料的制备方法简单、条件温和、便于工业化生产；2、所述纳米粒子荧光探针具有发光特性，具有灵敏度高，光稳定性好，荧光光谱不漂移等优点，为turn-on型磷光探针，有望应用于生物成像、荧光示踪检测等领域；3、所述纳米探针材料对ClO^-具有高的选择性，并且响应快；4、所述纳米材料具有良好的水溶性和生物相容性、低生物毒性，且容易进入细胞中，使得这类探针可用于细胞内ClO^-检测。

附图说明

图1.本发明中实施例3的包覆离子型铱配合物的聚乙二醇-聚乳酸纳米材料的紫外-可见吸收谱图。

图2.本发明中实施例3的包覆离子型铱配合物的聚乙二醇-聚乳酸纳米材料的荧光发射滴定谱图。

图3.本发明中实施例2合成的配合物Ir-2的MALDI-TOF谱图。

图4.本发明中实施例3的包覆离子型铱配合物的聚乙二醇-聚乳酸纳米材料的细胞成像图。

图5.本发明实施例3的包覆离子型铱配合物的聚乙二醇-聚乳酸纳米材料的透射电子显微镜图。

具体实施方式

为了更好地理解本发明专利的内容，下面通过具体的实例来进一步说明本发明的技术方案。但这些实施实例并不限制本发明。

实施例1：离子型铱配合物Ir-1的制备：

本实施例中的N^N辅助配体为C＝N-OH-bpy，C^N环金属配体为带有12个碳的长链烷基的C-12，两者的结构式分别为：

本实施例的合成反应式为：

(1)铱二氯桥的制备：称取C-12(2.2mmol)与IrCl₃·3H₂O(1mmol)混合投入三颈瓶中，在双排管上抽真空-保氮气-抽真空，循环往复三次，最后采用氮气保护整个反应体系。将体积比为3:1的乙二醇乙醚和水的混合物注射进反应体系中，升温至110℃，磁力搅拌反应24小时。反应结束后，将体系冷却至室温，过滤沉淀，并用乙醇和水洗，得到的固体产物即为铱二氯桥，可直接投入下一步反应。

(2)铱配合物中间体的制备：称取铱二氯桥(1mmol)、称取C＝N-OH-bpy(2.4mmol)加入至三颈瓶中，在双排管上抽真空-保氮气-抽真空，循环往复三次，最后采用氮气保护整个反应体系。将体积比为2:1的二氯甲烷和甲醇的混合物注入体系中，将温度升至50℃，搅拌回流。

(3)铱配合物探针的制备：反应5小时后，加入0.75mmol的六氟磷酸钾固体，继续搅拌反应8h。反应结束后浓缩提纯，最后用二氯甲烷和正己烷重结晶，得到固体产物即为铱配合物Ir-1。产率:69％。¹H NMR(400MHz DMSO):δ＝7.90(d,J＝5.6Hz,1H),7.73(d,J＝8.0Hz,2H),7.40(m,2H),7.28(d,t,J＝3.2Hz,7.6Hz,2H),6.33-6.28(m,2H),5.77-5.70(m,2H),4.71-4.58(m,4H),2.08-1.95(m,4H),1.82-1.65(m,4H),1.52-1.43(m,4H),1.29-1.17(m,32H),0.87(t,J＝6.8Hz,6H)；[m/e](M,MALDI-TOF)理论值:1128.56,实验值:1128.79。

实施例2：配合物Ir-2的制备：

本实施例中的N^N辅助配体为C＝N-OH-bpy，C^N环金属配体为带有18个碳的长链烷基的C-18，C-18的结构式为：

本实施例的合成反应式为：

(1)铱二氯桥的制备：称取C-18(2.2mmol)与IrCl₃·3H₂O(1mmol)混合投入三颈瓶中，在双排管上抽真空-保氮气-抽真空，循环往复三次，最后采用氮气保护整个反应体系。将体积比为3:1的乙二醇乙醚和水的混合物注射进反应体系中，升温至110℃，磁力搅拌反应24小时。反应结束后，将体系冷却至室温，过滤沉淀，并用乙醇和水洗，得到的固体产物即为铱二氯桥，可直接投入下一步反应。

(2)铱配合物中间体的制备：称取铱二氯桥(1mmol)、称取C＝N-OH-bpy(2.4mmol)加入至三颈瓶中，在双排管上抽真空-保氮气-抽真空，循环往复三次，最后采用氮气保护整个反应体系。将体积比为2:1的二氯甲烷和甲醇的混合物注入体系中，将温度升至50℃，搅拌回流。

(3)铱配合物探针的制备：反应5小时后，加入0.75mmol的六氟磷酸钾固体，继续搅拌反应8h。反应结束后浓缩提纯，最后用二氯甲烷和正己烷重结晶，得到固体产物即为铱配合物Ir-2。产率:75％。1H NMR(400MHz DMSO):8.23-8.19(m,2H),7.96-7.90(m,4H),7.72-7.68(m,2H),7.41-7.39(m,1H),7.20-7.13(m,4H),6.40(d,J＝6.0Hz,2H),3.95-3.88(m,4H),1.40-1.20(m,2H),0.89(t,J＝7.2Hz,6H).[m/e](M,MALDI-TOF)理论值:1296.89,实验值:1296.752。

实施例3：

本实施例提供一种包覆离子型铱配合物的聚合物纳米材料，包括两亲性聚合物聚乙二醇-聚乳酸和包覆于两亲性聚合物聚乙二醇-聚乳酸纳米粒子核内的离子型铱配合物。铱配合物的结构通式如下：

其中，C^N配体的结构如下：

其中，R为H，CH₃(CH₂)₄CH₃，CH₃(CH₂)₁₀CH₃，CH₃(CH₂)₁₆CH₃。

以其中一个铱配合物实施例1制备的Ir-1为例，其中环金属配体为C-12，辅助配体是C＝N-OH-bpy，结构式如下列分子式所示：

所述的聚乙二醇-聚乳酸的分子量为26778，包覆离子型铱配合物的聚乙二醇-聚乳酸的纳米粒子的粒径为80-110nm。具体制备路线如下：

A)聚乙二醇-聚乳酸通过开环反应合成，具体合成路线如下：

称量0.1g已干燥过的mPEG₄₀₀₀和0.6g重结晶两次的DL-丙交酯置于反应管中，事先配置一定浓度(12.4mg/mL)的催化剂的甲苯溶液，取甲苯溶液725μL(催化剂辛酸亚锡为9mg)，然后加入2mL甲苯将附在反应管上的物冲下去，并刚刚将反应物没过。70℃下减压抽真空1h将甲苯和水蒸气抽干，然后140-160℃本体聚合2-5h。反应结束后，用二氯甲烷将产物溶解，再将溶液浓缩至0.5mL，用体积比为1:1乙醚和石油醚沉降，过滤。再用丙酮溶解，浓缩至0.5mL，在过量的水中沉降，过滤，产物真空干燥48h。得到的最终产物为400mg。

B)包覆离子型铱配合物的聚乙二醇‐聚乳酸纳米材料通过纳米沉淀法制备。取聚乙二醇-聚乳酸10mg，铱配合物1mg溶于1mL四氢呋喃溶液中，再将上述混合溶液缓慢地滴加到去离子水中形成聚合物纳米粒子，搅拌30min，再将上述混合液转移至截留分子量为14000的透析袋避光透析3天，除去有机溶剂四氢呋喃和甲醇。最后用0.22μm的针头过滤器过滤掉没有包覆进聚合物纳米粒子中的铱配合物的聚集体。

为了更好地理解本实施例提供的包覆离子型铱配合物的聚合物纳米材料的性能，通过以下测试进行表征：

包覆离子型铱配合物的聚乙二醇-聚乳酸聚合物纳米粒子的的形貌测试：

图5为本发明提供的包覆离子型铱配合物的聚乙二醇‐聚乳酸纳米材料的透射电子显微镜图。具体测试步骤是：

取20μL浓度为1mg/mL的样品溶液滴在铜网上，待干燥后进行形貌测试。包覆离子型铱配合物的聚乙二醇-聚乳酸聚合物纳米粒子的粒径为80-110nm，从图1的透射电子显微镜照片显示结果可以看出本发明所提供的纳米粒子的粒径均一，分散性良好。

实施例4：紫外-可见吸收谱图

包覆离子型铱配合物的聚乙二醇-聚乳酸纳米材料(纳米材料中包覆的铱配合物浓度折算为10^-5M)溶解在CH₃OH/H₂O(v/v,2:1)混合溶液中测的吸收谱图，结果如图1所示，由图1可知，它的最大吸收波长在225nm左右。

实施例5：发射光谱对ClO^-的响应性：

包覆离子型铱配合物的聚乙二醇-聚乳酸纳米材料(纳米材料中包覆的铱配合物浓度折算 为10^-5M)溶解在CH₃OH/H₂O(v/v,2:1)混合溶液中，逐次加入ClO^-的CH₃OH/H₂O混合溶液中，每次滴加ClO^-后，在37℃恒温水浴中加热搅拌5分钟，使ClO^-与聚合物纳米粒子充分反应，随后测试其荧光发射光谱，如图2所示。在601nm处，聚合物纳米粒子在溶液中本身发光很弱，随着ClO^-的加入，聚合物纳米粒子溶液的荧光光谱立刻发生了变化，伴随着ClO^-滴加浓度的升高，聚合物纳米粒子的荧光光谱蓝移并在595nm处的荧光强度逐渐升高。当ClO^-的滴加浓度当量达到30eq.时，滴定达到终点，再继续滴加ClO^-，光谱则不再发生变化。

实施例6：纳米粒子对ClO^-的选择性实验：

包覆离子型铱配合物的聚乙二醇-聚乳酸纳米材料(纳米材料中包覆的铱配合物浓度折算为10^-5M)溶解在CH₃OH/H₂O(v/v,2:1)混合溶液中，移取2.5mL所配化合物溶液于比色皿中，加入过量的NaClO₃、CuCl₂、LiClO₃、AlCl₃、MgCl₂、Na₂CO₃、Na₂SO₄、NaOAc、ZnCl₂、H₂O₂、NaNO₂、NaClO溶液，分别测其发射光谱。其他离子均无明显影响。实验数据表明：材料对ClO^-有较好的选择性。

实施例7：活细胞成像实验：

Hela细胞按照American Type Tissue Culture Collection规定进行培养。将实验所得的离子型铱配合物的聚乙二醇-聚乳酸纳米粒子水溶液进行浓缩，Hela细胞用1.5μM该纳米粒子在37℃下孵育30分钟，用培养液洗涤3次，作为空白对照组的共聚焦显微镜照片结果如图4所示，活细胞内基本没有荧光发射；实验组在Hela细胞用1.5μM该纳米粒子在37℃条件下孵育30分钟后，再用1.5ClO^-焦显微镜下拍照，之后用培养基洗涤3次，置于共聚焦显微镜下拍照，照片显示活细胞胞内有较强的磷光发射，结果如图4所示。此实验结果表明，离子型铱配合物的聚乙二醇-聚乳酸纳米粒子可用于检测活细胞内的ClO^-且水溶性较好。