专利名称：一种高效表达高温元素硫氧化还原酶基因的方法
技术领域：
本发明涉及一种高效表达高温元素硫氧化还原酶基因的方法。
在地球的一些高温酸热地域，如火山口附近，酸热泉，以及一些矿区分布着能够仅依靠代谢硫获得其生存能量的微生物。由于这种特性，使得它们在生物冶金、煤炭脱硫以及环境保护等方面有着重要的应用前景。但是由于这些高温化能自养微生物在自然的状况下生长较慢，生物量低，对硫的氧化活性很有限，并且大多数对重金属离子的抗性较低，因此直接应用此类微生物于工业生产中存在着很多困难。为了更好地利用它们的元素硫氧化特性，采用基因工程的手段使高温元素硫氧化还原酶大量合成，是一种有效的解决方法。经过研究，本发明的发明人从嗜酸两面菌属的Acidianus tengchongensis S-5(有关该菌的详细报道见钟慧芳等《微生物学报》22(1)1-7，1982)中克隆到了高温元素硫氧化还原酶基因(其核苷酸序列如
图1所示)，但这只是解决问题的一个方面，如何使此类异常环境微生物的元素硫氧化还原酶基因能够在普通条件下高效表达，是目前亟待解决的问题。
本发明的目的是提供一种在普通条件下高效表达高温元素硫氧化还原酶基因的方法。
为实现上述目的，本发明采取以下设计方案一种高效表达高温元素硫氧化还原酶基因的方法，其特征在于所述高温元素硫氧化还原酶基因在大肠杆菌受体中表达。
所述使高温元素硫氧化还原酶基因在大肠杆菌受体中表达包括以下步骤(1)、构建基因表达载体并转化感受态大肠杆菌受体细胞；(2)、高温元素硫氧化还原酶基因在大肠杆菌受体中表达。
所述构建的基因表达载体是包含高温元素硫氧化还原酶基因功能片段，并能在大肠杆菌中表达的DNA。
所述高温元素硫氧化还原酶基因功能片段是利用下述引物通过PCR得到的PA5-ACA GAA TTC AT ATG CCT AAA CCT TAC-3PB5-CGC GGA TCC TTA AAA AAT TTA CTC GTT-3所述构建的基因表达载体是将高温元素硫氧化还原酶基因功能片段的EcoR I/BamH I双酶切产物与载体质粒共连接。载体质粒可以用pBV220。
大肠杆菌受体可以用E.coli BL21、HB101或JM109。
大肠杆菌具有表达量高、成本低等优势，本发明应用基因工程技术使高温元素硫氧化还原酶基因在普通条件下在大肠杆菌中得到高效表达，表达的酶蛋白量高达细胞总蛋白的8％左右。本发明的技术在矿冶工业、煤炭工业及环境保护等方面具有广泛的应用前景。
下面结合附图对本发明的实施例作进一步说明。
图1为Acidianus tengchongensis S-5的高温元素硫氧化还原酶核苷酸序列实施例1高温元素硫氧化还原酶基因的高效表达包括以下步骤；1、表达载体的构建(1)、根据
图1所示的核苷酸序列N和C末端设计一对引物PA5-ACA GAA TTC AT ATG CCT AAA CCT TAC-3PB5-CGC GGA TCC TTA AAA AAT TTA CTC GTT-3(2)、用Pfu DNA聚合酶(华美生物工程公司产品)对Acidianustengchongensis S-5总DNA进行PCR扩增，反应条件为退火温度50℃ 1分钟，延伸温度72℃ 2分钟，变性温度94℃ 1分钟，共30循环。
(3)、获得的PCR产物用EcoRI和BamHI酶双切，同时载体pBV220张智清等，病毒学报，6111，(1990)也用此酶双切，然后将双切后的PCR产物和载体pBV220进行共连接，得到表达载体pBV220SOR。载体上克隆的硫氧化还原酶基因的序列正确性可以通过测序来证实。
2、表达受体的选择采用E.coli BL21(DE3)为表达受体3、高温元素硫氧化还原酶基因的表达(1)、将质粒pBV220SOR转化感受态大肠杆菌E.coli BL21(DE3)受体细胞。
(2)、在含氨苄青霉素(100ug ml-1)的LB液体培养基中30℃ 200rpm摇床培养至OD6002-3后升温至42℃开始诱导表达3.5小时，这时表达的酶蛋白量约占细胞总蛋白的8％左右。
(3)、然后5000转/分离心收集菌体，用100w超声波处理5分钟以破碎细胞，再5000转/分离心除去残渣后，上清液70℃处理15分钟。
(4)、将上述处理后的上清液12000转/分离心除去沉淀，上清液中含有高温元素硫氧化还原酶可达30％以上。
4.酶活测定酶活测定按A.Kletzin(1988)的方法或者采用Merck公司的SO32-和H2S测定试剂盒进行，其结果为SO32-＋S2O32-为753U/mg；H2S为45.2U/mg。
实施例2与实施例1的步骤相同，只是表达受体用E.coli HB101；载体用pUC18(华美生物工程公司产品)。
实施例3与实施例1的步骤相同，只是表达受体用E.coli JM109。
权利要求
1.一种高效表达高温元素硫氧化还原酶基因的方法，其特征在于所述高温元素硫氧化还原酶基因在大肠杆菌受体中表达。
2.根据权利要求1所述的高效表达高温元素硫氧化还原酶基因的方法，其特征在于所述使高温元素硫氧化还原酶基因在大肠杆菌受体中表达包括以下步骤(1)、构建基因表达载体并转化感受态大肠杆菌受体细胞；(2)、高温元素硫氧化还原酶基因在大肠杆菌受体中表达。
3.根据权利要求2所述的高效表达高温元素硫氧化还原酶基因的方法，其特征在于所述构建的基因表达载体是包含高温元素硫氧化还原酶基因功能片段，并能在大肠杆菌中表达的DNA。
4.根据权利要求3所述的高效表达高温元素硫氧化还原酶基因的方法，其特征在于所述高温元素硫氧化还原酶基因功能片段是利用下述引物通过PCR得到的PA5-ACA GAA TTC AT ATG CCT AAA CCT TAC-3PB5-CGC GGA TCC TTA AAA AAT TTA CTC GTT-3
5.根据权利要求3所述的高效表达高温元素硫氧化还原酶基因的方法，其特征在于所述构建的基因表达载体是将高温元素硫氧化还原酶基因功能片段的EcoR I/BamH I双酶切产物与载体质粒共连接。
6.根据权利要求5所述的高效表达高温元素硫氧化还原酶基因的方法，其特征在于所述载体质粒为pBV220。
7.根据权利要求1-6中任何一项所述的高效表达高温元素硫氧化还原酶基因的方法，其特征在于所述大肠杆菌受体为E.coli BL21。
8.根据权利要求1-6中任何一项所述的高效表达高温元素硫氧化还原酶基因的方法，其特征在于所述大肠杆菌受体为HB101。
9.根据权利要求1-6中任何一项所述的高效表达高温元素硫氧化还原酶基因的方法，其特征在于所述大肠杆菌受体为JM109。
全文摘要
本发明公开了一种高效表达高温元素硫氧化还原酶基因的方法,以使高温元素硫氧化还原酶能够在普通条件下进行大量生产,本发明的技术方案是使高温元素硫氧化还原酶基因在大肠杆菌受体中表达,即构建基因表达载体并转化感受态大肠杆菌受体细胞,使该基因在大肠杆菌受体中表达;本发明应用基因工程技术使高温元素硫氧化还原酶基因在普通条件下在大肠杆菌中得到高效表达,在矿冶、煤炭及环境保护等方面均具有重要意义。
文档编号C12N15/53GK1331341SQ00109509
公开日2002年1月16日 申请日期2000年6月29日 优先权日2000年6月29日
发明者何正国, 李雅芹, 周培瑾 申请人:中国科学院微生物研究所