本发明涉及一种以天冬酰胺为功能配基的层析介质及其制备方法，属于生物化工领域中的蛋白层析分离技术。
背景技术：
抗体能与相应抗原特异性结合，产生各种免疫效应。随着生物技术的迅猛发展和抗体工程技术不断突破，单克隆抗体、多克隆抗体以及基因工程抗体已经广泛应用于生物学和医学领域。抗体用途主要包括疾病治疗、体外诊断和检测、肿瘤定位显像以及作为亲和配基用于分离纯化等。
抗体产品往往纯度要求较高，同时还必须保持生物活性，因此传统的分离过程往往难以满足要求。蛋白a或蛋白g亲和层析介质能够特异性结合抗体，但蛋白类亲和配基易被料液中蛋白酶降解脱落，污染产品，且重复使用次数低，介质价格昂贵，操作成本极高，限制了其大规模应用。而传统的离子交换层析和疏水相互作用层析等方法虽然能够结合抗体，但是特异性和选择性较差，分离步骤多，纯化效果有限。因此，开发具有抗体选择性的非蛋白类配基成为研究热点。
技术实现要素：
针对上述不足之处，本发明的目的在于提供一种以天冬酰胺为功能配基的亲和层析介质。
一种以天冬酰胺为功能配基的亲和层析介质，其中，包括层析基质、空间臂和配基，所述的层析基质为大孔β-环糊精微球，空间臂为6-氨基乙酸，配基为天冬酰胺。
优选的是，所述的以天冬酰胺为功能配基的亲和层析介质的制备方法，其中，包括如下步骤：
1)将层析基质抽干后，加入0.3-1倍层析基质质量的体积百分比为30％的丙酮、0.8-1.6倍层析基质质量的烯丙基氯和0.1-1倍层析基质质量的氢氧化钠，40℃下200rpm摇床中活化30-50小时，抽滤，用去离子水洗涤得到活化层析基质；
2)将活化层析基质和0.2-0.8倍活化层析基质质量的n-氯代丁二酰亚胺混合进行氯代醇化，50℃下200rpm摇床中反应2小时，抽滤，用去离子水洗涤，得到氯代醇化的层析基质；
3)将氯代醇化的层析基质和0.4-1倍氯代醇化的层析基质质量的6-氨基乙酸以及1m碳酸钠缓冲液混合，40℃下200rpm摇床中反应5-20小时，得到羧基活化基质；
4)取羧基活化基质，分别用去离子水、无水乙醇和无水n-甲基吡咯烷酮清洗，清洗后的羧基活化基质加入到含有0.5-2倍活化羧基密度的天冬酰胺、0.2-3倍活化羧基密度的2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯、0.2-5倍活化羧基密度的n-异丙基甲胺的n-甲基吡咯烷酮溶液中，25℃下水浴摇床中反应4-10小时，得到天冬酰胺偶联后的介质；
5)将天冬酰胺偶联后的介质依次用无水n-甲基吡咯烷酮、丙酮和去离子水清洗，抽滤，加入到乙酸钠和乙酸酐的混合液中，25℃下水浴摇床中反应2小时，去离子水洗涤，得到以天冬酰胺为功能基团的亲和层析介质。
优选的是，所述的制备方法，其中，所述的乙酸钠和乙酸酐的体积比为2:1。
优选的是，所述的制备方法，其中，所述碳酸钠缓冲液的ph为10-12。
优选的是，所述的以天冬酰胺为功能配基的亲和层析介质，其中，所述烯丙基氯和层析基质的质量比为0.7-1.6：1。
本发明的有益效果是：
本发明研制的以天冬酰胺为功能配基的亲和层析介质，配基结构基于分子模拟辅助设计，与蛋白a等天然配基结合抗体的模式类似，对抗体具有很好的亲和力和选择性，主要特点体现在：(1)抗体吸附容量大，静态吸附的饱和容量可达100mg/g湿介质以上；(2)具有耐盐吸附的特性，在较宽的盐浓度范围(0-1mnacl)内，都能保持高吸附容量；(3)羧基活化反应条件温和，成本低廉；(4)天冬酰胺配基偶联效率高，密度可控；(5)以6-氨基乙酸为空间臂，天冬酰胺配基可以充分伸展到孔道空间，有利于抗体结合；(6)介质性质稳定，清洗再生方便。本发明的关键在于天冬酰胺配基的肽链较短，成本较低，偶联方便，效率高；天冬酰胺配基具有耐盐吸附特性，无需对料液进行稀释或加盐处理；洗脱条件温和，可避免过酸或过碱等洗脱条件对蛋白结构产生不良影响或活性损失，因此具有良好的抗体分离应用前景。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
实施例1
取大孔β-环糊精微球10g，加入3g的体积百分比为30％的丙酮、8g的烯丙基氯和2g的氢氧化钠，40℃下200rpm摇床中活化30小时，抽滤，用去离子水洗涤得到活化层析基质；将活化层析基质和2g的n-氯代丁二酰亚胺混合进行氯代醇化，50℃下200rpm摇床中反应2小时，抽滤，用去离子水洗涤，得到氯代醇化的层析基质；将氯代醇化的层析基质和5g的6-氨基乙酸以及1m碳酸钠缓冲液混合，碳酸钠缓冲液的ph为12，40℃下200rpm摇床中反应10小时，得到羧基活化基质；取羧基活化基质，分别用去离子水、无水乙醇和无水n-甲基吡咯烷酮清洗，清洗后的羧基活化基质加入到含有6g的天冬酰胺、10g的2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯、2g的n-异丙基甲胺的n-甲基吡咯烷酮溶液中，25℃下水浴摇床中反应5小时，得到天冬酰胺偶联后的介质；将天冬酰胺偶联后的介质依次用无水n-甲基吡咯烷酮、丙酮和去离子水清洗，抽滤，加入到乙酸钠和乙酸酐的混合液中，乙酸钠和乙酸酐的体积比为2:1，25℃下水浴摇床中反应2小时，去离子水洗涤，得到以天冬酰胺为功能基团的亲和层析介质，配基密度为60μmol/ml。
实施例2
取大孔β-环糊精微球10g，加入5g的体积百分比为30％的丙酮、10g的烯丙基氯和3g的氢氧化钠，40℃下200rpm摇床中活化35小时，抽滤，用去离子水洗涤得到活化层析基质；将活化层析基质和4g的n-氯代丁二酰亚胺混合进行氯代醇化，50℃下200rpm摇床中反应2小时，抽滤，用去离子水洗涤，得到氯代醇化的层析基质；将氯代醇化的层析基质和6g的6-氨基乙酸以及1m碳酸钠缓冲液混合，碳酸钠缓冲液的ph为12，40℃下200rpm摇床中反应12小时，得到羧基活化基质；取羧基活化基质，分别用去离子水、无水乙醇和无水n-甲基吡咯烷酮清洗，清洗后的羧基活化基质加入到含有10g的天冬酰胺、15g的2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯、10g的n-异丙基甲胺的n-甲基吡咯烷酮溶液中，25℃下水浴摇床中反应5小时，得到天冬酰胺偶联后的介质；将天冬酰胺偶联后的介质依次用无水n-甲基吡咯烷酮、丙酮和去离子水清洗，抽滤，加入到乙酸钠和乙酸酐的混合液中，乙酸钠和乙酸酐的体积比为2:1，25℃下水浴摇床中反应2小时，去离子水洗涤，得到以天冬酰胺为功能基团的亲和层析介质，配基密度为80μmol/ml。
实施例3
取大孔β-环糊精微球10g，加入8g的体积百分比为30％的丙酮、12g的烯丙基氯和6g的氢氧化钠，40℃下200rpm摇床中活化40小时，抽滤，用去离子水洗涤得到活化层析基质；将活化层析基质和6g的n-氯代丁二酰亚胺混合进行氯代醇化，50℃下200rpm摇床中反应2小时，抽滤，用去离子水洗涤，得到氯代醇化的层析基质；将氯代醇化的层析基质和10g的6-氨基乙酸以及1m碳酸钠缓冲液混合，碳酸钠缓冲液的ph为12，40℃下200rpm摇床中反应5-20小时，得到羧基活化基质；取羧基活化基质，分别用去离子水、无水乙醇和无水n-甲基吡咯烷酮清洗，清洗后的羧基活化基质加入到10g的天冬酰胺、20g的2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯、20g的n-异丙基甲胺的n-甲基吡咯烷酮溶液中，25℃下水浴摇床中反应10小时，得到天冬酰胺偶联后的介质；将天冬酰胺偶联后的介质依次用无水n-甲基吡咯烷酮、丙酮和去离子水清洗，抽滤，加入到乙酸钠和乙酸酐的混合液中，乙酸钠和乙酸酐的体积比为2:1，25℃下水浴摇床中反应2小时，去离子水洗涤，得到以天冬酰胺为功能基团的亲和层析介质。
实施例4
取实施例1所得到的层析介质对人igg的静态吸附性能进行测试，考察不同nacl浓度的影响。首先用去离子水充分清洗介质,并用缓冲液平衡。分别准确称取0.04g介质于2ml离心管中，加入0.8ml不同人igg浓度的缓冲溶液；将离心管置于恒温混匀仪中，25℃下1500rpm吸附2h，达到吸附平衡后，离心分离，取出上清液测定人igg的浓度；根据物料平衡计算介质的吸附容量，绘制吸附等温线，并根据langmuir方程拟合得到饱和吸附容量和解离常数。本发明实施例1制备的亲和层析介质在0mnacl条件时，对人igg的饱和吸附容量为89.2mg/g介质，解离常数为0.8mg/ml；在1mnacl条件时，饱和吸附容量为63.9mg/g介质，解离常数为0.8mg/ml。结果表明，天冬酰胺亲和层析介质对人igg吸附量较大，具有良好的耐盐吸附特性。
实施例5
取实施例1所得到的层析介质对单克隆抗体料液进行分离纯化。介质经平衡缓冲液(30mm磷酸钠盐缓冲液，ph7.0，含1.5mnacl)充分平衡，细胞培养液上样10ml；10个柱体积平衡缓冲液冲洗至基线；ph4或者ph5的20mm醋酸钠缓冲液洗脱；最后用0.1mnaoh进行原位清洗。洗脱得到的样品用非还原sds-page和hplc分析，单克隆抗体纯度达到99.5％(洗脱ph为4)和99.6％(洗脱ph为5)。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。