一种硫氧还蛋白还原酶荧光探针及其制备方法和用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于荧光探针技术领域，具体涉及一种硫氧还蛋白还原酶荧光探针及其制 备方法和用途。
【背景技术】
[0002] 硫氧还蛋白还原酶（thioredoxin reductase,TrxR)是二聚体硒酶，属于批陡核苷 酸二硫化物氧化还原蛋白酶家族成员。硫氧还蛋白还原酶、硫氧还蛋白（thioredoxin，Trx) 及还原型烟酰胺腺噪呤二核苷酸磷酸（triphosphopyridine nucleotide,NADPH)共同构成 了硫氧还蛋白系统，该系统主要作用是调节细胞内氧化还原平衡。大量研究表明硫氧还蛋 白还原酶在多种人原发性肿瘤中过表达，是肿瘤异常增生的关键调控酶，可以作为肿瘤标 志物检测其在人体内的活性，从而监测体内肿瘤的发生和发展。因此一种能特异性检测硫 氧还蛋白还原酶表达量的荧光探针有十分重要的临床意义。
[0003] 硫氧还蛋白还原酶的活性位点是碳端一段保守的序列（-Gly-Cys-Sec-Gly)，其中 Cys497，SeC498对其还原活性起到关键作用。大量文献表明，许多含有α，β-不饱和酮结 构的化合物能抑制硫氧还蛋白还原酶的活性。姜黄素作为一种被广泛研究的化合物，依赖 它结构中的α，β-不饱和酮，表现出较好的硫氧还蛋白还原酶抑制活性。其抑制作用机制 是姜黄素分子通过迈克尔加成反应共价结合到该酶的Cys497，SeC498。本课题组从事硫氧 还蛋白还原酶抑制剂的研究多年，通过大量结构的分析，发现呋喃丙烯酰结构是硫氧还蛋 白还原酶抑制的药效团。
[0004] 目前，文献报道只有一种含有环状二硫键的荧光探针分子用于检测硫氧还蛋白还 原酶。然而，该荧光探针是非共价结合的。因此一种新的能共价结合到硫氧还蛋白还原酶， 实现原位定点检测的荧光探针将会有更广泛的应用价值。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题在于提供一种可与硫氧还蛋白还原酶共价结合，具有 较高检测特异性的硫氧还蛋白还原酶荧光探针。
[0006] 本发明采用的技术方案是提供一种硫氧还蛋白还原酶荧光探针，所述荧光探针为 (E) -7-(二乙胺基）-3- (3- (5-甲基呋喃-2-基）丙烯酰）-2氢-苯并吡喃-2-酮，其结构 式为：
[0007] 本发明的目的还在于提供所述硫氧还蛋白还原酶荧光探针的制备方法，包括以下 步骤：
[0008] 步骤一 ：4_二已胺基水杨醛用溶剂溶解后，加入乙酰乙酸乙酯和哌啶，搅拌并加 热回流，冷却后过滤获得中间体化合物；
[0009] 步骤二：取所述中间体化合物，用溶剂溶解后，加入5-甲基呋喃醛及哌啶，搅拌并 加热回流，冷却后柱层析分离获得所述硫氧还蛋白还原酶荧光探针。
[0010] 本发明的目的还在于提供所述硫氧还蛋白还原酶荧光探针的用途，将所述硫氧还 蛋白还原酶荧光探针应用于检测硫氧还蛋白还原酶及同家族酶、同工酶、结构相似酶的活 性、含量。
[0011] 本发明的目的还在于提供所述硫氧还蛋白还原酶荧光探针的用途，将所述荧光探 针应用于制备硫氧还蛋白还原酶及同家族酶、同工酶、结构相似酶的检测试剂、检测试剂 盒。
[0012] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0013] (1)以呋喃丙烯酰基为药效团，以香豆素作为荧光团而设计的荧光探针，对于硫氧 还蛋白还原酶作用的专一性强。
[0014] (2)本发明荧光探针自身荧光信号很弱，与硫氧还蛋白还原酶作用后荧光显著增 强，并且，该荧光探针能与硫氧还蛋白还原酶共价结合，荧光不会被稀释，检测灵敏度高。
[0015] (3 )本发明硫氧还蛋白酶还原酶自身化学性质稳定，无自氧化作用，与目标物作用 迅速且作用后无光漂白现象。
[0016] (4)本发明所提供制备方法合成路线简单，易于制备，便于推广应用。
[0017] 本发明硫氧还蛋白还原酶荧光探针性能优异，为进一步研究细胞中硫氧还蛋白还 原酶生物学功能提供了可靠实用的工具。
【附图说明】
[0018] 图1为本发明硫氧还蛋白还原酶荧光探针检测原理示意图；
[0019] 图2为本发明实施例3中硫氧还蛋白还原酶荧光探针与硫氧还蛋白还原酶反应的 紫外可见吸收光谱图；
[0020] 图3为本发明实施例4中硫氧还蛋白还原酶荧光探针与不同浓度的硫氧还蛋白还 原酶反应的荧光发射光谱图；
[0021] 图4为本发明实施例5中硫氧还蛋白还原酶荧光探针与不同物质作用的荧光强度 变化柱状图；
[0022] 图5为本发明实施例6中硫氧还蛋白还原酶荧光探针与硫氧还蛋白还原酶及其它 含巯基化合物反应的荧光强度的动力学曲线图；
[0023] 图6为本发明实施例7中硫氧还蛋白还原酶荧光探针与待检测细胞内硫氧还蛋白 还原酶的荧光成像图。
【具体实施方式】
[0024] 下面结合具体实施例对本发明作进一步的解释说明，但具体实施例并不对本发明 作任何限定。除非特别说明，实施例中所涉及的试剂、方法均为本领域常用的试剂和方法。
[0025] 本发明实施例提供硫氧还蛋白还原酶荧光探针，所述荧光探针为含有7-二乙胺 基香豆素荧光基团和呋喃丙烯酰荧光淬灭基团的化合物（E)-7-(二乙胺基）-3-(3-(5-甲 基呋喃-2-基）丙烯酰）_2氢-苯并吡喃-2-酮，其分子结构式如下式所示：
[0026]
[0027] 其中，硫氧还蛋白还原酶荧光探针可以制备成药物学上可接受的盐；所述药物学 上可接受的盐为锂盐、钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、铁盐、铜盐、有机铵盐、盐酸盐、硫酸盐、磷酸 盐、乙酸盐、丙酸盐、乙二酸盐或柠檬酸盐；有机铵盐包括甲胺盐、乙胺盐、三乙基胺盐或N， N -二异丙基乙胺盐。
[0028] 本发明实施例硫氧还蛋白还原酶荧光探针的的制备方法，其特征在于，包括以下 步骤：
[0029] 步骤一 ：4_二已胺基水杨醛用溶剂溶解后，加入乙酰乙酸乙酯和哌啶，搅拌并加 热回流，冷却后过滤获得中间体化合物；
[0030] 步骤二：取所述中间体化合物，用溶剂溶解后，加入5-甲基呋喃醛及哌啶，搅拌并 加热回流，冷却后柱层析分离获得所述硫氧还蛋白还原酶荧光探针。
[0031] 其制备路线如下所示：
[0032]
[0033] 具体地，所述4-二已胺基水杨醛、乙酰乙酸乙酯、哌啶的质量比为1:1. 0~ 3. 5:0. 1~1. 2 ;所述中间体化合物、5-甲基呋喃醛、哌啶的质量比为1:0. 4~1. 6:0. 2~ 1. 6。步骤一中所述加热回流的温度为60~180°C，加热回流的时间为3~12小时；步骤 二中所述加热回流的温度为60~180°C，加热回流的时间为8~24小时。
[0034] 更具体地，所述硫氧还蛋白还原酶荧光探针的制备方法包括以下步骤：
[0035] 步骤一：在容器中加入4-二已胺基水杨醛，15~20ml无水乙醇溶解后，加入乙酰 乙酸乙酯及哌啶，其中4-二乙胺基水杨醛、乙酰乙酸乙酯、哌啶之间的用量比例范围为：1 : 1. 5-2. 0 :0. 2,搅拌并加热至80~KKTC，回流3~5小时，冷却后析出黄色固体，过滤得中 间体化合物3-乙醜基_7_(二乙胺基）_2氢-苯并批喃_2_酮。
[0036] 步骤二：在容器中加入中间体化合物3-乙酰基-7-(二乙胺基）_2氢-苯并吡 喃-2-酮，用15~20ml无水乙醇溶解后，加入5-甲基呋喃醛及哌啶，其中中间体化合物、 5-甲基呋喃醛、哌啶之间的用量比例范围为：1:1:1，搅拌并加热至80~KKTC，回流8~ 10小时。冷却后，通过层析柱分离的目标化合物（E)-7-(二乙胺基）-3-(3-(5-甲基呋 喃-2-基）丙烯酰）_2氢-苯并吡喃-2-酮。
[0037] 本发明硫氧还蛋白还原酶突光探针能抑制硫氧还蛋白还原酶，对硫氧还蛋白还原 酶有较高的抑制活性，通过DTNB法测得其体外抑制硫氧还蛋白还原酶的IC5tl为0. 52 μ M。
[0038] 硫氧还蛋白还原酶荧光探针，基于以呋喃丙烯酰基为药效团，以香豆素作为荧光 团，对于硫氧还蛋白还原酶作用的专一性强，并且，所述硫氧还蛋白还原酶荧光探针能与硫 氧还蛋白还原酶共价结合，荧光不会被稀释。因此，所述硫氧还蛋白还原酶荧光探针能用通 过其荧光的变化检测硫氧还蛋白还原酶含量，可应用于生理条件下硫氧还蛋白还原酶的荧 光检测。
[0039] 将硫氧还蛋白还原酶荧光探针用于检测硫氧还蛋白还原酶，其方法依赖于以下的 作用反应机制：7_二乙胺基香豆素作为荧光团，呋喃丙烯酰基作为荧光淬灭基团；富电子 的7-二乙胺基中的电子通过分子内电子转移（ICT)转移至缺电子的呋喃丙烯酰基，从而荧 光处于淬灭状态；当荧光探针通过迈克尔加成共价结合到硫氧还蛋白还原酶上的巯基和硒 巯基，α，β-不饱和酮结构被破坏，分子内电子转移过程被破坏，探针分子发射荧光。其反 应过程如图1所示。
[0040] 因此，本发明中还提供一种硫氧还蛋白还原酶荧光探针的用途，将所述硫氧还蛋 白还原酶荧光探针用于检测硫氧还蛋白还原酶及同家族酶、同工酶、结构相似酶的活性或 含量。硫氧还蛋白还原酶荧光探针可用于检测磷酸盐缓冲液中的硫氧还蛋白还原酶，或检 测活体肿瘤细胞中硫氧还蛋白还原酶，还可以将所述硫氧还蛋白还原酶荧光探针制备成药 物学上可接受的盐。作为一种优选方案，所述药物学上可接受的盐包括锂盐、钠盐、钾盐、钙 盐、镁盐、铁盐、铜盐、有机铵盐、盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、乙酸盐、丙酸盐、乙二酸盐、柠檬酸 盐等，有机铵盐包括甲胺盐、乙胺盐、三乙基胺盐、N，N -二异丙基乙胺盐等。
[0041] 以下通过实施例对本发明做进一步说明。
[0042] 实施例1硫氧还蛋白还原酶荧光探针的制备
[0043]
[0044] 将Ig的4-二乙胺基水杨醒（5. 17mmol)和I. 35g的乙酰乙酸乙酯4-二乙胺基水 杨醒（10. 38mmol)溶解在20ml无水乙醇中，加入100 μ 1哌陡作为催化剂。反应液加热回 流5