多肽的逆流提纯的制作方法

专利名称：多肽的逆流提纯的制作方法
技术领域：
本发明涉及使用逆流色谱法提纯蛋白质或肽的方法。本发明特别涉及逆流色谱法用于提纯蛋白质或肽(包括合成、半重组体或重组体多肽，比如重组体GLP-1)的用途。
背景技术：
逆流提纯系统是固相或者物理地和流体流的流动反向移动，或者通过改变该系统的不同分离床的定位而进行模拟以使该移动相对于流体流逆流的提纯系统。逆流提纯系统包括例如模拟移动床色谱(SMB)和多柱逆流溶剂梯度提纯(MCSGP)。模拟移动床色谱(SMB)首次描述于US 2，985，589。该说明书公开了分成许多单独的互连分离床的分离塔，所述分离床含有固相色谱吸附剂。塔底部的管道泵连接从底部到顶部的流，从而提供连续环路。进料(F)和解吸剂(D)的入口及提余液(R)和提取物(E) 的出口位于分离床串列的特定点。按限定的间隔，床的位置在流的相反方向上切换，产生固相床相对于流体流的逆流移动。引入第一床的进料(F)开始分离成其中所含的各种组分， 保留较少的物种沿着流体流的方向迁移并在提余液口得到收集。保留较多的物种保持优先和固相关联并在提取物口得到收集。通过调节切换次数和F、D、R及E的流率，建立循环稳定状态，可从所述系统得到连续的提纯产品流。近来，SMB已被用于分离糖异构体、碳氢化合物、溶剂和其它工业应用。这些工业装置中的许多(像原来的'589装置)采用机械旋转阀的变化进行柱切换。所述阀组件排列成在任何给定的阀位，将多个入口和出口流导向预定的柱子，并通过各个旋转步骤相应地推进一个位置。这样的旋转阀公开于US 6，719，001、4，574，840和4，614，205。为了强调这些装置中的一些的预期规模，参见US 3，040, 777，它描述了占64平方英尺面积和重10 吨的阀。其它SMB 系统公开于 US 4，434，051 和 US 5，635，072。另一个专利 US 6，544，413 公开了多重阀装置，它具有四个阀的成簇阀总成，所述阀用于近似于对各个色谱床控制输入/输出。它对于小规模SMB系统具有减少液体体积的优势。US6，979，402公开了一装置， 其中跨接(cross-over)导管完全被连接通道代替，所述连接通道用机器制成旋转阀体的顶板和底板并和柱口对准以制造SMB流体环路，从而减小空隙体积。将SMB用于提纯药物活性非对映体和对映体的若干新近应用已公开于US 6，462，221,6, 461，858,6, 458，995和6，455，736。在用于这样的分子的二元分离的SMB中使用新的手性树脂正在变得常见。SMB也被考虑用于从复杂混合物提纯生物分子。例如，使用SMB提纯单克隆抗体已被Gottschlich等人报道(J. Chromatogr. A, 765 (1997) 201)并公开于WO 2004/024284o SMB提纯之前已被公开用于胰岛素提纯，如WO 2001/0879 所公开的。WO 2008/048395公开了小规模模拟移动床色谱法。胰高血糖素样肽_1 (GLP-I)是在血糖水平低时释放的激素。GLP-I增大胰岛素生产从而降低血糖水平。GLP-I和GLP-I 类似物用于治疗II型糖尿病。对用于提纯流体混合物的提纯系统仍然存在需求，所述流体混合物包括一种或多种杂质和关注的蛋白质或肽(比如GLP-I肽)，其中杂质的浓度比关注的蛋白质或肽的浓度
小得多。发明目的本发明的目的在于提供改进的多肽提纯方法，所述多肽包括合成式、半重组体式或重组体式生产的多肽，比如重组体GLP-1。本发明的发明人显示了逆流提纯系统(比如 SMB)特别适合于提纯重组体蛋白质，特别是GLP-1。
发明概要发明人已发现，逆流色谱法特别适合于提纯蛋白质或肽，包括合成式、半重组体式或重组体式生产的蛋白质或肽，比如GLP-I肽。公众和药物批准机关对更纯和更同质的治疗蛋白质制品存在越来越大的需求。成本也得低。因此，为了满足这些期望，生产成本是在工业过程中必须最佳化的问题。因此，在第一宽泛方面，本发明涉及通过逆流色谱法提纯肽、多肽或蛋白质的方法。在另一方面，本发明涉及将流体混合物中的关注的多肽和至少一种其它组分色谱分离的方法，所述方法包括a)提供逆流提纯系统，所述系统包括流体连接的多个部分，所述部分包括至少一个固相和第一解吸剂流；b)将所述流体混合物作为进料流引入所述逆流提纯系统，其中所述流体混合物以逆流方式和所述固相接触；c)通过调节进料流中的至少一种调节剂的浓度而控制等温线，使得把mm和A作为(/或α的函数绘图时，等温线的初始斜率A和操作线的斜率大约平行；d)进行关注的多肽和至少一种其它组分的分离；和e)收集所述关注的多肽以提供它的提纯组合物。


图1 产品(-—)和杂质(-·-·)的色谱图。从图中看到，两个峰之间存在大的重叠。 必须采取折中。从2CV收集的产品将得到大的产率，但纯度低；而从2. 5CV收集的产品将得到高纯度，但产率低。图2 纯弱结合组分·(-·--)、纯强结合组分(一)的等温线和这两个等温线的初始斜率。如果流(stream)含有8g/L强组分(产品)且弱结合的杂质是它的5%，它相当于 0. 4g/L。该图显示在低浓度，初始斜率是杂质等温线的合理近似，而对于较强结合的组分， 情况则不同。图3 带再循环的SMB设备。SMB由I-IV四个部分组成，每个部分带有两个柱。解吸剂泵之后的部分称为部分I。来自部分IV的排出物(outlet)再循环至部分I。液体流向右而柱移动向左。图4 一个真实移动床(TMB)中的稳定状态浓度分布。较强结合组分沿着树脂方向移动到提取物口，而较弱结合组分随着洗脱剂移动到提余液口。所有流如图3所示进入和离开TMB。
图5 带有八个柱子、再生及平衡的开放环路SMB设备的布局。柱子可以在SMB设备(Abel 2004)中再生和平衡。由于提余液流仅含有弱结合组分，部分III的出口可以作为代替用作平衡柱的入口。图6 离子交换色谱法(IEX)中的线性等温线的盐依赖性。理论保留将是
为In(Cs)的函数的双对数图中的直线。较弱结合组分的实验数据通过(+)显示而较强结合组分通过(ο)显示。对于较弱结合组分，实验数据的拟合线为(-…_)，而对较强结合组分为(一)。图7 反相色谱法(RP)中的线性等温线的乙醇依赖性。理论保留将是Vk-Vnk作为有机相浓度Cm的函数的半对数图中的直线。较弱结合组分为(-·-·-)而较强结合组分为(一)。图8 等度溶液。较强结合组分的吸附Aa，及较弱结合组分的吸附Ab，连同部分III 中的无因次(dimensionless)流率m111。在等度溶液中，进料流中的调节剂的浓度将会等于部分II中的浓度。因此部分III中的浓度将会和这些相同且不会取决于进料流(水平线)。因此，较弱和较强结合组分的等温线的初始斜率将会恒定。因此仅5和7.5之间的进料流量会满足保留较强结合组分并洗提较弱结合组分的要求。图9 梯度溶液。在SMB设备中使用梯度将导致等温线初始斜率的变化，这取决于调节剂的浓度(不再是水平线，参见图8)。然而使用梯度并不总会保证调节剂的无因次流率mm会位于较弱和较强结合组分的初始斜率之间。图10 进料和洗脱剂中的调节剂浓度的吸引人的组合。可以看到对于所有进料流量，操作线HIm位于较弱和较强结合组分的初始斜率之间。图11 脉冲实验的范·德姆特(van Deemter)图。范·德姆特图显示减小的塔板高度作为流率的函数。图12 线性等温线的完全分离区域。最佳操作点在m11的最小值和mm的最大值， 相当于W点。图13 等度条件下非线性等温线的完全分离区域。W点下移且设备中生产率减小。图14:具有盐/有机溶剂和pH梯度的完全分离区域。可以看到最佳操作点W由于梯度而上移。这允许较高的进料流，因此得到较高的生产率。图15 用于SMB实验II的解吸剂I和解吸剂II (也参见图18)的试验。保留体积可由拟合EMG函数而计算。指数修正高斯(EMG)函数的描述可见于Jeansorme (1991)。图16 等温线的计算的初始斜率A，和部分III中的无因次流量m，以及进料流中的最佳盐浓度。无因次流量具有和较弱结合组分的斜率Ab相同的斜率。图17 等温线的计算的初始斜率A，和部分III中的无因次流量m，以及进料流中的实际盐浓度。无因次流具有比较弱结合组分的斜率Ab小的斜率。图18 用于II号SMB实验的设备的结构。部分I和部分II之间的连接被切断以便能在这两个部分中使用两种不同的盐浓度(也参见图5用于比较)。图19 来自实验II的提取物流紫外信号。初始将进料流设置为lAml/min直至达到循环稳定状态。取样分析并将流量增大l/2ml/min并达到新的循环稳定状态。图20 进料流量为2ml/min且获得了循环稳定状态后的来自实验II的提余液口紫外信号。经过再生和平衡区后，将柱子移入区域II，因此紫外信号初始为零。当组分被洗提时，紫外信号增大。在紫外信号开始再次增大之前看到曲线平稳段。
图21 来自实验III的区域III中的弱结合(-·-·-)和强结合(一_)组分的计算的初始斜率A，连同操作线(一)和操作点(黑点)。可以看到操作线具有和较弱结合组分无限稀释时的等温线的初始斜率大约相同的斜率。图22 进料流为2ml/min且获得了循环稳定状态后的来自实验III的提余液口紫外信号。经过再生和平衡区后，将柱子移入区域II，因此紫外信号初始为零。当组分被洗提时，紫外信号增大。看到和图20相比非常不同的峰。图23 对于较弱结合组分⑴和较强结合组分(ο)，在反相色谱法(RP)中的线性等温线的测量的乙醇依赖性，连同对实验的拟合。理论保留在Vk-Vnk作为Cis函数的半对数图中将是直线。图M 区域III中的较弱(-·-·-)和较强结合(一)组分的计算的初始斜率A，连同操作线(一)和操作点(黑点)。可以看到操作线具有和等温线初始斜率在无限稀释时的变化大约相同的斜率。图25 来自实验IV中的提取物流的测量的紫外信号。为每个循环(8个柱子，3min 转换时间)将数据绘图。起初，紫外信号因SMB设备的启动而增大。图沈获得了循环稳定状态后的实验IV的提余液口紫外信号。经过再生和平衡区后，将柱子移入区域II，因此紫外信号初始为零。当组分被洗提时，紫外信号增大。进料流含有许多弱结合的杂质，且没有看到像在图22中那样的清晰的峰。发明详细内容肽(比如GLP-I肽)可例如在发酵方法中通过重组生产或者在固相上通过合成生产。不管生产方式如何，除关注的多肽外还产生许多杂质。例如当通过重组生产时，除了生产关注的多肽，细胞也生产许多其它物质比如高分子量蛋白质(HMWP)和小分子(例如草酸盐)。由于缺乏和关注的多肽的相似性，这些通常十分易于和关注的多肽分离。另外，细胞生产和关注的多肽非常相似的组分，例如糖基化、脱酰胺、截断、聚集、二聚、氧化的杂质等， 因此产生几乎和关注的多肽相同的蛋白质或肽。由于杂质和关注的多肽之间的高相似度， 这些杂质和关注的多肽分离要难得多。因此，在色谱法中，关注的多肽和这些杂质的保留体积彼此非常接近。在等度模式中，这会对进料流和解吸剂流的要求产生狭窄的约束。适合于分离对映体的提纯系统已被描述。当对映体通过所述提纯系统分离时，被分离的组分通常以相等或接近相等的浓度存在。与此相反，关注的多肽在例如发酵肉汤中的浓度可能显著高于类似杂质的浓度，这常常使得难以将所述杂质和关注的多肽分离同时也实现关注的多肽的高产率。图2说明了被提纯的流体混合物包括关注的多肽以及相似杂质的情形。此处，两个等温线显示于图形中，其中被吸附的浓度按液相浓度而绘制。产品的浓度是8g/L，以低得多的浓度存在的杂质的浓度是0.4g/L。从图中看出，等温线的初始斜率是较弱结合组分的等温线的良好近似，而较强结合组分的近似不那么好。在本发明的一方面，将较弱结合组分的等温线的初始斜率用于选择逆流方法中的调节剂浓度。作为一个说明性实例，可以考虑如图5所示的逆流方法具有和图2给出的等温线相似的等温线的情况。这导致与杂质(以低浓度存在)相比，产品(以高浓度存在)对树脂的更强吸附。在此情况下，杂质在例如提余液流中的洗提可因以下而发生
1.产品在区域III中的替换效应2.杂质本身的等温线的向下弯曲，或3.等温线的初始斜率足够低到可以洗提。在情况1中，例如弱结合杂质会被产品替换，产品会在提余液流中损失。杂质正好在产品之前因替换效应而洗提。在情况2中，弱结合杂质不能在区域III的条件下以低浓度洗提。在此情况下，弱结合组分既不会在提取物流中也不会在提余液流中被洗出(wash out)，而只是在设备中积聚。弱结合杂质的浓度会累积直至浓度对于杂质足够高以由于等温线的弯曲而洗提。在此情况下的劣势是杂质在设备中的累积。这个增大量的杂质会减少空闲配体的量，从而减少产品的结合容量，且增大量的杂质需要在区域II中被洗提以免它最终在提余液流中。情况3是此处覆盖的情形，其中将调节剂在进料流和解吸剂流中的浓度选为使得弱结合杂质总能洗提至提余液流。在此情况下，杂质的积聚得以避免。这可通过此处建议的适当选择解吸剂和进料流中的调节剂浓度而完成。发明人在本发明提供了用于将有关杂质和关注的多肽分离的特别有效的提纯方法。因此，所述提纯方法中的等温线的初始斜率对于提纯关注的多肽是最佳的，其中，肽产品和有关杂质存在于待被提纯的流体混合物(比如从发酵过程获得的流体混合物)中。在本发明的一方面，等温线的最佳初始斜率通过选择逆流提纯系统(比如SMB设备)中的调节剂梯度而获得，其中，以低浓度存在的较弱结合组分(即弱结合杂质)在提余液流中洗提。一方面，根据本发明方法的较弱结合的杂质的洗提防止所述杂质在所述设备中的积聚。 在本发明的一方面，调节剂梯度是盐梯度。一方面，根据本发明的逆流提纯系统用于提纯发酵肉汤，其中获得GLP-I和它的杂质的分离。一方面，根据本发明将逆流提纯系统用于提纯包括合成式生产的蛋白质或肽产品的流体混合物，其中获得GLP-I肽和它的杂质的分离。一方面，根据本发明将逆流提纯系统用于提纯包括胰岛素肽(比如人胰岛素、 desB30人胰岛素或AspB^人胰岛素)的流体混合物，其中获得胰岛素和它的杂质的分离。一方面，根据本发明将逆流提纯系统用于将包括蛋白质或肽的流体混合物从它的杂质提纯，其中使用的柱子是RP HPLC柱。理解平衡对各个组分(比如关注的多肽和它的有关杂质)的保留的影响也将允许使用通常不用于逆流分离系统的梯度，例如IEX中的pH梯度。因此，一方面，根据本发明将逆流提纯系统用于将包括蛋白质或肽的流体混合物从它的杂质提纯，其中使用的调节剂是 PH且使用的柱子是IEX柱。有机组分的浓度也会影响IEX中的平衡，因此也可使用例如IEX中的有机组分。因此，一方面，根据本发明将逆流提纯系统用于将包括蛋白质或肽的流体混合物从它的杂质提纯，其中使用的第二调节剂是有机组分且使用的柱子是IEX柱。等温线经常是凸的，且被吸附组分的浓度q和液相中的浓度c之间的比率，即q/c， 在浓度增大时减小(Guiochon 2006)。这也可在图2中看到。在本发明的一方面，等温线接近于较弱结合组分的操作线。这样的优势在于部分III中的穿透(breakthrough)得以避免。另外，在负载部分II时，可用配体的减少降低在提取物中具有较弱结合组分的风险。本发明发明人发现，针对上述困难的提纯问题的解决方案是在SMB方法中使用梯度。之前已显示，梯度在困难的分离问题中有效，然而没有像本发明建议的那样使用，在本发明中，进料流中产品和杂质之间的浓度差大。在本发明的一方面，提供了进料流和部分II中的不同调节剂浓度，其中在设备的部分III中的平衡是进料流量的函数。对于波动和方法变化的一定的鲁棒性是需要的。图9绘制了梯度情形下的初始斜率连同无因次流量m111。一方面，mm在两个组分各自的等温线的初始斜率A之间。这具有将所述组分分离的效果。从图9看出，进料流量在此情况下仅可在约3. 3和6. 6之间变化。发明人在本发明提供了通过以新的创造性方式结合热力学知识和逆流提纯技术知识(比如SMB)而提纯关注的多肽的吸引人的方法。固定床色谱法固定床(FB)色谱法目前在药物工业中广泛用于提纯组分。在固定床色谱法中，将与杂质混合的所需产品施加于柱子，然后从柱子将它洗提。在柱出口，可从杂质中收集产
P
ΡΠ O在关注的多肽和有关杂质的这种流体混合物的FB色谱图中，常观察到两个峰的重叠(图1)。在此情况下，在柱出口，产品不完全和杂质分离，且不能获得高纯度和高产率两者。SMB为了克服FB色谱法的局限，可以使用逆流色谱法。广泛使用的方法是模拟移动床(SMB)，这在之前已显示就纯度、生产率和溶剂消耗而言都对提纯蛋白质有效 (Schulte(2000))ο在SMB设备中，柱子以特定的转换时间相对于流动方向逆流地移动。因此所述方法就时间和位置两者而言都变化。SMB也被考虑用于胰岛素的提纯(JensenOOOO))，其中对分离由lg/Ι牛胰岛素和 l/2g/l猪胰岛素组成的进料流进行了理论研究。显示，通过在反相色谱方法中施加乙腈梯度，消耗数值可以减小。胰岛素提纯已由Wang在EP1349866B1中通过实验验证。在他的实验中，将胰岛素和ZnCl2及HMWP分离。SMB方法是非连续方法，因为柱子以特定时间tsft转换。这产生一组带有时间和位置这两者的导数的等式。为了简化等式的分析，经常代之研究真实移动床(TMB) (Guiochon, 2006，780页)。 TMB也称作真实逆流(TCC) (Ruthven和Ching 1989)或连续移动床(CMB) (Ma和Wang 1997)。在TMB中，认为树脂流沿着液体流的相反方向连续移动，在此情况下该过程变成稳定状态，且仅剩位置的导数。从这些等式获得的浓度分布常称为稳态浓度分布(Ruthven和 Ching 1989)，或驻波浓度分布(Ma和Wang 1997)。之前已显示，在理想情形下，这两种方法相同(Guiochon 2006)。完全分离区域用于测定SMB设备中的操作点的广泛应用的方法是三角形理论(Storti 1989)。 该方法可衍生于用于TMB的理想色谱法。在理想情况下，对传质和轴向分散的抗性被忽略。逆流方法中的控制参数是和两相中的浓度相比的两相的流率之间的比率(Ruthven 1989)。在三角形理论中，流量的比率定为
权利要求
1.将流体混合物中的关注的多肽与至少一种其它组分色谱分离的方法，所述方法包括a)提供逆流提纯系统，所述系统包括流体连接的多个部分，所述部分包括至少一个固相和第一解吸剂流；b)将所述流体混合物作为进料流引入所述逆流提纯系统，其中所述流体混合物以逆流方式和所述固相接触；c)通过调节进料流中的至少一种调节剂的浓度而控制等温线，使得把mm和A作为Qf 或α的函数绘图时，等温线的初始斜率和操作线的斜率大约平行；d)进行关注的多肽和至少一种其它组分的分离；和e)收集所述关注的多肽以提供它的提纯组合物。
2.根据权利要求1的方法，其中将所述进料流中的至少一种调节剂的浓度控制成不同于所述进料流之前的所述部分，比如所述解吸剂流，中的相同调节剂的浓度。
3.根据权利要求1或2任意一项的方法，其中所述关注的多肽是胰高血糖素样肽或 GLP-I激动剂。
4.根据权利要求1-3任意一项的方法，其中所述逆流提纯系统是离子交换色谱系统。
5.根据权利要求1-4任意一项的方法，其中所述等温线通过控制所述进料流中的盐浓度。而控制。
6.根据权利要求1-5任意一项的方法，其中所述进料流中的盐浓度相对于所述进料流之前的所述部分中的流中的盐浓度在下列范围内
7.根据权利要求1-6任意一项的方法，其中所述进料流中的盐浓度cf在约17.5mmol/kg到约36mmol/kg的范围内，且所述进料流之前的所述部分中的流中的氯离子浓度约为 45mmol/kg0
8.根据权利要求1-7任意一项的方法，其中所述解吸剂包括选自任何有机或无机盐和它们的混合物的盐，比如NaCl、KCl、NH4Cl、CaCl2、乙酸钠、乙酸钾、乙酸铵、柠檬酸钠、柠檬酸钾、柠檬酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸铵、乙酸钙或它们的混合物。
9.根据权利要求1-3任意一项的方法，其中所述逆流提纯系统是反相色谱(RPC)系统。
10.根据权利要求1-3任意一项的方法，其中所述逆流提纯系统是疏水交互作用色谱 (HIC)系统。
11.根据权利要求9的方法，其中所述等温线通过控制所述进料流中的有机调节剂的浓度而控制。
12.根据权利要求1-3或9-11任意一项的方法，其中所述进料流和所述进料流之前的所述部分中的流中的调节剂之间的差异在下列范围内
13.根据权利要求1-3或9-12任意一项的方法，其中所述进料流中的调节剂以约27.3 重量％到约四.4重量％的范围存在，且所述进料流之前的所述部分中的流中的乙醇以约 30. 8重量％存在。
14.根据权利要求1-13任意一项的方法，其中所述逆流提纯系统是模拟移动床(SMB) 提纯系统。
15.根据权利要求1-13任意一项的方法，其中所述逆流提纯系统是多柱逆流溶剂梯度提纯(MCSGP)系统。
全文摘要
本发明涉及使用逆流色谱法提纯多肽的方法。本发明特别涉及逆流色谱法用于提纯重组体GLP-1的用途。
文档编号B01D15/18GK102271775SQ200980150176
公开日2011年12月7日 申请日期2009年12月8日 优先权日2008年12月8日
发明者S·S·弗雷德里克森 申请人:诺沃-诺迪斯克有限公司