集成固相微萃取的微流控芯片以及检测方法

专利名称：：集成固相微萃取的微流控芯片以及检测方法
技术领域：
：本发明属于样品分析检测领域，的设计及其在分析检测领域的应用方法。更具体地涉及具有样品浓縮功能的微流控芯片
背景技术：
：样品预处理一直是样品分析过程中最关键和最耗时的环节。传统的溶剂萃取是样品预处理常用手段之一，但它具有使用有毒的有机溶剂、操作繁琐等缺点。为此，人们发展了无溶剂萃取技术，但其设备复杂，试验条件苛刻，不适于广泛应用。1989年，Pawlizyn等在固相萃取的基础上开发了固相微萃取技术，该技术是在一个石英纤维中实现样品的萃取和浓縮，浓縮后的样品直接用于进样，因此它集采集、萃取、浓縮和进样于一体，简单快速，可方便实现与气相色谱或高效液相色谱的联用。但固相微萃取技术也存在以下缺点石英纤维在使用过程中极易折断；对复杂基体样品萃取时易造成涂层污染；涂层种类不多，限制了其应用范围；商品化纤维价格昂贵，不易实现大众化和普及化。为了解决这些问题，研究者们在固相微萃取基础上开发了固相微萃取膜技术和搅拌棒吸附萃取技术。这两项技术与固相微萃取的基本原理相同，所使用的萃取相材料也一致，但搅拌棒上涂敷的萃取相的量通常为50-300ii1，是固相微萃取的100到1000倍，因此检测灵敏度增加了100到1000倍。微流控芯片技术发展于20世纪90年代初，它依靠微机电加工技术在一张几平方厘米大小的微芯片上加工各种微通道网络，通过对微通道网络中的流体(气体和液体)的控制，将样品分析中的采样、纯化、分离、进样、检测等操作在一个可多次使用的微芯片上完成，充分体现了分析仪器的微型化、集成化与便携化的发展趋势，已经成为当代分析化学领域研究的热点与发展前沿。目前典型的微流控分析芯片常包括一个十字通道，如图1所示，Rl为缓冲溶液池，R2为样品池，R3为样品废液池，R4为废液池，R0、R4为分离通道，R2、R0为进样通道。目前将固相微萃取过程应用于微流控芯片的方法有两种，一种是采用开口管形式在简单玻璃片通道内涂渍一层吸附膜，该膜作为萃取的固定相。目前常用的一种固定相是C18;另一种是在芯片通道内通过原位聚合反应形成多孔的整体柱。但是这些方法皆有一定的缺陷，其一是在微尺寸的通道内形成吸附膜或者多孔整体柱的操作并不方便，无法控制和检查固相吸附介质的形成质量；其二是该吸附膜或者聚合在通道的整体柱是固定在芯片的固相微萃取通道内，一旦吸附介质失效，则整个芯片不能再使用。
发明内容本发明提供一种集成固相微萃取的微流控芯片，用于克服现有技术中的上述缺陷。本发明的集成固相微萃取的微流控芯片，包括呈十字形排布的固相微萃取通道(以下称萃取通道)和分离通道，在萃取通道的第一端与交叉点(萃取通道与分离通道的交汇处)之间设有萃取段，该萃取段填充有多孔微球作为固相微萃取的固定相。在一种具体实施方式中，该多孔微球为在无机颗粒表面包覆一层有机吸附膜。在一种更具体的实施方式中，该无机微珠为二氧化硅颗粒。在一种具体实施方式中，无机微珠表面包覆的有机吸附膜由羟基封端的聚二甲基硅氧烷(HO-PDMS)组成，也可以使用其他材质的吸附膜，如聚乙二醇、聚丙烯酸酯、聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯(PDMS/DVB)、聚乙二醇/聚二甲基硅氧烷、聚乙二醇/二乙烯基苯(CW/PVB)、聚乙二醇/模板树脂(DB/TR)等。在本发明的优选实施方式中，邻近萃取通道的第一端设有第一池、第二池和第三池，分别连通至该第一端并分别作为样品池、清洗池和洗脱池。在萃取通道的第二端设第四池作为第一废液池。在分离通道的第一端设第五池，作为分离缓冲液池。在分离通道的第二端设第六池，作为第二废液池。本发明的第二方面提供一种微流控芯片，其包括呈十字形排布的萃取通道和分离通道，其中，在萃取通道的第一端与交叉点(萃取通道与分离通道的交汇处)之间的预定段设有萃取段。在萃取通道和分离通道的交汇处设有第一检测点，用于对洗脱液中的目标分析物洗脱效果进行评价，在分离通道的末端设有第二检测点，用于检测在分离通道中被分离的目标分析物。在一种具体实施方式中，该萃取通道被涂渍C18固定相。可替代地，该萃取通道内可以通过原位聚合反应形成多孔聚合物整体柱。优选地，可以在该萃取通道内填入微球，作为吸附相。在本发明的优选实施方式中，邻近萃取通道的第一端设有第一池、第二池和第三池，分别连通至该第一端并分别作为样品池、清洗池和洗脱池。在萃取通道的第二端设第四池作为第一废液池。在分离通道的第一端设第五池，作为分离缓冲液池。在分离通道的第二端设第六池，作为第二废液池。在本发明的第三方面，提供一种集成固相微萃取的微流控芯片进行样品浓縮与检测的方法，其中，微流控芯片包括呈十字形排布的萃取通道和分离通道，在萃取通道的第一端与交叉点(萃取通道与分离通道的交汇处)之间的预定段设有萃取段。在萃取通道和分离通道的交汇处设有第一检测点，在分离通道第二端设有第二检测点。该方法包括以下步骤a)样品池中的样品流经萃取通道并被萃取通道中的固定相吸附浓縮；b)通过洗脱液洗脱吸附在固定相上的样品，使其洗脱液到达第一检测点；C)利用第一检测设备检测在第一检测点D1处的样品；d)当发现在第一检测点处存在待检测样品时暂停洗脱，控制载带介质从第一检测点D1向分离通道第二端R6或其附近的第二检测点D2移动，在移动过程中实现分离；e)通过第二检测设备在第二检测点D2处对分离的样品进行检测。在上述方法的一种具体实施方式中，包括以下步骤a)样品池中的样品通过电动方式从到萃取通道的第一端导入，样品流经填充床(萃取段)后样品中目标分析物被萃取相吸附萃取；b)填充床经过来自清洗池的清洗液清洗后，洗脱池中的洗脱液流经填充床，吸附的目标分析物被洗脱后到达所述第一检测点D1;c)利用第一检测设备检测所述第一检测点Dl处的样品；d)当发现在所述第一检测点Dl处出现目标分析物的总体检测信号最大时，停止洗脱，通过电压切换，控制萃取通道和分离通道的交汇处中的洗脱液介质沿分离通道流动，通过第二检测点(D2)最终达到废液池；e)洗脱液介质中的目标分析物在分离通道中分离并通过第二检测设备在所述第二检测点D2处进行检测。作为优选，第一检测设备为激光诱导荧光检测器。通过电泳技术实现样品在分离通道中的分离。在本发明的第四方面，提供一种用于微流控芯片的固相微萃取材料。其由多孔性二氧化硅颗粒包被一层聚二甲基硅氧烷(PDMS)涂层而形成。与现有技术相比，本发明的微流控芯片上集成了固相微萃取模式，采用涂覆有机吸附层的无机微珠填充床作为萃取固定相，免除在芯片通道内壁涂渍萃取层的繁琐操作，而且方便萃取材料的更换，可以实现在一个微流控芯片上实现样品浓縮、分离与检测全过程分析。图1是现有技术中的一种典型微流控芯片的示意图；图2是根据本发明的一种具体实施方式的微流控芯片的示意图。具体实施例方式本发明的一个特点在于，将涂覆有有机高分子吸附层的多孔性微球引入到微流控芯片的萃取通道中，以作为固相微萃取的固定相。该方法的优势在于，根据目标分析物的种类和性质，可以选择能更好吸附目标分析物的吸附材料涂覆在无机微珠上，提高了芯片式固相微萃取的灵活性和选择性。并且，当固定相萃取效率变劣时，可以方便更换固定相而不用丢弃整个芯片，增加了芯片的通用性。此外，该固定相制备简单，只需将涂覆有吸附层的微球填充入固相微萃取通道即可，无需进行复杂的通道内涂覆或原位聚合操作，且质量易控。多孔微球该多孔微球可以完全由有机吸附材料形成。也可以在无机微珠的表面通过化学健合包覆一层有机吸附材料。吸附材料可以是现有技术中适用于固相萃取的所有材料，其可以根据芯片的特定分析对象来选择。这些吸附萃取材料包括但不限于聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚乙二醇(CW)、聚丙烯酸酯(PA)、聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯(PDMS/DVB)、聚乙二醇/聚二甲基硅氧烷(CW/PDMS)、聚乙二醇/二乙烯基苯(CW/PVB)、聚乙二醇/模板树脂(DB/TR)等。目前常用的萃取材料是聚二甲基硅氧烷和聚乙二醇。可以用于本发明的无机微珠可以有多种，例如金属单质、金属氧化物或固态非金属氧化物，可以利用的无机材料的例子包括但不限于金、银、铜、镍、铁、氧化锌、氧化铝、氧化锌、二氧化硅等，其中优选二氧化硅。本发明中提出一种优选的用于固相微萃取的微球，其由多孔性二氧化硅颗粒包被一层聚二甲基硅氧烷(PDMS)涂层而形成。二氧化硅颗粒的直径适宜在在25iim之间，涂附的聚二甲基硅氧烷萃取层厚度在l2iim之间。这种多孔性二氧化硅颗粒容易从市场得到。上述二氧化硅颗粒可以为磁性颗粒(也称为二氧化硅磁性微球)，很容易从市场上得到。在一种具体实施方式中，包被二氧化硅颗粒的过程主要有三步颗粒的预处理，溶胶凝胶的制备，包被以及老化过程。(1)二氧化硅微球的预处理将二氧化硅微球先用有机溶剂清洗，然后浸泡在碱性溶液中，使微球表面的硅羟基充分裸露，再用浸泡在酸性溶液中一定时间，最后用去离子水充分洗涤二氧化硅微球至中性，放入烘箱中烘干备用。(2)溶胶凝胶的制备将一定量的PDMS-OH溶于一定量二氯甲烷中，然后依次加入一定量的甲基三甲氧基硅烷，聚甲基含氢硅氧烷，和三氟乙酸，迅速将混合物振荡混匀，直至形成澄清透明的溶胶溶液。(3)包被以及老化过程将一定量的二氧化硅微球浸泡在上述溶胶溶液中成胶，同时超声一定时间，然后用去离子水洗涤，并置于烘箱中老化一定时间。下面以一个实例来例举说明用于本发明的包被微球的制作过程。(1)二氧化硅磁性微球的预处理将二氧化硅微球(粒径5iim)溶于二氯甲烷中，涡流振荡(2min)，洗涤5min，然后用磁铁将二氧化硅磁性微球吸附在试管底部，弃去二氯甲烷，再将磁性微球浸泡在lmol/LNaOH中，充分振荡混匀，放置8h，使二氧化硅磁性微球表面的硅羟基充分裸露；再用磁铁将磁性微球与NaOH溶液分离，并将其浸泡在0.1mol/LHC1中放置8h。最后用去离子水充分洗涤二氧化硅磁性微球，使其至中性，放入6(TC烘箱中烘干备用。(2)溶胶凝胶的制备表1列出了PDMS涂层的成分、作用和化学结构式。从表中可以看出，配置溶胶溶液需要溶胶前体MTMS、包被层、钝化剂PMHS和催化剂TFA。将30iiLPDMS-OH溶于600iiL二氯甲烷中，然后依次加入50iiLMTMS，50iiLPMHS，和50iiLTFA。迅速将混合物振荡混匀，直至形成澄清透明的溶胶溶液。表1PDMS涂层的成分、作用和化学结构式<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>(3)包被以及老化过禾:'王将lmg二氧化硅磁性微球浸泡在上述溶胶溶液中成胶，同时超声30min，然后用去离子水洗涤两次，并将包被好的磁性微球置于6(TC烘箱中老化10h。上述通过多孔性二氧化硅颗粒包被一层聚二甲基硅氧烷(PDMS)涂层的萃取材料相比于现有技术具有明显改善的样品萃取回收率。样品萃取回收率即萃取层吸附的溶质的量(mPDMS)和水溶液中原来的溶质的量(m。)的比值，其由下式表示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>由下式可知，萃取回收率取决于分配系数KPDMS/W和相比13。对于分配系数相同的组分，相比P越小，萃取回收率越大，通过减小相比，可以使分配系数较小的组分得到较大甚至100%的萃取回收率。目前采用的固相微萃取膜技术和搅拌吸附萃取技术与传统的纤维状固相微萃取技术相比，都是通过大幅度增大萃取层聚甲基硅氧烷(PDMS)的体积，使相比大幅度减少，从而提高萃取回收率，提高检测灵敏度。然而针对通常的搅拌吸附萃取技术而言，PDMS的体积通常为1001，样品基体体积通常在10ml左右，其相比13=100。在微流控芯片中，如果双围堰式填充床深度为20iim，宽度为60iim，长度为5mm，微珠直径为2um，PDMS涂附层厚度为1um，当微珠数量占用该填充床体积约50%的情况下，经计算，其相比e=1.14，即填充床中微珠表面的PDMS体积之和几乎与填充床中的样品基体体积相等，可见与搅拌吸附萃取相比，相比降低了约100倍，由此可知，对于那些由于分配系数较小无法在传统纤维型固相微萃取模式和搅拌吸附萃取模式下获得满意萃取回收率的组分可以在芯片式固相微萃取模式中实现100%萃取回收率。因此，采用芯片式固相微萃取一方面可以大大扩展目标分析物的种类，另一方面可以大幅度提高萃取效率。芯片的结构和构建在本发明的一种优选方式中，其采用的芯片结构如图2所示。l为洗脱通道，洗脱通道1的一部分AB是包含有微萃取固定相的填充床；2为分离通道；R^为样品池，用于放待分析样品；112为清洗池，用于放清洗试剂；&为洗脱池，用于放洗脱液；R4为废液池，用于收集流经洗脱通道l的洗脱液、清洗液和分析后的样品；&为分离缓冲液池，用于放置分离用缓冲溶液；Re为分离废液池。02为检测点，用于检测样品的分离峰。在本发明中，可以不对该交叉处的尺寸做扩大处理，或者其尺寸略大于分离通道的宽度，而且该交叉处作为第一检测点D1，用于实时检测洗脱到交叉处的样品。为了形成具有预定微米级沟槽设计(例如图2所示的结构)的芯片，可以先设计具有相应微图案的胶片状掩膜，通过曝光将掩膜上的微图案转移到涂覆一层光刻胶的玻璃基片上，然后用氢氟酸刻蚀液在玻璃基片的曝光部分刻蚀，形成大约5ym深的沟槽结构，再将萃取通道1的下游部分和整个分离通道用透明胶带掩盖，继续刻蚀萃取通道的填充床部分，使其具有适于填充固定相的尺寸，例如形成深度为30ym的单围堰填充床结构。将聚二甲基硅氧烷(PDMS)聚合物制得的盖片经等离子化清洗器处理后，键合到玻璃基片上，并在盖片上粘上多个储液槽I^至Re，完成芯片的制备。PDMS盖片的制备和芯片的键合该片的制备和芯片的键合已经是先有技术中已知的技术。下面以一个实例来例举说明。(l)硅片基片的处理将硅片置于H2S04:H202(体积比3:1)的混合液中，加热至微沸lh，待冷却后，将硅片至于丙酮中超声5min。(2)去离子水清洗硅片，并超声5min，超净台上晾干。然后置于加热板上，IO(TC加热30min。(3)将硅片放入真空干燥器中，硅烷化lh。(4)将PDMS预聚物和固化剂按照10:1的比例混合搅拌均匀，浇铸到硅片上。(5)真空脱气30min以上，直至预聚物中看不到任何气泡为止。(6)将预聚物放到6(TC左右的烘箱中烘烤约2h，预聚物即可完全固化。玻璃基片和PDMS盖片分别制备完毕后，即可进行两者的键合，过程如下首先用去污粉彻底清洗玻璃表面的污渍，然后在乙醇中、水中依次超声15min，再置于H2S04:H202(体积比3:1)的混合液中加热煮沸30min，待冷却后，用镊子将玻片取出，去离子水清洗干净，置于超净台里晾干。接下来对PDMS盖片和已经清洗干净的玻璃基片进行等离子体处理2min，迅速将PDMS盖在玻璃基片上，压紧，即完成了玻璃-PDMS芯片的制作。最后在R1，R2，R3，R4，R5，R6的位置用环氧乙烷胶粘上储液槽。微球的填装可以采用压力或抽气的方式将前述微球装入萃取通道，将包被好有机吸附层的微球溶于乙腈中配成匀浆液，用注射器吸入此匀浆液，在压力泵的驱动下，将微球压入到固相微萃取填充床中。样品的检测在进行样品分析时，在例如图2所示的样品池中放入分析样品，在清洗池R2中放入清洗试剂；在洗脱池113中放入洗脱液，在分离缓冲液池115中放入分离缓冲液。样品池中的样品通过电动方式导入到萃取通道中，样品流经填充床后样品中目标分析物被萃取相吸附萃取；填充床经过来自清洗池的清洗液清洗后，洗脱池中的洗脱液流经填充床，吸附的目标分析物被洗脱浓縮到达富集池，此时停止洗脱，通过电压切换，控制萃取通道和分离通道的交汇处中的洗脱液介质沿分离通道流动，通过第二检测点最终达到废液池(R6);目标分析物在分离通道中分离并通过第二检测点处进行检测。在本发明的一种具体实施方式中，通过在相应端施加电压来控制流体在通道中的流动。例如，在Ri施加高压、114接地，样品池中的样品流向填充床，在&施加高压、&接地，清洗池中的清洗液以清洗填充床，去除填充床上吸附的检测干扰物；在&施加高压，114接地，洗脱池中的洗脱液洗脱填充床，将被吸附的目标分析物洗脱下来。当需要将洗脱样品进行分离以便在02点逐个检测样品成分时，可以将&、114两端的电压悬浮，将电压切换到Rs高压、Re接地，开始电泳分离过程。在本发明中，通常通过电泳技术实现样品在分离通道的分离，这是现有技术所熟知的。通过电泳使样品中的不同成分在不同的时间到达检测点D2，被检测器检测。在交叉处作为第一检测点D工的情况下，可以通过激光诱导荧光法跟踪经过第一检测点D工处的样品，当发现较大的洗脱峰时，立即中止在Rp114两端施加电压，而将电压切换到R5和Re两端，通过电泳使样品中的不同成分在不同的时间到达检测点D2，进而被检测器检测。这种方法可以很方便地判断洗脱出的样品何时到达交叉处，以便在恰当的时候进行分离。这种方法的另一益处在于，洗脱过程和分离过程可以完全分开，在确定最优化条件时互不干扰，并且可以对同一批样品中的多个不同类别目标分析物按照被洗脱出的先后顺序选择性进行分离检测。与传统方法相比，用于本发明的这种方式可以提高分离效率，使在传统芯片电泳中不能很好分离的目标物质在本发明芯片结构中得以完全分离。尤其对于多组分的复杂样品，可以通过编制电压程序来完全控制各组分的洗脱顺序和分离顺序，使得洗脱效果和分离效果都达到最优。在本发明的一个操作例中，以荧光素异硫氰酸脂标记的苯丙氨酸(FITC-Phe)为样品，其初始浓度为0.1iimol/L。经一段时间以后，FITC-Phe被富集到填充床上，清洗填充床后，用9mmol/L的乙酸钠溶液(含10^乙腈)洗脱，经40s后在第一检测点Dl检测到洗脱峰。通过计算富集因子，富集400s以后浓縮倍数可达到87。混合样品FITC-Phe和荧光素异硫氰酸脂标记的甘氨酸(FITC-Gly)经过50S富集以后，用9mmol/L的乙酸钠溶液(含10%乙腈)可将其同时洗脱下来，以1Ommol/L硼砂缓冲液(pH9.1)为分离缓冲液，分离电压1.2kV，可实现FITC-Phe和FITC-Gly两种组分在分离通道的基线分离，其浓縮倍率分别为12.2倍和16.6倍。9权利要求一种集成固相微萃取的微流控芯片，包括呈十字形排布的萃取通道(1)和分离通道(2)，其特征在于，在所述萃取通道的第一端与交叉点之间设有萃取段，其深度大于所述萃取通道的其余部分，宽度大于或等于其余部分，并且填充有多孔微球作为固相微萃取的固定相。2.根据权利要求1所述的微流控芯片，其中，所述微球由无机颗粒和涂覆在其表面的吸附膜构成。3.根据权利要求2所述的微流控芯片，其中，邻近萃取通道的第一端设有第一池、第二池和第三池，分别连通至该第一端并分别作为样品池、清洗池和洗脱池，在所述萃取通道的第二端设第四池作为第一废液池，在所述分离通道的第一端设第五池，作为分离缓冲液池，在所述分离通道的第二端设第六池，作为第二废液池。4.根据权利要求1所述的微流控芯片，其中的吸附膜由羟基封端的聚二甲基硅氧烷形成。5.根据权利要求1所述的微流控芯片，其中，在所述萃取通道(1)和分离通道(2)的交汇处设有第一检测点(Dl)，用于对固相微萃取洗脱液中目标分析物的检测。6.—种集成固相微萃取的微流控芯片进行样品浓縮与检测的方法，其中，所述微流控芯片包括呈十字形排布的固相微萃取通道(1)和分离通道(2)，在所述萃取通道(1)中距离交叉处(D1)的预定段设有填充床，其中填充有微球作为固相微萃取的萃取相，并且，在所述萃取通道(1)和分离通道(2)的交汇处设有第一检测点(Dl)，在分离通道(2)的末端设有第二检测点(D2)，所述方法包括以下步骤a)样品池(Rl)中的样品通过电动方式导入到固相微萃取通道(l)中，样品流经填充床后样品中目标分析物被萃取相吸附萃取；b)填充床经过来自清洗池(R2)的清洗液清洗后，洗脱池(R3)中的洗脱液流经填充床，吸附的目标分析物被洗脱后到达所述第一检测点(Dl);c)利用第一检测设备检测所述第一检测点(Dl)处的样品；d)当发现在所述第一检测点(Dl)处出现目标分析物的总体检测信号最大时，停止洗脱，通过电压切换，控制萃取通道(1)和分离通道(2)的交汇处中的洗脱液介质沿分离通道(2)流动，通过第二检测点(D2)最终达到废液池(R6);e)洗脱液介质中的目标分析物在分离通道(2)中分离并通过第二检测设备在所述第二检测点(D2)处进行检测。7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述第一检测设备和第二检测设备为激光诱导荧光检测器或电化学检测器。8.根据权利要求6所述的方法，其中，在步骤e)中，通过电泳实现样品在所述分离通道中的分离。9.一种微流控芯片，其包括呈十字形排布的萃取通道和分离通道，其中，在萃取通道的第一端与交叉点之间的预定段设有萃取段，在萃取通道和分离通道的交汇处设有第一检测点，在分离通道的末端设有第二检测点。10.—种用于集成了固相微萃取的微流控芯片的萃取材料，其由多孔性二氧化硅微球包被一层聚二甲基硅氧烷(PDMS)涂层而形成。全文摘要本发明涉及一种集成固相微萃取的微流控芯片，包括呈十字形排布的固相微萃取通道和分离通道，在萃取通道的第一端与交叉点(萃取通道与分离通道的交汇处)之间设有萃取段，该萃取段填充有多孔微球作为固相微萃取的固定相。在一种具体实施方式中，该多孔微球为在无机颗粒表面包覆一层有机吸附膜。在一种更具体的实施方式中，该无机微珠为二氧化硅颗粒。本发明的微流控芯片不仅方便萃取材料的更换，而且可以在一个微流控芯片上进行样品浓缩、分离与检测的全过程分析。文档编号B01D15/08GK101690855SQ200910235700公开日2010年4月7日申请日期2009年10月12日优先权日2009年10月12日发明者厉红,李海芳,林金明,陈志锋申请人:中国检验检疫科学研究院