本发明属于生物修复技术领域，具体涉及一种利用微生物降解水体面源石油烃的方法。
背景技术：
随着社会的不断发展，人类对能源的需求与日俱增。石油作为一种宝贵的能源和化工原料，它的普及使用给人类的生产生活带来了巨大的便利。但与此同时，由于使用不当和日渐频繁的原油泄漏事故的发生，石油，这把双刃剑，在发挥着正面作用的同时，其负面影响也不容忽视。研究表明，石油烃对地下水的污染长达100年之久，0.1μg/g的石油烃能降低海中小虾的寿命达20%。近几年来，全世界由于海上漏油、不正当排放、机械泄漏等方式进入环境的石油烃基化学品超过1000万吨/年，进入环境的石油烃严重污染陆地、江河和湖泊，危害生态环境和生态平衡，已经引起了世界的恐慌。人类正面临着有史以来最严峻的环境危机，生存和发展受到严重的威胁！2010年4月20日，美国路易斯安那州沿岸的一座石油钻井平台爆炸起火，11人死亡。底部油井漏油量从开始的每天5000桶增加到后来的每天2万5千至3万桶，事件演变成美国历来最严重的油污大灾难，490万桶原油泄漏，污染海域面积超过9900平方公里。漏油造成海洋严重污染，大量海洋生物死亡，多种海洋物种灭绝。近40年来，全世界发生的严重海上漏油事件达13次。全世界范围内的海洋石油污染事件频繁发生，对海洋生态系统造成了严重破坏。另外，石油的主要化学成分是烷烃和苯、甲苯、二甲苯等复杂芳香烃等，不仅有致癌变、致畸变、致突变等作用，并很可能在动植物及人体内富集，危害生物健康。如何有效控制各类各类水体面源石油烃污染，消除由此带来的生理生态危害具有十分重要的现实意义。
目前，针对江河水体面源石油烃污染主要采用物理方法、化学和生物修复法。物理方法主要指物理收集方法，使用围油栏将污染油、吸油船、磁性分离和吸着材料等围在一定的范围内，不让其扩散，然后用油毡将油收集起来，剩余少量的油让其留在水体中自然降解。但该方法对于大量的污染油虽然处理效率最高，但对于薄油层或乳化油收集效果差，而且该方法受自然环境尤其是风力、海浪大小等因素的影响较大，并且设备庞大、耗费高。化学方法主要采用化学手段，加快污染油的转化、消失速度，但需要向水中加入化学试剂，不但成本高，也会造成二次污染。生物修复技术是指生物，特别是微生物催化降解有机物，去除或消除环境污染的受控的或自发的过程，它是解决环境污染、恢复被人类活动破坏的生态系统，实现人类社会可持续发展的重要手段之一。但目前研究主要是利用微生物降解含油污泥，如专利CN102464438A，并且石油去除率低。
技术实现要素：
针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的在于提供一种利用微生物降解水体面源石油烃的方法，解决现有处理江河水体面源石油烃污染的方法存在成本高、二次环境污染和处理效果不佳等问题。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种利用微生物降解水体面源石油烃的方法，包括如下步骤：
1）培养并配制石油烃降解菌的混合菌悬液；所述石油烃降解菌是从石油烃污染严重的水体中筛选和富集得到的；
2）将步骤1）得到的混合菌悬液加入到石油烃污染区，然后加入微生物营养组合物和生物降解促进剂，自然降解10天；所述生物降解促进剂为N-酰基谷氨基酸盐，所述混合菌悬液、微生物营养组合物和N-酰基谷氨基酸盐的加入量分别为污染区石油烃质量的0.3～0.5%、0.4～0.6%和1～2%。
进一步，所述石油烃降解菌包括假单胞菌、苍白杆菌、博德特氏菌、戈登氏菌或铜绿假单胞菌中至少四种。
进一步，所述培养并配制石油烃降解菌的混合菌悬液包括以下步骤：
步骤1：将石油烃降解菌分别接种于LB液体培养基中，然后置于温度为28～32℃、转速150～200r/min的恒温振荡培养箱中振荡培养24～36h；
步骤2：将步骤1培养好的菌液分别离心，去除上层清液，收集菌体，然后分别用质量分数为0.85%的无菌生理盐水重悬菌体即得到单菌株菌悬液，所述单菌株菌悬液中菌体的质量分数为20%；
步骤3：将步骤2得到的多种单菌株菌悬液等体积混合，即得到混合菌悬液。
进一步，所述N-酰基谷氨基酸盐为月桂酰基谷氨酸钠、月桂酰基谷氨酸二钠、椰油酰基谷氨酸钠、椰油酰基谷氨酸三乙醇胺盐、肉豆蔻酰基谷氨酸钠、棕榈酰基谷氨酸钠或硬脂酰基谷氨酸钠。
进一步，所述微生物营养组合物包括以下质量分数组分：NaCl 1～2%、MgSO4•7H2O 6～7.5%、无水CaCl2 7～7.5%、KCl 1～2%、NH4NO3 1～2%、KH2PO4 7～8%、油酰基甘氨酸1~2%、月桂酰基丙氨酸1~2%、余量为K2HPO4•7H2O。
微生物菌群摄取底物的方式和能力对污染区石油烃的微生物降解性能具有重要的影响。石油烃在降解过程中，烃类化合物的憎水性是微生物摄取底物进行代谢、降解的主要障碍，因此烃基质必须通过外层亲水细胞壁（膜）才能进入细胞内而被位于细胞质膜中的烃降解酶所代谢。实验表明，生物降解促进剂N-酰基谷氨酸盐可以通过乳化或增溶作用，促进烃类的溶解或分散，增大其与降解菌细胞的接触面积及可利用性，从而提高其生物可降解性。另外，N-酰基谷氨酸盐的添加量不同，烃类化合物的降解程度也不同。当N-酰谷氨基酸盐的加入量低于污染水域石油烃质量的1.5%时，烃类化合物的降解速度不断的增大，这是由于烃类化合物与N-酰谷氨基酸盐的疏水基团之间的相互作用，显著降低培养液的界面张力，增大了油-水界面的接触面积，使微生物与烃类化合物的接触机会增多，从而有效的提高了生物降解效率；当N-酰谷氨基酸盐的加入量高于污染水域石油烃质量的1.5%时，烃类化合物的降解速度不断的减缓，这是由于N-酰基谷氨酸盐通过增溶作用将烃类化合物包裹在胶束内核，使其表观溶解度增加，反而使微生物与烃类化合物的接触机会减少。同时由于N-酰基谷氨酸盐与蛋白质相似的氨酰键，易于被微生物降解利用，不会产生二次污染，同时为微生物提供营养物质，加速了微生物生长，使微生物数量增多。
营养物质对于石油烃的生物降解作用十分的重要，所以水体中缺少的一些营养物质可能成为微生物生长的限制因素，从而影响生物降解过程，当在水体环境中发生重大溢油事故时，碳源含量会明显增加，但一般水体环境中的氮、磷浓度低，所以此时氮、磷的有效性则会成为了石油降解的主要限制因素。但氮和磷元素过量或不足均会抑制菌群的生长，因此氮和磷存在一个合适的添加量和添加比例。其中无机氮源比有机氮源效果更好，因为有机氮源还可以同时作为碳源优先于石油烃而被利用，所以有机氮源在一定的程度上妨碍了石油烃的降解。其中，无机氮源中NH4NO3作为氮源效果最优，可能是因为NH4NO3被利用后，溶液呈弱碱性。而本发明使用石油烃降解菌：假单胞菌、苍白杆菌、博德特氏菌、戈登氏菌和铜绿假单胞菌均适宜于弱碱环境。生长环境的pH值不适宜会引起微生物表面电荷的改变，进而影响他们对营养物质的吸收效果，也能影响酶的活性，进而影响微生物细胞内的生物化学过程的正常进行。选取KH2PO4和K2HPO4•7H2O作为磷源，一方面它们能对溶液的pH值具有缓冲作用，另外一方面它们被利用后，溶液也呈弱碱性。同时微生物代谢过程中还需要适量的钙、镁等营养物质作为酶的激活剂参与反应才能顺利的进行，过量的钙和镁反而会抑制反应的进行。选择油酰基甘氨酸和月桂酰基丙氨酸作为微生物的营养成分，一方面是因为它们具有表面活性剂的性质，能进一步的增大油-水界面的接触面积，使微生物与底物接触机会增多，另一方面它们可以作为微生物营养物质优先于烷烃降解但并不影响石油烃的降解，反而能作为微生物生长促进剂能加速微生物生长，使微生物数量增多，活性增强，能大大促进烷烃的生物降解。
石油是一种复杂的混合物，不同的石油烃降解菌降解石油中的不同的组分的能力是不同的，通常每种石油烃降解菌只能降解一种或几种烃类，本发明筛选的石油烃降解菌：假单胞菌、苍白杆菌、博德特氏菌、戈登氏菌和铜绿假单胞菌，这5种菌在以正十六烷烃为唯一碳源的培养基中均能生长良好，假单胞菌和苍白杆菌能够以苯酚为唯一碳源的培养基上生长良好；博德特氏菌以少环长侧链环烷烃或具有较宽底物的HVL500石油烃为唯一碳源的培养基上生长良好；戈登氏菌能够以正构烷烃或异构烷烃为唯一碳源的培养基上生长良好；铜绿假单胞菌能够以烯烃或炔烃为唯一碳源的培养基上生长良好。而将不同的菌混合成菌群可以相互弥补各单种微生物的降解能力，集合多种酶促活性，形成1个完善的降解系统，扩大底物范围，从而大大的提高降解活性，促进石油的生物降解。但混合菌的降解率不一定高于单菌，这是因为菌种之间不仅存在协同作用，还可能存在拮抗作用，因此构建优势混合菌不是简单的将菌种混合，而是要充分的考虑它们之间的相互作用，进行最优组合。
相比现有技术，本发明具有如下有益效果：
1、本发明通过利用生物降解促进剂N-酰基谷氨基酸盐、特种微生物菌群和微生物营养组合物三者之间的相互协同配伍，实现了对水中石油烃的高效降解，达到生物修复的目的，使污染区石油烃在10天左右去除率达100%，大大的提高了降解效率。降解后的产物为二氧化碳和水，对环境无任何二次污染，是一种理想的环境友好型去除石油烃的方法。本发明还具有操作简单、原材料廉价易得、不受自然环境的影响和成本低的优点，具有良好的应用前景。
2、本发明采用N-酰基谷氨酸盐作为生物降解促进剂，通过其与烃类化合物的疏水基团之间的相互作用，显著降低培养液的界面张力，增大了油-水界面的接触面积，使微生物与烃类化合物的接触机会增多，从而有效的提高了微生物降解效率。当N-酰基谷氨酸盐的加入量为污染区石油烃质量的1.5%时，烃类化合物的微生物降解速度最快。同时N-酰谷氨基酸盐又能为微生物提供营养物质，加速了微生物生长，使微生物数量增多。N-酰谷氨基酸盐均是以甘氨酸和脂肪酸为原料合成的，原料廉价易得，可再生，具有与蛋白质相似的氨酰键，易于微生物降解，不会造成环境的二次污染。
3、发明提供的石油烃降解菌，是将筛选、富集、培养的多种能快速降解石油烃的微生物菌株混合在一起的菌群。因为菌群可以集合各单种微生物降解能力形成1个完善的降解系统，扩大底物范围，促进石油烃的生物降解，从而大大的提高降解活性。不同菌种之间不仅存在协同作用，还存在拮抗作用，当菌液等体积混合后，石油烃的生物降解效率最高。
4、本发明提供的微生物营养组合物，能适于不同类型降解石油烃的微生物，该组合物不仅能为微生物提供充足的营养物质，还为微生物提供了适宜的pH环境。另外，油酰基甘氨酸和月桂酰基丙氨酸作为微生物的营养成分，既能增大油-水界面的接触面积，增大微生物与底物接触机会，又能使石油烃降解菌能快速生长，保持较高活性，可显著改善不同类型石油烃降解微生物的降解性能，并且对河流水体无二次污染。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1
1）在石油烃污染严重的水域中，采集水样品5g，并将样品加入LB液体培养基中，于30℃、转速200r/min的恒温振荡培养箱中振荡培养12h。
其中LB液体培养基的配制方法：分别称取胰蛋白胨5g，酵母膏2.5g，NaCl 5g，再用去离子水定容至300mL，用5mol/L的NaOH溶液调节至PH=7.0，用121℃蒸汽灭菌20 min。
2）将步骤1）得到的菌液涂布于LB平板上，分离、纯化单菌株。通过16sRNA鉴定，得到5种快速石油烃降解菌：假单胞菌、苍白杆菌、博德特氏菌、戈登氏菌和铜绿假单胞菌，保菌，备用。
3）将筛选、富集得到的假单胞菌、苍白杆菌、博德特氏菌、戈登氏菌和铜绿假单胞菌分别接种于LB液体培养基中，然后置于温度30℃、转速200r/min的恒温振荡培养箱中振荡培养36h；
4）将步骤3）培养好的菌液分别离心，去除上层清液，收集菌体，然后分别用质量分数为0.85%的无菌生理盐水重悬菌体，使菌体的质量分数为20%，即得到假单胞菌菌悬液、博德特氏菌菌悬液、苍白杆菌菌悬液、戈登氏菌菌悬液和铜绿假单胞菌菌悬液；
5）将步骤4）得到的假单胞菌菌悬液、苍白杆菌菌悬液、博德特氏菌菌悬液、戈登氏菌菌悬液和铜绿假单胞菌菌悬液按等体积混合，即得到混合菌悬液。
6）向石油烃污染的水体中依次加入混合菌悬液（步骤5制得）、微生物营养组合物和月桂酰基谷氨酸钠，其中混合菌悬液、微生物营养组合物和月桂酰基谷氨酸钠的加入量分别为污染区石油烃质量的0.4%、0.5%和1.5%，所述月桂酰基谷氨酸钠是以喷洒的方式加入，自然降解10天。
营养组合物包括以下质量分数组分：NaCl 1.5%、MgSO4•7H2O 7.35%、无水CaCl27.35%、KCl 1.5%、NH4NO3 1.5%、KH2PO4 7.35%、油酰基甘氨酸1.73%、月桂酰基丙氨酸1.52%、K2HPO4•7H2O 70.2%。
经过10天自然降解后，水体中石油烃的含量降为0，本实施例石油烃的微生物降解率为100%。
实施例2
1）在石油烃污染严重的水域中，采集水样品5g，并将样品加入LB液体培养基中，于30℃、转速200r/min的恒温振荡培养箱中振荡培养12h。
2）将步骤1）得到的菌液涂布于LB平板上，分离、纯化单菌株。通过16sRNA鉴定，得到4种快速石油烃降解菌：苍白杆菌、博德特氏菌、戈登氏菌和铜绿假单胞菌，保菌，备用。
3）将筛选、富集得到的苍白杆菌、博德特氏菌、戈登氏菌和铜绿假单胞菌分别接种于LB液体培养基中，然后置于温度30℃、转速200r/min的恒温振荡培养箱中振荡培养36h；
4）将步骤3）培养好的菌液分别离心，去除上层清液，收集菌体，然后分别用质量分数为0.85%的无菌生理盐水重悬菌体，使菌体的质量分数为20%，即得到苍白杆菌菌悬液、博德特氏菌菌悬液、戈登氏菌菌悬液和铜绿假单胞菌菌悬液；
5）将步骤4）得到的苍白杆菌菌悬液、博德特氏菌菌悬液、戈登氏菌菌悬液和铜绿假单胞菌菌悬液等体积混合，即得到混合菌悬液。
6）向石油烃污染的水体中依次加入混合菌悬液（步骤5制得）、微生物营养组合物和硬脂酰基谷氨酸钠，其中混合菌悬液、微生物营养组合物和硬脂酰基谷氨酸钠的加入量分别为污染区石油烃质量的0.5%、0.6%和1.5%，所述硬脂酰基谷氨酸钠是以喷洒的方式加入，自然降解10天。
营养组合物包括以下质量分数组分：NaCl 1%、MgSO4•7H2O 6.35%、无水CaCl2 7%、KCl 2%、NH4NO3 2%、KH2PO4 8%、油酰基甘氨酸1.5%、月桂酰基丙氨酸1.5%、K2HPO4•7H2O 70.65%。
经过10天自然降解后，水体中石油烃的含量降为0，本实施例石油烃的生物降解率为100%。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。