一种以虾壳为碳源的碳量子点及其制备方法和在检测抗坏血酸中的应用与流程

本发明涉及一种以虾壳为碳源的碳量子点及其制备方法和在检测抗坏血酸中的应用。

背景技术

碳量子点(carbonquantumdots，简称cqds或cds)是一种与半导体量子点有相似光学性能的环境友好型荧光纳米材料。尽管是纳米大家族中的后起之秀，但它却因其具有激发光谱连续且宽广、一元激发，多元发射、荧光强且稳定性好等优异的荧光性能，并且还具有粒径小(直径小于10nm)、分子量低、生物毒性低、制备成本低廉、易于功能化修饰和反应条件温和等优势，正逐渐代替金属量子点和有机染料被广泛应用于光电器件、重金属离子检测、化学传感器、光催化、生物标记与细胞成像等领域。

l-抗坏血酸(ascorbicacid，简称aa)，通常又叫维生素c(vitaminc，简称vc)，是重要的水溶性维生素之一，主要作用是维持机体的正常生理功能，但机体不能自身合成,而只能且必须从食物和药物中来摄取。机体氧化、还原等复杂的代谢过程中通常会有抗坏血酸的广泛参于，而且它能促进抗体的生长和形成，增强对各种疾病的抵抗力，同时还具备有一定程度的解毒作用。研究发现机体缺乏抗坏血酸可能会导致多种怪异疾病，其含量的高低程度通常会作为营养分析及某些疾病诊断的重要指标之一。

因此，发展一种简单便利的抗坏血酸分析法来用于生活日常食品的检测是非常重要的。目前，抗坏血酸的测定方法很多，大量文献上已有报道，主要集中于以下几种方法：电化学法、滴定法、高效液相色谱法、光度法、酶法、荧光光谱法、伏安法等。其中，某些方法要求的实验条件较为苛刻和操作技术较高，而有些方法步骤复杂繁琐，不利于快速分析的要求。

技术实现要素：

本发明提供了一种以虾壳为碳源的碳量子点及其制备方法和在检测抗坏血酸中的应用。利用碳量子点和cr⁶⁺构建复合荧光探针，利用荧光分析法构建线性关系曲线，进而实现对抗坏血酸的定量检测。该方法成本低廉、灵敏度高、线性关系好、操作简便易行、选择性较好。

本发明采取的技术方案为：

一种以虾壳为碳源的碳量子点的制备方法，包括以下步骤：将虾壳清洗后烘干，然后在220～240℃下高温煅烧4.5～6h得到灰分；将灰分研磨成粉末，并将粉末加入到超纯水中超声分散，并经离心、上清液过滤、滤液透析后得到碳量子点溶液。

进一步地，所述烘干的温度为80℃；所述高温煅烧的温度和时间分别优选为230℃、5h。

所述粉末与超纯水的比值为2g：80～120ml；优选为2g：100ml。

所述超声的时间为0.8～1.5h；优选为1h。

所述离心的条件为：离心机转速9000～10000rpm/min，离心时间为25～40min；进一步地，优选为：离心机转速9500rpm/min，离心时间为30min。

所述过滤指的是经过0.22μm微孔膜过滤，所述透析指的经截留分子量为3500da的透析袋中进行透析10～15h；优选为透析12h。

本发明还提供了根据上述制备方法制备得到的碳量子点，其分布均匀，粒径在3～8nm。

本发明以廉价的虾壳为碳源，所得碳量子点具备良好的荧光性能和光稳定性，其在激发波长为340nm时，在400nm波长处具有最强的荧光强度，且荧光发射峰的峰形良好。且制备过程操作简单，所使用的溶剂只有水，是一种绿色无污染的制备方法。

本发明还提供了根据所述的制备方法制备得到的碳量子点在检测抗坏血酸中的应用。

本发明还提供了一种抗坏血酸的检测方法，包括以下步骤：将碳量子点溶液和cr⁶⁺水溶液混合得到cqds/cr⁶⁺复合荧光探针溶液，并调节ph为7.0，然后向cqds/cr⁶⁺复合荧光探针溶液中加入不同终浓度的抗坏血酸水溶液，测试各体系在340nm激发波长下的荧光强度；以25～95μm范围内的抗坏血酸浓度为横坐标，400-420nm处的荧光强度的最大值为纵坐标构建线性曲线，进而测得待测液中抗坏血酸的浓度。

当往cqds中加cr⁶⁺离子，随着cr⁶⁺离子浓度增加，荧光发射光谱逐渐红移，从400nm移到420nm，如图5所示；当往cqds/cr⁶⁺复合荧光探针溶液中逐渐加aa，由于aa把体系中cr⁶⁺离子还原到cr³⁺离子，导致荧光发射光谱逐渐蓝移，从420nm移到400nm，如图3所示，从而恢复到cqds本身的400nm发射光谱。因此选取400-420nm处的荧光强度的最大值为纵坐标构建线性曲线。

进一步地，所述cqds/cr⁶⁺复合荧光探针溶液中，cr⁶⁺水溶液的终浓度为140μm。cods的荧光强度随着cr⁶⁺浓度的增加，荧光淬灭程度加大，当cr⁶⁺浓度达到140μm时，cods的荧光猝灭达到60％；本专利选择cr⁶⁺浓度达到140μm用于检测aa。虽然随着cr⁶⁺浓度的继续增加，cqds的荧光进一步猝灭，但猝灭幅度不大，如果cr⁶⁺浓度太大，将会消耗更多aa，从而导致检测aa不灵敏。

进一步地，所述线性曲线的线性方程为y＝637.15+4.75c，其中y为400-420nm处的荧光强度的最大值；c为抗坏血酸浓度，单位为μm；线性相关系数为r＝0.993，检测限最低可以达到1.14μm。

本发明提供的碳量子点在检测抗坏血酸的应用及抗坏血酸的检测方法中，碳量子点与cr⁶⁺结合后，碳量子点的荧光强度被淬灭，在添加aa后，cr⁶⁺和加入的aa之间发生氧化还原反应生成了cr³⁺离子，碳量子点的荧光随之恢复，aa的浓度越大，荧光恢复的程度越高，并在0～178μm范围内，aa的浓度与体系在400-420nm处的荧光强度的最大值处的荧光强度值成线性相关，线性相关系数为0.993。进而可实现对待测aa浓度的定量检测。

本发明公开的碳量子点实现aa检测的原理为：以虾壳为碳源制备的碳量子点在400nm发射波长下的激发图谱(340nm波长处具有最大荧光强度)、在340nm激发波长下的发射图谱(400nm波长处具有最大荧光强度)和cr⁶⁺离子的紫外吸收图谱产生很大程度的重叠，从而可以有效的发生荧光内滤效应(ief)，所以碳量子点的荧光可以被cr⁶⁺而不是cr³⁺离子快速且有效猝灭。而且添加aa后，cr⁶⁺离子和加入的aa之间发生氧化还原反应生成了cr³⁺离子，因而碳量子点的荧光可以恢复。

与现有技术相比，本发明公开的以虾壳为碳源的碳量子点的制备方法环保简单，可直接利用碳量子点与cr⁶⁺离子构建的复合荧光探针实现对aa的定量检测，该检测方法灵敏度高、线性关系好、操作简便易行、选择性好、抗干扰能力强。

附图说明

图1为实施例1中碳量子点的tem图；

图2为在不同激发波长之下的实施例1中的碳量子点的荧光发射光谱图；

图3为向cqds/cr⁶⁺复合荧光探针溶液中加入不同浓度aa溶液后的荧光发射光谱图；

图4为以aa浓度对检测体系在400-420nm处的荧光强度的最大值处的荧光强度值构建的线性关系图；

图5为向cqds中加入不同浓度的cr⁶⁺后的荧光发射光谱图；

图6为碳量子点的激发光谱、发射光谱与cr⁶⁺离子的紫外吸收光谱图；

图7为cr⁶⁺离子及加入aa后的的紫外光谱图。

图8为cqds/cr⁶⁺体系检测抗坏血酸的选择性和抗干扰实验图。

具体实施方式

实施例1

一种以虾壳为碳源的碳量子点的制备方法，包括以下步骤：

称量10.0g干虾洗干净后放置在烘箱中，于80℃环境下烘干水分后取出，待自然冷却至室温，然后将其放入坩埚中置于马弗炉中于230℃下高温煅烧5h，待煅烧后的灰分自然冷却至室温后研磨成粉末。

称取2.0g粉末加入到100ml超纯水中混合搅拌摇匀，放入超声仪中超声使其均匀分散。将溶液超声处理1h后使用高速离心机设置转速为9500rpm/min，离心时间为30min，将其离心并除去掉大颗粒物质，收集上清液。

所得上清液通过0.22μm微孔膜过滤以获得淡黄色过滤溶液，最终产物溶液在使用前在截留分子量为3500da透析袋中进一步透析12h，取透析袋外的溶液即得碳量子点(cqds)溶液。

利用透射电镜图(tem)对cqds的形貌进行分析，如图1所示，可以看出所制备的cqds为球形，粒径主要分布在3～5nm的范围内，平均在4nm左右，且分布较为均匀。

与大多数荧光碳量子点类似，本发明所制备的cqds也具有激发依赖性荧光行为的性质，如图2所示，随着激发波长的改变从300至360nm，cqds发射峰位置和荧光强度都在不断变化。当激发波长为340nm时，cqds的荧光光谱在波长400nm处具有最强的荧光发射峰，峰形良好，故后面对aa检测时荧光测定时激发波长均设定λex＝340nm。这种激发依赖性荧光行为是由于不同尺寸的cqds的光学选择和cqds的表面缺陷产生。

实施例2

实施例1得到的碳量子点溶液在检测抗坏血酸中的应用。

所述检测的方法为：将1ml的实施例1得到的碳量子点溶液和0.1ml的cr⁶⁺水溶液混合得到cqds/cr⁶⁺复合荧光探针溶液，cr⁶⁺的终浓度为140μm；并加入0.6mlpbs缓冲溶液调节ph为7.0，然后向cqds/cr⁶⁺复合荧光探针溶液中加入不同终浓度的抗坏血酸水溶液，15min后，测试各体系在340nm激发波长下的荧光强度，如图3所示。以0～178μm范围内的抗坏血酸浓度为横坐标，400-420nm处的荧光强度的最大值处的荧光强度值为纵坐标构建线性曲线，如图4所示，在25～95μm范围内可以得到一个良好的线性关系，线性方程为y＝637.15+4.75c，其中y为400-420nm处的荧光强度的最大值；c为抗坏血酸浓度，单位为μm；线性相关系数为r＝0.993，检测限最低可以达到1.14μm；进而测得待测液中抗坏血酸的浓度。

实施例3

cqds/cr⁶⁺复合荧光探针溶液中cr⁶⁺浓度的选择

分别取1.0ml实施例1所制备的cqds，然后向其中分别加入不同终浓度的cr⁶⁺溶液，并加入0.6mlpbs缓冲溶液，调节ph到7.0，制得cqds/cr⁶⁺探针水溶液，10min后测定上述体系的荧光强度，如图5，从图5可以看出，利用干虾碳源制备的cqds溶液在300nm处有很强的荧光，一旦向该溶液中加入不同浓度cr⁶⁺之后，cqds的荧光便会急剧猝灭，且随着cr⁶⁺浓度的增加，荧光强度逐渐降低，当cr⁶⁺离子浓度达到140μm，体系的荧光猝灭达到60％。当cr⁶⁺浓度超过140μm，体系的荧光强度继续猝灭，但猝灭幅度不大，假如以更高浓度的cr⁶⁺离子与cqds复合构建荧光探针，则再加入aa后，将会消耗更多aa，从而导致检测aa不灵敏，因此本发明选取终浓度140μm的cr⁶⁺溶液与cqds混合得到cqds/cr⁶⁺复合荧光探针溶液用以检测aa。

实施例4

碳量子点对aa的检测机理探讨

为了研究体系荧光回升的机理，本发明继续研究了相关的荧光、紫外图谱。从图6中可以看出，碳量子点在400nm发射波长下的激发图谱(340nm波长处具有最大荧光强度)、在340nm激发波长下的发射图谱(400nm波长处具有最大荧光强度)和cr⁶⁺离子的紫外吸收图谱产生很大程度的重叠，从而可以有效的发生荧光内滤效应(ief)，所以碳量子点的荧光可以被cr⁶⁺离子而不是cr³⁺离子快速且有效猝灭。而且添加aa后，cr⁶⁺离子和加入的aa之间发生氧化还原反应生成了cr³⁺离子，因而碳量子点的荧光可以恢复。

从图7也可以看出，六价铬离子分别在270nm和372nm处有较宽的紫外特征吸收峰，当加入12.5μmaa时，372nm处的紫外峰吸光度会下降，说明此时aa已经还原了一部分的cr⁶⁺离子，从而紫外峰吸光度会减弱；当加入50μmaa时，372nm处的紫外峰完全消失不见，说明cr⁶⁺离子和足量的aa发生了氧化还原反应且cr⁶⁺离子几乎完全被还原成了cr³⁺离子，从而抑制了cr⁶⁺离子对碳量子点荧光的猝灭，并且使得碳量子点荧光恢复。

实施例5

选择性实验

一个稳定优良的荧光探针，必须有较好的选择性和抗干扰能力。为了探究此种荧光纳米材料的抗干扰能力和选择性，本发明选择了一些常见物质没食子酸(ga)、l-色胺酸(l-try)、牛血清白蛋白(bsa)、蔗糖(suc)、麦芽糖(mal)、色氨酸(trp)、尿素(uera)、硫脲(thi)、多巴胺(da)来做选择性试验。以上所有物质及aa的终浓度均为178μm，实验结果如图8所示，当往cqds/cr⁶⁺体系中加入相同浓度的生物分子时，加入aa使体系的荧光回升程度最大，并且除aa外，其他离子或生物分子对cqds/cr⁶⁺体系荧光的回升程度几乎可以忽略。综上实验结果表明，cr⁶⁺离子在猝灭cqds荧光及aa回升cqds/cr⁶⁺探针的荧光时，均具有很好的选择性和抗干扰性。

上述参照实施例对一种以虾壳为碳源的碳量子点及其制备方法和在检测抗坏血酸中的应用进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。