专利名称：钩杆菌属Tet-1及其在微生物降解胺菊酯中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株胺菊酯降解菌-钩杆菌属(Ancylobacter sp. ) Tet-1,及其在
微生物降解胺菊酯中的应用。
背景技术：
在过去的几十年，拟除虫菊酯类农药凭借其高效、低毒、低抗性、广谱性等众多独特的优点，跻身成为现代使用农药中最主要的成员，约占世界杀虫剂市场30%的份额。随着对有机磷杀虫剂使用的限制，拟除虫菊酯类杀虫剂的用量会越来越大。然而，很多报道已经表明，拟除虫菊酯类农药会过高的残留在蔬菜、茶叶等经济作物上，引发了一系列的食品安全问题。胺菊酯是拟除虫菊酯的一种，属于强力合成杀虫剂，对蚊、蝇等卫生害虫具有快速击倒效果，但致死性能差，有复苏现象，因此多与其它杀虫效果好的药剂混配使用。胺菊酯以其低毒性的优势，被广泛应用在杀虫剂中，该药为世界卫生组织推荐用于公共卫生的主要杀虫剂之一。由于其结构稳定，使用后很难降解，导致会残留于环境，环境中残留的胺菊酯会通过地表泾流等作用进入水体，从而危害水生生物。胺菊酯的化学结构和化学性质都比较稳定，若用物理、化学的方法去除，处理成本较高，且有害副产品较多，而微生物对胺菊酯的代谢具有独特的作用。用微生物代谢的方法降解胺菊酯，不仅成本低而且减少了可以有效减少二次污染，因此有着广阔的应用前景。而且，微生物是一类种类多、繁殖快、适应性强、代谢能力强的生物体。因此，若能筛选分离出能有效降解胺菊酯的微生物，对降低胺菊酯在环境中的含量，保护环境有着深远的意义。
发明内容
本发明目的是提供一株新的胺菊酯降解菌-钩杆菌属(Ancylobacter sp.)
Tet-1，及其在微生物降解胺菊酯中的应用。本发明采用的技术方案是钩杆菌属(Ancylobacter sp. ) Tet-1,保藏于中国典型培养物保藏中心,地址中国，武汉，武汉大学，保藏日期为2012年9月27日，保藏编号为CCTCC No M 2012387。本发明从农药厂的活性污泥中获得一系列菌株，经分离纯化后，得到一株能够有效降解胺菊酯的菌株，命名为Tet-Ι。将菌株Tet-1测得的16S rDNA序列(Genbank登陆号为JX878618)在GenBank和RDP数据库中进行BLAST比对分析，将其鉴定为Ancylobacter属(Ancylobacter sp.)。实验结果表明Tet_l能以胺菊酯为唯一碳源生长,培养7d后，Tet-1菌株对50mg/L的胺菊酯的降解率为54. 0%。目前尚无利用污泥中分离的菌株降解胺菊酯的文献报道，而本发明能高效降解解胺菊酯，利用该菌株有效降解解胺菊酯，为其在生物修复中的应用提供一定的理论基础。
本发明钩杆菌属Tet-1 (CCTCC No M 2012387)菌株的筛选与鉴定I)培养基
无机盐培养液终浓度组成为每升培养液中含有NaCl lg, K2HPO41. 5g，KH2PO4O. 5g, (MM)2SO41. 5g, MgSO4 O. lg，Iml微量元素溶液，溶剂为水，自然pH值，高压蒸汽灭菌(12rC，20min)后制得，其中每升微量元素溶液中含MnSO4 · H2O O. 13g, ZnCl2 O. 23g,CuSO4 · H2O O. 03g，CoCl2 · 6H20 0. 42g，Na2MoO4 · 2H20 0. 15g，AlCl3 · 6H20 0. 05g，溶剂为水。富集培养液在无机盐培养液中加入胺菊酯，使得胺菊酯的终浓度为100 mg/L。LB液体培养基每升培养液中含有酵母粉10g，蛋白胨5.0g，氯化钠lO.Og，溶剂为水，自然PH值，高压蒸汽灭菌(12rC，20min)后制得。LB固体培养基每升培养中含有酵母粉10g，蛋白胨5.0g，氯化钠10. 0g，琼脂15. Og,溶剂为水，自然pH值，高压蒸汽灭菌(121。。，20min)后制得。
2)菌株分离纯化污泥样品采自杭州农药厂，取5 g污泥样品置于250ml锥形瓶中，加入IOOml富集培养液，黑暗振荡培养(30°C，150rpm)l周，取5ml上层浊液于新鲜的富集培养液100 ml中，继续黑暗振荡培养(30°C，150rpm) I周，重复上述操作过程3次，每次培养的接种物均取自于上次培养所得的培养液。取最后一次培养所得的培养液5 ml进行梯度稀释(10_4、10_5、10_6)，取各个稀释后的培养液150 μ I涂布于含50 mg/L胺菊酯的LB固体培养基平板上,置于恒温培养箱(30°C)中培养，待平板上长出菌落后，挑取各菌落于含50 mg/L胺菊酯的LB固体培养基平板上反复纯化，直至菌落单一，将纯化后的各菌落分别接至LB液体培养基试管中振荡培养(30°C，150rpm)过夜，将培养好的菌液离心(6000rpm，5min)后接至富集培养液中30°C培养7 d，通过高效液相色谱法(HPLC)检测各富集培养液中胺菊酯的残留量，最后筛选获得一株能高效降解胺菊酯的菌株，命名为Tet-1。3)菌株鉴定将上述获得的菌株进行形态特征和分子生物学鉴定，该菌株的电镜照片如图1所示。该菌株的主要生物学特征为革兰氏染色反应阴性，菌体杆状，有弯曲，无鞭毛，直径约为0.7 1. 2 μ m，菌落平滑，呈白色.。该菌株最适宜的生长条件为pH值7.0，温度30°C。该菌株经16S rDNA序列分析鉴定为Ancylobacter属，因此命名为为钩杆菌属Tet-1(Ancylobacter sp. Tet_l)。本发明还涉及所述的钩杆菌属Tet-1在微生物降解胺菊酯中的应用。具体的，所述降解在20 40pH 4.0 10. O、黑暗条件下进行，一般需振荡培养。优选的，所述降解在30°C、pH 7. 0、150rpm、黑暗条件下进行。在胺菊酯终浓度为50 mg/L的无机盐培养液中，加入含钩杆菌属Tet-1的细胞悬液构成反应体系，在20 40 pH 4.0 10.0下黑暗振荡培养7 d左右，可使反应液中胺菊酯的质量残留量小于50% ;所述含钩杆菌属Tet-1的细胞悬液加入量为使反应体系中钩杆菌属Tet-1终浓度为I X IO7 5 X IO7个/ml。实际应用中，所述菌株通常需要经过活化和扩大培养，具体过程如下(I)斜面活化将钩杆菌属Tet-1接种于斜面培养基，25 45°C培养5 7天，获得菌体斜面；所述斜面培养基的终浓度组成为酵母粉10g/L，蛋白胨5. 0g/L，氯化钠10. Og/L，琼脂15. 0g/L，溶剂为水；(2)种子培养从步骤(I)菌体斜面上挑取一接种环菌体接种至无机盐培养液中，25 45°C培养5 7天，获得种子液；所述无机盐培养液终浓度组成为每升培养液中含有 NaCl lg, K2HPO41. 5g, KH2PO4 O. 5g, (MM)2SO41. 5g, MgSO4 O. lg，Iml 微量元素溶液，溶剂为水，自然pH值，高压蒸汽灭菌(121°C，20min)后制得，其中每升微量元素溶液中含MnSO4 ·Η20 O. 13g, ZnCl2 O. 23g, CuSO4 ·Η20 O. 03g, CoCl2 ·6Η20 O. 42g, Na2MoO4 ·2Η20 O. 15g,AlCl3 · 6Η20 O. 05g，溶剂为水；(3)扩大培养将步骤(2)获得的种子液以体积浓度1(Γ20%的接种量接种至LB液体培养基中，30 0C、150rpm振荡养至对数生长期，获得菌液，将菌液离心，弃上清，沉淀用pH值为7. O的磷酸缓冲液悬浮，获得含钩杆菌属Tet-1的细胞悬液，该细胞悬液可投加于水体中用于胺菊酯的降解；所述LB液体培养基终浓度组成为每升培养中含有酵母粉10g，蛋白胨5. Og，氯化钠10. Og，溶剂为水，自然pH值。本发明菌体生长量采用紫外分光光度计来检测，通过测量菌体(即含菌细胞培养液)在600nm处的吸光度值来表示。
本发明采用反相高效液相色谱法检测无机盐培养液中胺菊酯的残留量。反相高效液相色谱检测条件Grace Alltima C18 Column (4. 6 mmX250 mm, 5 Pm),流动相为甲醇水=95 5 (体积比)，流速为0.9 mL/min，柱温为25 °C，进样量为20 μ L。与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在本发明所述钩杆菌属Tet-1可通过直接投加的方式应用于水体中胺菊酯的降解，能安全、高效、快速的降解水体中残留的胺菊酯，含有该菌株的菌剂制备工艺简单，成本低廉，使用方便，具有很好的应用前景。
图1为本发明胺菊酯降解菌的电镜图；图2为胺菊酯的标准曲线图；图3为本发明的胺菊酯降解菌在纯培养条件下对浓度为50mg/L的胺菊酯的降解曲线图和胺菊酯降解菌在胺菊酯浓度为50mg/L纯培养条件下的生长曲线图。图4为本发明的胺菊酯降解菌在不同pH条件下对浓度为50mg/L的胺菊酯的降解曲线图；图5为本发明的胺菊酯降解菌在不同温度条件下对浓度为50mg/L的胺菊酯的降解曲线图。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例1 :菌株的筛选与鉴定I)培养基无机盐培养液=NaCllg, K2HPO41. 5g，KH2PO4 O. 5g，(MM)2SO41. 5g，MgSO4 O. lg,Iml微量元素溶液，蒸馏水补足至1000ml，混合后搅拌均匀，自然pH值，高压蒸汽灭菌(12rC，20min)后制得，其中每升微量元素溶液中含MnSO4 · H2O O. 13g, ZnCl2 O. 23g,CuSO4 · H2O O. 03g, CoCl2 · 6H20 0. 42g, Na2MoO4 · 2H20 0. 15g, AlCl3 · 6H20 0. 05g，用蒸馏水补足至1000ml。富集培养液在无机盐培养液中加入胺菊酯溶液，使得胺菊酯的浓度为100 mg/L。LB培养液酵母粉IOg,蛋白胨5. Og,氯化钠10. Og,蒸懼水补足至1000ml,混合后搅拌均匀，自然PH值，高压蒸汽灭菌(121°C，20min)后制得。LB固体培养基酵母粉10g，蛋白胨5. Og,氯化钠10. Og,琼脂15. Og,蒸馏水补足至1000ml,混合后搅拌均勻，自然pH值,高压蒸汽灭菌(121°C, 20min)后制得。2)菌株分离纯化污泥样品采自杭州农药厂，取5 g污泥样品置于250ml锥形瓶中，加入IOOml富集培养液，黑暗振荡培养(30°C，150rpm)l周，取5ml上层浊液于新鲜的富集培养液中，继续黑暗振荡培养(30°C，150rpm) I周，重复上述操作过程3次，每次培养的接种物均取自于上次 培养所得的培养液。取最后一次培养所得的培养液少许进行梯度稀释，取稀释后的培养液150 μ I涂布于含50mg/L胺菊酯的LB固体平板上,置于恒温培养箱(30°C )中培养，待平板上长出菌落后，挑取各菌落于LB固体平板上反复纯化，直至菌落单一，将纯化后的各菌落分别接至LB液体试管中振荡培养(30°C，150rpm)过夜，将培养好的菌液离心后接至富集培养液中培养7d，通过高效液相色谱法(HPLC)检测各富集培养液中胺菊酯的残留量，最后筛选获得一株能高效降解胺菊酯的菌株，命名为Tet-1 (CCTCC No M 2012387)。3)菌株鉴定将上述获得的菌株进行形态特征和分子生物学鉴定，该菌株的电镜照片如图1所示。该菌株的主要生物学特征为革兰氏染色反应阴性，菌体杆状，有弯曲，无鞭毛，直径约为O. 7 1.2 μ m，菌落平滑，呈白色。该菌株最适宜的生长条件为pH值7.0，温度30°C。该菌株经16S rDNA序列分析鉴定为Ancylobacter属。实施例2 :含菌细胞悬液的制备(I)斜面培养将钩杆菌属Tet-1接种于斜面培养基，30°C培养6天，获得菌体斜面；所述斜面培养基的终浓度组成为酵母粉10g，蛋白胨5. 0g，氯化钠10. 0g，琼脂15. Og,水 IOOOrnl ；(2)种子培养从步骤(I)菌体斜面上挑取一接种环菌体接种至无机盐培养液中，30°C培养6天，获得种子液；所述无机盐培养液终浓度组成同实施例1 ;(3)扩大培养将步骤(2)获得的种子液以体积浓度1(Γ20%的接种量接种至LB液体培养基(100 mL)中，30°C、150rpm振荡培养至对数生长期，获得菌液，将菌液离心(6000rpm, 5min),弃上清，沉淀用pH值为7. O的磷酸缓冲液悬浮，获得含钩杆菌属Tet-1细胞悬液100 mL，其中细胞悬液中的钩杆菌属Tet-1浓度为0. 2 1X109个/ml ;所述LB液体培养基终浓度组成同实施例1 ;pH为7. O的0. 2 mol/L的磷酸缓冲液的配方为取0. 2 mol/L的磷酸二氢钠39ml和0. 2mol/L的磷酸氢二钠61ml,用超纯水定容至1000ml,高压蒸汽灭菌(121°C、20min)后即得。实施例3 :胺菊酯降解实验I)无机盐培养液中菌体浓度与胺菊酯含量的检测菌体生长量采用紫外分光光度计来检测，通过测量培养液中菌体在600nm处的吸光度值来表不。
本实验采用反相高效液相色谱法检测无机盐培养液中胺菊酯的残留量。反相高效液相色谱检测条件Grace Alltima C18 Column (4. 6 mm X 250 mm, 5 Pm),流动相为甲醇水=95 5 (体积比)，流速为0.9 mL/min，柱温为25 °C，进样量为20 μ L。2)胺菊酯降解实验取5个250ml锥形瓶，均加入IOOml无机盐培养液，高压蒸汽灭菌(121°C，20min)后加入胺菊酯，使胺菊酯浓度均为50 mg/L,各取实施例2方法获得的含菌细胞悬液5ml，分别接种于此无机盐培养液中，使钩杆菌属Tet-1终浓度为1 5Χ107个/ml，分别于20，25，30,35,40。(!'培养摇床(pH 7. 0,150rpm ),每天定时取样测定残留胺菊酯浓度，结果见图·5。取6个250ml锥形瓶，均加入IOOml无机盐培养液，高压蒸汽灭菌(121°C，20min)后加入胺菊酯，使胺菊酯浓度均为50 mg/L,各取实施例2方法获得的含菌细胞悬液5ml，分别接种于此无机盐培养液中，使钩杆菌属Tet-1终浓度为1 5X IO7个/ml，分别于pH 4. 0，
6.0,7. 0,8. 0,9. 0,10. O培养摇床(30°C，150rpm )，每天定时取样测定残留胺菊酯浓度，结果见图4。取250ml锥形瓶，加入IOOml无机盐培养液，高压蒸汽灭菌(121°C，20min)后加入胺菊酯，使胺菊酯浓度为50 mg/L,取实施例2方法获得的含菌细胞悬液5ml，接种于此无机盐培养液中，使钩杆菌属Tet-1终浓度为1飞X IO7个/ml，相应的设置I个不含该菌种的实验作为空白对照，然后一同置于摇床(301，？!17.0，150印111 )中黑暗振荡培养。在培养时间为0、l、2、3、4、5、6、7d时定时取样，检测无机盐培养液中菌体的生长量与胺菊酯的残留量，结果见图3。将胺菊酯标准品(浓度100 mg/L)用无菌水溶解，在反相液相色谱测试标准曲线，胺菊酯标准曲线如图2所示，标准曲线方程为(y = 13. 63x + 7.384，R2 = 0.999，y为峰面积，X为胺菊酯浓度)。本发明菌株对50 mg/L浓度的胺菊酯的降解曲线和菌体的生长曲线如图3所示，可以看出0D600从O. 02增加到O. 45，说明菌体生长良好。观察图3，可以发现，培养7 d后，本发明的胺菊酯降解菌对50 mg/L的胺菊酯的降解率为54±0.9%，所有未加菌的空白对照在7 d后的水解率均小于5%。图4和图5表明该菌株最适宜的降解条件为pH 值 7.0，温度 30。。。实验结果表明该菌种对浓度50 mg/L的胺菊酯具有较好的降解能力，而且此菌种为新型胺菊酯降解菌，因此，该菌对研究胺菊酯的降解途径与降解基因具有非常大的促进作用，对环境中胺菊酯的降解尤其是对胺菊酯的集中修复具有一定的积极意义。
权利要求
1.钩杆菌属(Ancylobactersp. ) Tet_l，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国，武汉，武汉大学，保藏日期为2012年9月27日，保藏编号为CCTCC No M 2012387。
2.如权利要求1所述的钩杆菌属Tet-1在微生物降解胺菊酯中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述降解在20 40°C、pH4. O 10. O、黑暗条件下进行。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述降解在30°C、pH7. 0、150rpm、黑暗条件下进行。
全文摘要
本发明提供了一株胺菊酯降解菌——钩杆菌属(Ancylobacter)Tet-1，及其在微生物降解胺菊酯中的应用。该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国，武汉，武汉大学，保藏日期为2012年9月27日，保藏编号为CCTCC NoM 2012387。本发明所述钩杆菌属Tet-1可通过直接投加的方式应用于水体中胺菊酯的降解，能安全、高效、快速的降解水体中残留的胺菊酯，含有该菌株的菌剂制备工艺简单，成本低廉，使用方便，具有很好的应用前景。
文档编号C02F3/34GK103013858SQ20121047691
公开日2013年4月3日 申请日期2012年11月21日 优先权日2012年11月21日
发明者徐超, 王军良, 丁静茴 申请人:浙江工业大学