专利名称：表面活性剂产生菌-菌根联用修复土壤多环芳烃的方法
技术领域：
本发明涉及ー种利用表面活性剂产生菌和菌根联用修复土壤中多环芳烃的技木，属于环境修复、污染物处理领域。
背景技术：
随着煤、石油在エ业生产、交通运输以及生活中被广泛应用，多环芳烃(PAHs)已成为世界各国共同关注的有机污染物。我国政府已经列出7种PAHs干“中国环境优先污染物黑名单”中。由于其化学结构特殊，PAHs类污染物很容易在生物体内富集，具有较高的生物毒性。但这类污染物在土壌中附着性强，难以清除和降解，因此PAHs在土壌中的积累已经越来越严重的威胁着农业生产、食品安全、以及人类的健康。用于有机物污染的土壤修复的方法有多种，其中植物修复由于具有成本低、无ニ次污染和适用于大面积场地修复的优点，而被视为最有前途的方法。但是，越来越多的研究表明，土壤中有机污染物的植物修复效果取决于根际植物-微生物相互作用。丛枝菌根真菌(AMF)是专性营养微生物，可以和地球上90%以上的植物形成共生体。它可以促进植物对营养和水分的吸收，提高寄主植物对土壤有机污染胁迫的耐受性，并对根际土壤中的微生物的组成和活动产生影响。菌根修复正在成为土壤有机污染物修复方法中ー个新兴的领域。近年来的研究表明，菌根根际对有机污染土壌的植物修复具有更好的促进效果，而且发现菌根真菌能够从受污染的土壌中吸收和积累PAHs。但是，土壌基质对PAHs具有很强的亲和作用，严重束缚了有机污染物在土壌中的迁移，从而严重限制了根际修复效果。因此，化学表面活性剂已被尝试用于促进PAHs的土壤迁移和植物修复。但是这种方法有可能引入二次污染，因而受到较广泛的争议。生物表面活性剂因具有效率高，无毒性，易降解等优点，而在有机污染土壌的修复研究领域受到了越来越多的关注。近期的研究表明，生物表面活性剂可以通过增溶和乳化作用，促进土壤中PAHs的解离，增强其向根际的迁移，从而使得污染物能更好的被生物降解。然而，生物表面活性剂由于成本高昂、易被降解等缺点，使得其在土壤有机物的实际修复中难以被大規模应用。因此，向根际环境中引入能产生生物表面活性剂的微生物，通过其不断地合成并分泌表面活性剤，促进污染物的土壤迁移，是增强菌根修复效果的ー种有效手段。向实际环境中引入表面活性剂产生菌已经得到了较为广泛的应用。枯草芽孢杆菌菌株汉subtilis BSl是从土壤中分离出的表面活性剂产生菌，具有高效的生产环脂肽类表面活性剂surfactin的能力。表面活性剂surfactin对解离有污染物有着显著的效果。本发明针对目前植物修复或者菌根修复所面临的实际瓶颈，通过将生物表面活性剂surfactin的高产菌株枯草芽孢杆菌汉subtilis BSl和AMF相结合，充分发挥了两者的功能和特性'B. subtilis BSl作为生物表面活性剂的供体，能够增强有机污染物向根际 的迁移；AMF增强植物对有机污染物的亲和与吸收效果，提高植物对有机污染物毒性胁迫的耐受性，同时增强根际微生物的代谢活性。该专利通过AMF和汉subtilis BSl联合使用，建立了新型的高效集成修复技术，提高土壤中PAHs的修复效率，缩短修复时间，具有很强的实际应用价值。
发明内容
本发明的目的在于通过向植物根际引入生物表面活性剂高效产生菌——枯草芽孢杆菌汉subtilis BS1，促进PAHs向植物根际的迁移，并利用植物共生真菌AMF提高植物对污染毒理胁迫的耐受能力，增强根际修复活力，从而构建“表面活性剂产生菌-菌根联用”的新型高效的集成修复方法，实现土壌中PAHs经济、快速、高效的清除。本发明的技术方案如下 表面活性剂产生菌-菌根联用修复土壌多环芳烃的方法，按照下述步骤进行
(I)枯草芽孢杆菌汉subtilis BSl的扩增培养
将枯草芽孢杆菌汉subtilis BSl用酵母膏蛋白胨液体培养基，于30 °C，转速180 rpm条件下进行培养，当菌体生长到对数生长期后期时收集菌体，制备种子液。(2)枯草芽孢杆菌汉BSl菌剂制备
将步骤(I)所得的种子液在发酵罐中扩大培养，发酵温度30 °C，初始pH值7. 2，26^28h即得液体菌剂；按照质量比草炭土 45%，活性炭30%，锯末10%，稻壳15%配置载体，并经风干研磨,过60目筛，混合均匀制成固体载体，灭菌风干,按照液体菌剂与固体载体按质量比例I :1混合均匀即得BSl固体菌剂。(3) AMF菌剂的制备
将菌根真菌以OSMZ1S etunicatum用]X) mM朽1檬酸钠以I: 10 (v: v)的体积混合溶解其中的植物凝胶，然后将提取其中的真菌孢子；将河砂过60目筛，与田园土按2 1的比例混合均匀，灭菌，盛于花盆中；在砂土混合基质上接种获得的孢子，同时种植玉米，适当浇灌霍格兰营养液，60天后将收获AMF菌剂。(4) PAHs污染土壌的表面活性剂产生菌-菌根联用修复
在被PAHs污染的土壤中，先将步骤(3)中的AMF菌剂混入土壤中，然后种植ー棵玉米；待玉米幼苗高度约30 cm吋，将步骤(2)中的BSl固体菌剂接种在玉米的根际，使得根际的菌浓达到IXlO5CFU/每克土壌；待玉米完成生长周期后，即可达到修复土壌多环芳烃的目的。其中步骤(I)中所述的酵母膏蛋白胨液体培养基成分如下胰蛋白胨10 g/L，酵母膏提取物5 g/L，氯化钠10 g/L，其余为水。本项目通过向植物根际引入生物表面活性剂产生菌，促进疏水性有机污染物向植物根际的迁移，并利用植物共生菌AMF提高植物对污染毒理胁迫的耐受能力，增强根际修复活力，从而构建“表面活性剂产生菌-菌根联用”的新型高效的集成修复方法，实现土壌中疏水有机污染物经济、快速、高效的清除。
图I为本发明表面活性剂产生菌-菌根联用修复土壤多环芳烃的方法的エ艺流程图。
图2为 不同程度菲污染下接种BSl菌剂和AMF菌剂对根际土壤过氧化氢酶活性的影响(mean土 SE，n=3) ；CK为对照组；BS为BSl处理组；GE为AMF处理组；BS+GE为BSl和AMF联合处理组。图3 为不同程度菲污染下接种BSl菌剂和AMF菌剂对根际土壤多酚氧化酶活性的影响(mean土 SE，n=3) ；CK为对照组；BS为BSl处理组；GE为AMF处理组；BS+GE为BSl和AMF联合处理组。图4为不同程度菲污染下接种BSl菌剂和AMF菌剂对根际土壤中菲含量的影响(mean土SE，n=3)。CK为对照组；BS为BSl处理组；GE为AMF处理组；BS+GE为BSl和AMF联合处理组。
具体实施例方式本发明枯草芽孢杆菌B. subtilis BSl购置于镇江维赛生物科技发展有限公司。
菌根真菌Glomus etunicatum购于比利时菌根真菌体外菌种保藏中心(Giomeromycota In vitro Collection, GINCO)。由于多环芳烃根据不同苯环数目，可有分为很多种类。以下以菲的降解作为具体实施例，其过程如图I所示
权利要求
1.表面活性剂产生菌-菌根联用修复土壌多环芳烃的方法，其特征在于按照下述步骤进行 (1)枯草芽孢杆菌汉SUbtilisBSl的扩增培养 将枯草芽孢杆菌汉subtilis BSl用酵母膏蛋白胨液体培养基，于30 °C，转速180 rpm条件下进行培养，当菌体生长到对数生长期后期时收集菌体，制备种子液； (2)枯草芽孢杆菌汉subtilisBSl菌剂制备 将步骤(I)所得的种子液在发酵罐中扩大培养，发酵温度30 °C，初始pH值7. 2，26^28h，即得液体菌剂；按照质量比草炭土 45%，活性炭30%，锯末10%，稻壳15%配置载体，并经风干研磨,过60目筛，混合均匀制成固体载体，灭菌风干,按照液体菌剂与固体载体按质量比例I :1混合均匀即得BSl固体菌剂； (3)AMF菌剂的制备 将菌根真菌以OSMZ1S etunicatum觅10 mM朽1檬酸钠以I: 10的体积比混合溶解其中的植物凝胶，然后将提取其中的真菌孢子；将河砂过60目筛，与田园土按2 1的比例混合均匀，灭菌，盛于花盆中；在砂土混合基质上接种获得的孢子，同时种植玉米，适当浇灌霍格兰营养液，60天后将收获AMF菌剂； (4)PAHs污染土壌的表面活性剂产生菌-菌根联用修复 在被PAHs污染的土壤中，先将步骤(3)中的AMF菌剂混入土壤中，然后种植ー棵玉米；待玉米幼苗高度约30 cm吋，将步骤(2)中的BSl固体菌剂接种在玉米的根际，使得根际的菌浓达到IXlO5CFU/每克土壌；待玉米完成生长周期后，即可达到修复土壌多环芳烃的目的。
2.根据权利要求I所述的表面活性剂产生菌-菌根联用修复土壌多环芳烃的方法，其特征在于其中步骤(I)中所述的酵母膏蛋白胨液体培养基成分如下胰蛋白胨10 g/L，酵母膏提取物5 g/L，氯化钠10 g/L，其余为水。
全文摘要
本发明表面活性剂产生菌-菌根联用修复土壤多环芳烃的方法,属于环境修复、污染物处理领域。针对目前植物修复或者菌根修复所面临的实际瓶颈，通过将生物表面活性剂surfactin的高产菌株枯草芽孢杆菌B.subtilisBS1和AMF相结合，充分发挥了两者的功能和特性B.subtilisBS1作为生物表面活性剂的供体，能够增强有机污染物向根际的迁移；AMF增强植物对有机污染物的亲和与吸收效果，提高植物对有机污染物毒性胁迫的耐受性，同时增强根际微生物的代谢活性。该专利建立了新型的高效集成修复技术，提高土壤中PAHs的修复效率，缩短修复时间，具有很强的实际应用价值。
文档编号B09C1/10GK102652957SQ20121014055
公开日2012年9月5日 申请日期2012年5月8日 优先权日2012年5月8日
发明者司春灿, 曹丹鸣, 杜道林, 林英, 王明娜, 肖翔 申请人:江苏大学