一种包被蛋白G的苏丹红Ⅰ免疫亲和柱及其制备方法与流程

本发明属于食品检验领域，具体涉及一种包被蛋白G的苏丹红Ⅰ免疫亲和柱及其制备方法。

背景技术：

苏丹红是一种人工合成的偶氮类、油溶性的化工染色剂，1896年科学家达迪将其命名为苏丹红并沿用至今。苏丹红被大量地用在生物、化学等领域，用于机油、汽车蜡和鞋油等工业产品。随着人们对苏丹红结构及致毒性的逐步了解，国际癌症研究机构(IARC)将苏丹红归为第3类可致癌物质，这类物质虽缺乏足够的直接使人类致癌的证据，但是具有潜在的致癌危险。

苏丹红为亲脂性偶氮化合物，外观呈暗红色或深黄色片状晶体，难溶于水，主要包括Ⅰ、Ⅱ、III和Ⅳ4种类型。其中II、III和IV均为I的化学衍生物。SudanⅠ在体内的代谢产物为苯胺和1-氨基-2-萘酚。苯胺是制造染料、橡胶促进剂及抗氧剂等的原料，是一种重要的有机合成中间体。然而一旦苯胺接触人体皮肤或进入消化系统以后，一方面由于苯胺可直接作用于肝细胞，引起中毒性肝病，还有可能诱发肝脏细胞基因发生变异，增加了人体癌变的几率；另一方面，有可能因为苯胺将血红蛋白结合的Fe(Ⅱ)氧化为Fe(Ⅲ)，导致血红蛋白无法结合氧而患上高铁血红蛋白症。另据报道，长期摄入苯胺还可造成人体的神经系统损害。在饲料中违规添加苏丹红也严重影响人们的身体健康，影响畜牧业的正常发展。

目前苏丹红常用的检测方法有薄层层析法(TLC)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、高效液相色谱法(HPLC)及液相色谱-质谱联用法(LC-MS/MS)等。酶联免疫吸附试验(ELISA)具有高效、灵敏、可采样后经简单处理直接进行检测等优点，但该方法也存在假阳性率偏高的缺点。HPLC、LC-MS/MS法是定量分析苏丹红最常用的方法。使用液相或液质方法检测时，为减少杂质干扰，降低其对检测效果的影响，需要先对各种不同基质的样品进行净化处理。目前常用的净化处理方法就是固相萃取法，也叫柱层析法。是目前净化使用最广泛的方法。其中，免疫亲和柱方法的分析速度快，灵敏度高，分离效率和回收率高，安全可靠，因而成为最常用的方法。

用于目前制备免疫亲和纯化柱的方法大概有：溴化氰活化直接偶联法、环氧氯丙烷法、过碘酸钠法等。这些方法的基本原理都是将载体基质进行化学活化后，将抗体偶联到载体上；蛋白G(Protein G)是从链球菌A、C和G群很多菌株的细胞壁及培养上清中提取的能与IgG Fc片段特异性结合的蛋白，该蛋白能特异性的与多种动物抗体的Fc部位相结合，且具有很高的亲和力。虽然使用蛋白G具有高亲和力，但使用蛋白G处理的载体会降低亲和层析柱的洗脱速度，从而降低抗体的利用率与检测的效率。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的第一目的在于提供一种苏丹红Ⅰ免疫亲和柱，包括载体、蛋白G和苏丹红Ⅰ抗体，其中，所述蛋白G通过化学键偶联在载体上，所述苏丹红Ⅰ抗体与蛋白G结合后用交联剂交联。

优选地，本发明所述的苏丹红Ⅰ免疫亲和柱中，所述蛋白G包括按照GenBank CAA27638.1序列表达的蛋白G，以及经过基因重组表达的重组蛋白G。

优选地，本发明所述的苏丹红Ⅰ免疫亲和柱中，所述蛋白G为基于GenBank CAA27638.1经过基因重组表达的重组蛋白G。

优选地，本发明所述的苏丹红Ⅰ免疫亲和柱中，所述蛋白G通过化学键偶联在载体上，苏丹红Ⅰ抗体与蛋白G结合后用交联剂交联。

优选地，本发明所述的苏丹红Ⅰ免疫亲和柱中，所述的基因重组表达的重组蛋白G，包括降低了载体-重组蛋白G空间位阻作用，增加了重组蛋白G与苏丹红Ⅰ抗体IgG的结合能力的优化。

优选地，本发明所述的苏丹红Ⅰ免疫亲和柱中，所述重组蛋白G优化位点为截除GenBank CAA27638.1序列N端53个氨基酸。

优选地，本发明所述的苏丹红Ⅰ免疫亲和柱中，所述的载体是琼脂糖凝胶；所述的琼脂糖凝胶包括溴化氰活化的琼脂糖凝胶、交联的琼脂糖凝胶、聚丙烯酸琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶以及纤维素的一种或几种；更优选地，所述载体为琼脂糖Sepharose 4B。

优选地，本发明所述的苏丹红Ⅰ免疫亲和柱中，所述的抗苏丹红Ⅰ抗体包括单克隆IgG抗体和多克隆抗体。

本发明的另一目的在于提供一种苏丹红Ⅰ免疫亲和柱的制备方法，包括以下步骤：

1)载体活化；

2)重组蛋白G与活化的载体进行偶联；

3)处理载体-重组蛋白G，并与苏丹红Ⅰ抗体偶联；

4)洗涤苏丹红Ⅰ抗体-重组蛋白G-载体，装柱即获得苏丹红Ⅰ免疫亲和柱。

优选地，本发明所述的苏丹红Ⅰ免疫亲和柱的制备方法中，包括以下步骤：

1)琼脂糖Sepharose 4B，加入0.8M的NaOH，30％的环氧氯丙烷，2mg/ml的硼氢化钠NaBH₄,在25℃下摇床反应8h进行活化；

2)每克活化的Sepharose 4B加入30～200nmol的重组蛋白G，在0.1M NaHCO₃，0.5M NaCl pH8.8的缓冲液中，室温偶联2h，或者4℃偶联过夜；

3)偶联产物用1M Tris·HCl pH 8.0室温反应2h；

4)偶联好的Sepharose-蛋白G，用20mM pH7.4的PBS洗涤；

5)将苏丹红Ⅰ抗体溶解在20mM pH7.4的PBS中，每克蛋白G-Sepharose加入200nmol～1.2umol抗体，室温反应30分钟；

6)将苏丹红Ⅰ抗体-蛋白G-Sepharose载体用20mM PBS pH7.4洗涤，然后加入终浓度0.2M的三乙醇胺和20mM的二甲基庚二酸酯(DMP)，pH8.3，室温反应1h；

7)用20mM pH7.4的乙醇胺终止反应，用含有0.01％硫柳汞的10mMPBS pH7.4洗涤苏丹红Ⅰ抗体-蛋白G-Sepharose载体，装柱，放于4℃保存；

其中，所述重组蛋白G为基于GenBank CAA27638.1经过基因重组表达的重组蛋白G。

由上可知，本发明至少具有以下优点：

1)我们克隆重组了蛋白G(GenBank CAA27638.1)的基因序列，在大肠杆菌中表达出了与抗体有高亲和力的基因重组蛋白G。利用了蛋白G与Ig抗体特异性结合的特点，Ig G抗体由两条重链和两条轻链构成，抗体分为Fab区和Fc区，其中，Fab区是抗原结合的区域。蛋白G是链球菌细胞壁上的一种特殊的蛋白，与抗体的Fc区域有特异性的结合能力。蛋白G与抗体结合后，抗体的Fab区域游离在外，不影响抗体的抗原结合能力。经过我们基因优化重组后的蛋白G，1个分子的蛋白G可以结合3个分子的Ig G抗体，具有很高的抗体亲和力。并且只有抗体能与蛋白G结合，其余蛋白均不能与蛋白G结合，特异性很高。以此蛋白G为基础制备的免疫亲和柱具有特异性好，苏丹红Ⅰ结合量大，纯化效率高的特点。

将基因重组的蛋白G偶联到琼脂糖载体上后，再进行苏丹红Ⅰ抗体偶联，与传统的直接偶联相比，以基因重组的蛋白G为中间间臂偶联到载体上后，降低了空间位阻作用，增加了重组蛋白G与苏丹红Ⅰ抗体IgG的结合能力，使杂质能够充分的流出，增强了净化效果，从而使抗体的Fab端朝向外侧，空间位阻不对抗原结合区域构成干扰，将载体先经蛋白G处理后，再进行抗体偶联，不仅可提高不同净化柱间的均一性，而且能提高抗体的利用率。

因此，通过设计重组蛋白G使其与Ig G抗体特异性结合，使抗体通过蛋白G偶联到载体上。并且使得IgG抗体的Fab片段充分的暴露在外，大幅度提高了苏丹红Ⅰ的捕获能力，苏丹红Ⅰ的纯化效率也得到有效提高。试验表明，在不影响检测性能的条件下，先经蛋白G预处理的琼脂糖凝胶载体苏丹红Ⅰ抗体的需用量约为直接偶联法制备净化柱填料的抗体的需用量的四分之三。

2)本发明使用了基因改造后的蛋白G，通过对密码子的优化和Ig G结合域基因的优化。使蛋白G的抗体结合能力大幅度提高，进而提高了苏丹红Ⅰ的纯化效率。

3)使用本发明纯化苏丹红Ⅰ操作简便，几步就可以得到纯度较高的苏丹红Ⅰ，更方便操作者使用。

4)使用本发明得到的苏丹红Ⅰ纯度很高，后续不用再做别的纯化处理就可以直接用于高效液相色谱检测，节省了操作者的时间和费用。

附图说明

图1为本发明的一个实施例中的苏丹红Ⅰ免疫亲和柱结构示意图；

图2为本发明的一个实施例琼脂糖载体经重组蛋白G偶联后进一步与苏丹红Ⅰ抗体偶联示意图；

图3为琼脂糖载体直接与苏丹红Ⅰ抗体偶联示意图；

图4为琼脂糖载体直接与苏丹红Ⅰ抗体偶联示意图中图标意义图；

图5为溶液中苏丹红Ⅰ初始浓度对净化柱的目标物吸附容量的影响示意图；

图6为苏丹红Ⅰ免疫亲和柱贮存稳定性示意图。

具体实施方式

在本发明的一个实施例中，提供了苏丹红Ⅰ免疫亲和柱及其制备方法:

1、载体活化

选择琼脂糖载体，Sepharose 4B，以环氧氯丙烷活化法进行活化。

取2％的预溶胀的琼脂糖凝胶Sepharose 4B，用20倍体积的蒸馏水充分冲洗，洗去残存的乙醇，用漏斗过滤掉水分。

称取滤去水分后的湿凝胶5g，加入7.5mL 0.8M的NaOH，30％的环氧氯丙烷2mL，2mg/mL的硼氢化钠NaBH4，5mL，在25℃下摇床反应8h。

反应后，用大量的蒸馏水洗涤，去除凝胶中混杂的环氧氯丙烷。

2、将蛋白G与活化载体Sepharose 4B的偶联

将活化好的琼脂糖凝胶Sepharose 4B用偶联缓冲液(0.1M的NaHCO₃，0.8M NaCl，pH8.9)洗涤3次。每克活化的Sepharose 4B加入30～200nmol的蛋白G，室温偶联2h，或者4℃偶联过夜。偶联产物用1M Tris·HCl pH 8.0室温反应2h。

将偶联好的琼脂糖载体用20mM，pH7.4的磷酸缓冲液PBS洗涤3次。偶联有重组蛋白G的琼脂糖载体Sepharose命名为蛋白G-Sepharose。

其中，重组蛋白G为将蛋白G序列((GenBank CAA27638.1，SEQ ID NO：1)，截除N端41个氨基酸后得到重组蛋白G序列(SEQ ID NO2)交由吉尔生化(上海)有限公司合成。

3、抗苏丹红Ⅰ抗体与蛋白G-Sepharose载体上的重组蛋白G连接

蛋白G与抗体具有特异性的亲和力，在一定的反应条件下，将偶联有重组蛋白G的琼脂糖凝胶与抗体进行连接，将抗体连接于琼脂糖上。由于重组蛋白G与抗体的结合部位是抗体的Fc区域，抗体的抗原结合区不受影响，充分保证了抗体的抗原结合能力。

将苏丹红Ⅰ抗体溶解在20mM pH7.4的PBS中，每克蛋白G-Sepharose加入200nmol～1.2μmol抗体，室温反应30min。

结合后的载体用PBS洗涤。连接有抗体的载体命名为抗体-重组蛋白G-Sepharose。

4、载体交联

将抗体-重组蛋白G-Sepharose用20mM PBS pH7.4洗涤3次。然后加入终浓度0.2M的三乙醇胺和20mM的二甲基庚二酸酯(DMP)，pH8.3，室温反应1小时。

加入20mM，pH9.0的乙醇胺终止反应，用含有0.01％硫柳汞的10mM PBS pH7.4洗涤苏丹红Ⅰ抗体-重组蛋白G-Sepharose载体。

5、装柱

将交联后的抗体-琼脂糖载体根据需要装入层析柱中，放于4℃保存可根据需要制备不同容量的苏丹红Ⅰ亲和纯化柱。

以下通过具体实施例进一步对本发明的技术方案进行说明，应理解以下仅为本发明的示例性说明，并不用于限制本发明权利要求的保护范围。

实施例1苏丹红Ⅰ免疫亲和纯化柱的制备

1.琼脂糖凝胶活化

取2％的琼脂糖凝胶Sepharose 4B，用20倍体积的蒸馏水充分冲洗，洗去残存的乙醇。用漏斗过滤掉水分。称取滤去水份后的湿凝胶5g，加入7.5mL0.8M的NaOH，30％的环氧氯丙烷2mL，2mg/mL的硼氢化钠NaBH₄，5mL，在25℃下摇床反应8h。反应后，用50mL蒸馏水洗涤，去除凝胶中混杂的环氧氯丙烷。

2.重组蛋白G与活化的琼脂糖凝胶的偶联

取1克活化后的琼脂糖凝胶，用偶联缓冲液(0.1M的NaHCO₃，0.8M NaCl，pH8.9)洗涤3次。加入2mg/mL的蛋白G 20mL，室温偶联4h。

将偶联好的琼脂糖载体用20mM，pH7.4的磷酸缓冲液PBS洗涤3次。偶联有重组蛋白G的琼脂糖载体Sepharose命名为重组蛋白G-Sepharose。

3.抗苏丹红ⅠIgG单抗与蛋白G-Sepharose结合

将抗苏丹红Ⅰ抗体溶于20mM、pH7.4的PBS中，终浓度2mg/mL，总体积10mL。

将蛋白G-Sepharose用20mM pH7.4的PBS缓冲液洗涤三次，每次30mL。将溶解于PBS中的苏丹红Ⅰ抗体加入洗涤过的蛋白G-Sepharose中，室温结合30min。

结合后的载体用20mM pH7.4的PBS洗涤三次，每次30mL。连接有抗体的载体命名为抗体-蛋白G-Sepharose。

4.结合IgG的琼脂糖Sepharose交联

将抗体—蛋白G-Sepharose用0.1M pH9.0的硼酸缓冲液洗涤3次，每次30mL。

将湿凝胶固体，加入0.1M pH9.0的硼酸缓冲液20mL，在缓冲液中加入交联剂庚二亚氨酸二甲酯(DMP)至终浓度20mM。室温交联1h。

加入100mM，pH9.0的乙醇胺20mL终止反应。并用50mM的乙醇胺20mL封闭10分钟。

交联后的抗体-蛋白G-Sepharose载体用20mM，pH7.4的PBS洗涤3次，每次30mL。

5.装柱

将交联后的Sepharose重悬于10mL 20mM PBS pH7.4，然后装入空的亲和纯化柱柱体中。

实施例2苏丹红Ⅰ免疫亲和纯化柱回收率试验

的加标回收率测定结果(n＝3)

三种样品回收率实验结果见下表：

实施例3：苏丹红Ⅰ免疫亲和柱柱容量的测定——本发明方法与常规方法制备的净化柱性能比较

先经重组蛋白G处理的净化柱的制备按实施例1进行制备

未经重组蛋白G处理的净化柱的制备直接偶联法制备亲和柱

1、载体活化

选择琼脂糖载体，Sepharose 4B，以环氧氯丙烷活化法进行活化。

取2％的预溶胀的琼脂糖凝胶Sepharose 4B，用20倍体积的蒸馏水充分冲洗，洗去残存的乙醇，用漏斗过滤掉水分。

称取滤去水分后的湿凝胶5g，加入7.5mL0.8M的NaOH，30％的环氧氯丙烷2mL，2mg/mL的硼氢化钠NaBH₄，5mL，在25℃下摇床反应8h。

反应后，用大量的蒸馏水洗涤，去除凝胶中混杂的环氧氯丙烷。

2、抗苏丹红Ⅰ抗体与Sepharose载体连接

在一定的反应条件下，将琼脂糖凝胶与抗体进行连接，将抗体连接于琼脂糖上。

将苏丹红Ⅰ抗体溶解在20mM pH7.4的PBS中，每克Sepharose加入200nmol～1.2μmol抗体，室温反应30min。

结合后的载体用PBS洗涤。连接有抗体的载体命名为抗体-Sepharose。

3、载体交联

将抗体-Sepharose用20mM PBS pH7.4洗涤3次。然后加入终浓度0.2M的三乙醇胺和20mM的二甲基庚二酸酯(DMP)，pH8.3，室温反应1小时。

加入20mM，pH9.0的乙醇胺终止反应，用含有0.01％硫柳汞的10mM PBS pH7.4洗涤苏丹红Ⅰ抗体-Sepharose载体。

4.装柱

将交联后的抗体-琼脂糖载体根据需要装入层析柱中，放于4℃保存可根据需要制备不同容量的苏丹红Ⅰ亲和纯化柱。

10mL浓度为100ng/mL的苏丹红ⅠPBS溶液以1mL/min流速上样，然后用10mL超纯水淋洗柱子以洗去非特异性吸附在柱子上的苏丹红Ⅰ，最后用5mL洗脱液将目标物洗脱，HPLC检测，按照下列公式，计算柱容量。

取按如附图1填充好的净化柱，将1mL一定浓度的目标物溶液过柱，用蒸馏水洗柱，用1mL甲醇洗脱，上HPLC进行定量检测，测定净化柱对目标物的“捕获”容量的测定。

图2示出了琼脂糖载体经重组蛋白G偶联后进一步与苏丹红Ⅰ抗体偶联示意图；图3示出了琼脂糖载体直接与苏丹红Ⅰ抗体偶联示意图。其中，图4中示出了图2、图3中各个图示分别代表琼脂糖、苏丹红Ⅰ抗体与重组蛋白G。

在净化过程中，在过柱体积一定的情况下，随着待净化溶液中目标物浓度的增加，净化柱中被“捕获”的目标物的吸附量会随之增加，但其吸附量不会随着目标物浓度的增加而无限增加，净化柱中抗体有一定的吸附容量——饱和吸附容量。本实验首先考察了净化柱中抗体对目标物的吸附量与溶液中目标物初始浓度的关系。图5是目标物初始浓度对净化柱中抗体吸附量的影响曲线。由图5可知，总体上净化柱中抗体对目标物的吸附量随着待净化液中目标物浓度的增加而增加。但此曲线还可分为二个区域，区域1：待净化液中目标物初始浓度低于200ng/mL时，随着待净化液中目标物初始浓度的增加，吸附量增加很快；区域2：被吸附物质初始浓度高于200ng/mL时，随着待净化液中目标物初始浓度的增加，净化柱中抗体对目标物的吸附量基本不变。由于预先经Protein G处理后的蛋白的构象，使抗体能有效与抗原目标物有效的结合，导致在同样数量的净化载体条件下，经Protein G处理后的吸附载体对抗原目标物的吸附量(吸附容量约为280ng/mL)高于未经Protein G处理的吸附载体(吸附容量约为200ng/mL)。

实施例4苏丹红Ⅰ免疫亲和柱稳定性

将制备好的免疫亲和柱分别经4℃冰箱保存，分别选取0、20、40、60、90d等不同时间点，将免疫亲和柱及各种缓冲液平衡至室温，按测定柱容量的操作方法，对其进行添加回收实验，HPLC检测洗脱液中苏丹红Ⅰ含量，重复操作5次，通过计算平均回收率评价亲和柱的稳定性。结果见图6，随着贮存时间的增长，净化柱的净化性能有一定程度的下降，由93％降低到83％，基本可满足测试的要求。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院饲料研究所

<120> 一种包被蛋白G的苏丹红Ⅰ免疫亲和柱及其制备方法

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 480

<212> PRT

<213> 蛋白G

<400> 1

Glu Phe Asn Lys Tyr Gly Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Leu Ile Asn

1 5 10 15

Asn Ala Lys Thr Val Glu Gly Val Lys Asp Leu Gln Ala Gln Val Val

20 25 30

Glu Ser Ala Lys Lys Ala Arg Ile Ser Glu Ala Thr Asp Gly Leu Ser

35 40 45

Asp Phe Leu Lys Ser Gln Thr Pro Ala Glu Asp Thr Val Lys Ser Ile

50 55 60

Glu Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr

65 70 75 80

Gly Val Ser Asp Tyr His Lys Asn Leu Ile Asn Asn Ala Lys Thr Val

85 90 95

Glu Gly Val Lys Asp Leu Gln Ala Gln Val Val Glu Ser Ala Lys Lys

100 105 110

Ala Arg Ile Ser Glu Ala Thr Asp Gly Leu Ser Asp Phe Leu Lys Ser

115 120 125

Gln Thr Pro Ala Glu Asp Thr Val Lys Ser Ile Glu Leu Ala Glu Ala

130 135 140

Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly Val Ser Asp Tyr

145 150 155 160

Tyr Lys Asn Leu Ile Asn Asn Ala Lys Thr Val Glu Gly Val Lys Ala

165 170 175

Leu Ile Asp Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro Lys Thr Asp Thr Tyr Lys

180 185 190

Leu Ile Leu Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Glu Ala

195 200 205

Val Asp Ala Ala Thr Ala Glu Lys Val Phe Lys Gln Tyr Ala Asn Asp

210 215 220

Asn Gly Val Asp Gly Glu Trp Thr Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr Phe

225 230 235 240

Thr Val Thr Glu Lys Pro Glu Val Ile Asp Ala Ser Glu Leu Thr Pro

245 250 255

Ala Val Thr Thr Tyr Lys Leu Val Ile Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly

260 265 270

Glu Thr Thr Thr Glu Ala Val Asp Ala Ala Thr Ala Glu Lys Val Phe

275 280 285

Lys Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Glu Trp Thr Tyr Asp

290 295 300

Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu Lys Pro Glu Val Ile Asp

305 310 315 320

Ala Ser Glu Leu Thr Pro Ala Val Thr Thr Tyr Lys Leu Val Ile Asn

325 330 335

Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Lys Ala Val Asp Ala Glu

340 345 350

Thr Ala Glu Lys Ala Phe Lys Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp

355 360 365

Gly Val Trp Thr Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu

370 375 380

Met Val Thr Glu Val Pro Gly Asp Ala Pro Thr Glu Pro Glu Lys Pro

385 390 395 400

Glu Ala Ser Ile Pro Leu Val Pro Leu Thr Pro Ala Thr Pro Ile Ala

405 410 415

Lys Asp Asp Ala Lys Lys Asp Asp Thr Lys Lys Glu Asp Ala Lys Lys

420 425 430

Pro Glu Ala Lys Lys Glu Asp Ala Lys Lys Ala Glu Thr Leu Pro Thr

435 440 445

Thr Gly Glu Gly Ser Asn Pro Phe Phe Thr Ala Ala Ala Leu Ala Val

450 455 460

Met Ala Gly Ala Gly Ala Leu Ala Val Ala Ser Lys Arg Lys Glu Asp

465 470 475 480

<210> 2

<211> 427

<212> PRT

<213> 重组蛋白G

<400> 2

Gln Thr Pro Ala Glu Asp Thr Val Lys Ser Ile Glu Leu Ala Glu Ala

1 5 10 15

Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly Val Ser Asp Tyr

20 25 30

His Lys Asn Leu Ile Asn Asn Ala Lys Thr Val Glu Gly Val Lys Asp

35 40 45

Leu Gln Ala Gln Val Val Glu Ser Ala Lys Lys Ala Arg Ile Ser Glu

50 55 60

Ala Thr Asp Gly Leu Ser Asp Phe Leu Lys Ser Gln Thr Pro Ala Glu

65 70 75 80

Asp Thr Val Lys Ser Ile Glu Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn

85 90 95

Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Leu Ile

100 105 110

Asn Asn Ala Lys Thr Val Glu Gly Val Lys Ala Leu Ile Asp Glu Ile

115 120 125

Leu Ala Ala Leu Pro Lys Thr Asp Thr Tyr Lys Leu Ile Leu Asn Gly

130 135 140

Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Glu Ala Val Asp Ala Ala Thr

145 150 155 160

Ala Glu Lys Val Phe Lys Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly

165 170 175

Glu Trp Thr Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu Lys

180 185 190

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195 200 205

Lys Leu Val Ile Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Glu

210 215 220

Ala Val Asp Ala Ala Thr Ala Glu Lys Val Phe Lys Gln Tyr Ala Asn

225 230 235 240

Asp Asn Gly Val Asp Gly Glu Trp Thr Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr

245 250 255

Phe Thr Val Thr Glu Lys Pro Glu Val Ile Asp Ala Ser Glu Leu Thr

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Pro Ala Val Thr Thr Tyr Lys Leu Val Ile Asn Gly Lys Thr Leu Lys

275 280 285

Gly Glu Thr Thr Thr Lys Ala Val Asp Ala Glu Thr Ala Glu Lys Ala

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340 345 350

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355 360 365

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370 375 380

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385 390 395 400

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405 410 415

Ala Leu Ala Val Ala Ser Lys Arg Lys Glu Asp

420 425