本发明属于天然产物提取领域，尤其涉及一种从枪乌贼中提取保健功能性黑色素的新方法。
背景技术：
枪乌贼是软体动物门（Mollusca）头足纲 (Cephalopoda)枪形目（Teuthoidea）枪乌贼科（Loliginidae）的统称。又称鱿鱼、笔管，古称锁管、柔鱼。枪乌贼科中共包括约50种，其中已成为捕捞对象的约16种，如中国枪乌贼(Loligo chinensis)、日本枪乌贼(L.japonica)、剑尖枪乌贼(L.edulis)、福氏枪乌贼(L.forbesi)、皮氏枪乌贼(L.pealei) 、莱氏拟乌贼(Sepioteuthis lessoniana)等。在中国，鱿鱼的年捕捞量约在230万吨左右，捕捞量十分巨大。
墨囊是头足纲所特有的结构，约占其体重的1.3%，用来贮藏防御用的墨汁，此墨汁十分粘稠，富含黑色素、蛋白质及多糖。生产加工过程中，墨囊作为废弃物被丢弃，初步估计一年将产生3万吨的废弃墨囊。
黑色素是一类由酚类和/或吲哚类物质经多步氧化聚合形成的生物色素，枪乌贼的黑色素常与糖蛋白牢固结合在一起，即形成黑色素-糖蛋白。天然黑色素广泛存在于动植物体内，具有保护、防御功能，并参与许多生理活动，黑色素是目前所知唯一能保护生物体免受辐射伤害的天然内源性生物聚合体。国内鱿鱼墨进行了诸多研究，如雷敏等研究了鱿鱼墨黑色素的免疫调节作用，并证明其对机体特异性及非特异性免疫机能具有显著调节作用。刘治东等进行了鱿鱼墨黏多糖对小鼠免疫调节作用的研究，发现鱿鱼墨黏多糖能提高免疫低下小鼠的体液免疫、细胞免疫和非特异性免疫功能。陈士国等通过超速离心法从鱿鱼墨中提取了黑色素，并采用碱降法制备可溶性黑色素，分别过10kDa和50kDa的超滤膜将所得的黑色素进行分级，结果发现分子量在50kDa以上的可溶性黑色素具有很强的自由基清除效果。
现阶段黑色素的分离纯化方法主要有三种：水洗法、化学法（酸解法、碱解法）、酶解法。水解法适用于含杂质少的样品，而枪乌贼墨汁成分复杂，单用此法将造成极大的原料及用水浪费。化学法反应条件剧烈，需用到强酸和强碱，会破坏头足类墨汁中的黑色素-糖蛋白结合结构，从而破坏其多种生物活性。酶解法虽反应条件温和，但蛋白酶会破坏与黑色素相结合的糖蛋白结构，从而使其生物活性降低甚至消失。比如中国2009年5月13日授权的200610146291.0号专利“鱿鱼墨黑色素的制备方法及其应用”中所采用酶解与水洗相结合的方法得到冻干的鱿鱼墨沉淀粉，在酶解过程中，黑色素-糖蛋白的结构中的蛋白被不同程度的破坏，失去了原有的大分子形态，生物活性大打折扣；又如中国2014年8月13日授权的201110112848.X号专利“一种乌贼墨肽聚糖的制备方法和应用”中使用有机溶剂脱脂及去除杂蛋白，反应条件剧烈，应用于食品及其他日用品缺乏有机物残留数据，无法保证其安全性；再如中国2016年7月6日公布的201610072931.1号专利“不溶性及可溶性鱿鱼墨黑色素的制备方法及应用”中使用了强碱NaOH和强酸HCl，获得的黑色素失去了活性大分子结构，其抗氧化性、提高免疫能力的功能也就随之消失。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种枪乌贼保健功能性黑色素的提取方法，该方法克服了现有提取技术造成的枪乌贼黑色素-糖蛋白结构被破坏和生物活性下降的缺点。
本发明的目的是通过如下措施来达到的。
提取枪乌贼保健功能性黑色素的方法，其特征是：包含如下加工步骤：
（1）原料处理：取冰冻储存的墨囊，过夜解冻后，加入食物切碎机中将墨囊破碎，加入墨囊重量1-5倍的纯化水充分搅拌，使用漏勺将未破碎完全的组织捞出；
（2） 粗滤：用尼龙网初步过滤，滤去不溶解杂质、颗粒物，得到粗滤液；
（3）第一次抽滤：粗滤液经孔径为0.45um的混合纤维素滤膜抽滤，得到第一次抽滤液；
（4）第二次抽滤：第一次抽滤液经孔径为0.22um的混合纤维素滤膜抽滤，得到第二次抽滤液；
（5）第一次喷雾干燥：将第二次抽滤液进行喷雾干燥，得到干粉；
（6） 溶解：用纯化水将干粉进行溶解；
（7）分离层析：使用透明柱装填凝胶进行分离，以除去不需要的无机盐、氨基酸、蛋白质、多糖等杂质，以纯化水为洗脱液，肉眼可见黑色色带缓慢沿层析柱向下移动，收集黑色色带区域的洗脱液；
（8）第二次喷雾干燥：将分离层析收得的洗脱液，进行喷雾干燥，喷雾干粉用纯化水溶解后，继续进行分级分离层析；
（9）分级分离层析：使用较分离层析中的填料分离范围有一定跨度、交联度稍高凝胶的一种、两种或两种以上，依次进行分离纯化，以尽量多地除去不需要的无机盐、氨基酸、蛋白质、多糖等杂质，以纯化水为洗脱液，收集黑色色带区域的洗脱液；
（10）第三次喷雾干燥：将分级分离层析收得的洗脱液，分别进行喷雾干燥，前一级的喷雾干燥粉用纯化水溶解后，继续进行下一级层析，最后一级喷雾干燥后得保健功能性黑色素。
进一步地，所述步骤（2）粗滤中尼龙网采用200目尼龙网。
进一步地，所述步骤（7）分离层析中采用规格为Φ60×1000mm玻璃柱装填Sephadex G-15。
进一步地，所述步骤（9）分级分离层析中采用规格为Φ60×1000mm玻璃柱装填Sephadex G-25。
与现有技术相比，本发明的优点在于，充分利用了宝贵的海洋资源，提高了枪乌贼的经济价值。制得的枪乌贼保健功能性黑色素含多种天然营养成分，其中黑色素-糖蛋白总含量达80-90%，还含有少量蛋白多糖复合体及其单体。整个工艺流程简单，适于工业化生产，反应条件温和，不使用有机溶剂，营养成分破坏少，提取的黑色素带有活性粘多糖天然结构未被破坏，功能性得以全面保留。
具体实施方式
提取枪乌贼保健功能性黑色素的方法包括如下步骤：
（1） 取冰冻储存的墨囊10kg，过夜解冻后，加入食物切碎机中将墨囊破碎，加入20L纯化水于破碎的墨囊中，充分搅拌，使用漏勺将未破碎完全的组织捞出。
（2）用200目尼龙网静置过滤，滤去组织碎片、残渣，得到粗滤液22L。
（3）粗滤液经孔径为0.45um的混合纤维素滤膜进行第一次抽滤，得到滤液22L。
（4）第一次抽滤液再经孔径为0.22um的混合纤维素滤膜抽滤，得到滤液22L。
（5）进行第一次喷雾干燥得干粉83g。
（6）将此干粉用400ml纯化水进行溶解得1级待分离液410ml。
（7）使用规格为Φ60×1000mm玻璃柱装填Sephadex G-15 ，以纯化水为洗脱液，上样1级待分离液，将流速设定为50ml/min，洗脱流速为2ml/min，收集黑色色带区域的洗脱液450ml。
（8） 进行第二次喷雾干燥，得到干粉56g。
（9） 用400ml纯化水溶解第二次喷雾干燥干粉得2级待分离液，使用规格为Φ60×1000mm玻璃柱装填Sephadex G-25 ，以纯化水为洗脱液，上样2级待分离液，将流速设定为50ml/min，洗脱流速为2ml/min，收集黑色色带区域的洗脱液600ml。
（10）进行第三次喷雾干燥即得到枪乌贼保健功能性黑色素31g。