本实用新型涉及生物传感器领域，尤其涉及快速体外诊断领域，具体涉及一种电化学免疫微流控检测卡。
背景技术：
在生物体系中，存在着各种各样的物质，它们对生物学过程的各个方面都有十分重要的影响，对这些物质进行快速准确的分析一直是分析科学所追求的目标。环境监测、毒品监测以及临床诊断等应用领域也很迫切需要建立各种快速的、简便的分析方法。传统的分析方法是以化学法为主，常常需要一系列繁琐的操作过程，分析周期长，而且灵敏度低、选择性差、准确度差。随着多学科交叉领域研究的发展，新的分析生物学技术-电化学生物传感器和微流控芯片分析技术诞生了。
电化学生物传感器是最早问世的生物传感器。20世纪60年代，Clark和Lyons首次提出使用含酶的膜把尿和葡萄糖转化为产物，使用pH电极或者氧电极来检测的设想；在1967年，Updike和Hicks把含有葡萄糖氧化酶的聚丙烯酰胺凝胶膜固定到氧电极上制备了第一支葡萄糖传感器，开创了电化学生物传感器的历史。以活性物质为敏感基元，以电化学电极为信号转化器，以电位、电流或电容为特征检测信号的生物传感器称为电化学生物传感器。
微流控芯片(Microfluidic chip)，又称微流控芯片实验室或者芯片实验室(Lab-on-a-chip)，是在20世纪90年代由瑞士的Widmer和Manz提出的，涉及到生物化学等领域中的样品制备、反应、分离、检测及细胞培养、分选、裂解等，并将这些基本操作单元通过微机电技术和纳机电技术(MEMS/NEMS)集成或者基本集成到一块几平方厘米(甚至更小)的芯片上去，利用微通道形成网络，可控流体贯穿整个系统，来替代常规生物化学实验室中各种功能仪器及操作的一种技术平台。
但传统的微流控芯片加工技术存在造价高、芯片结构复杂、需要外置驱动来操控流体流动等缺陷。而本方案设计的微流控芯片具有成本低、结构简单、无需外置驱动依靠虹吸动力流动，解决了传统微流控芯片的诸多弊端，具有广泛的应用前景。
技术实现要素：
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种电化学免疫微流控检测卡，解决现有技术存在的技术问题：传统的生化免疫分析常常需要一系列繁琐的操作过程，分析周期长，而且灵敏度低、选择性和准确度差。微流控芯片免疫技术使得原本需要在一个实验室完成的工作现在在一张芯片上即可完成，不仅使生物试样和试剂的消耗大大降低到微升甚至纳升级，而且使分析速度成十倍百倍的提高，从而为实现分析实验室的家庭化成为了可能，但传统的微流控免疫芯片采用微机电加工技术，相对于传统的免疫层析、ELISA等技术仍存在造价较高的缺陷；此外，传统微流控芯片还存在结构及制作过程也较复杂、需要外置驱动来操控流体流动等缺陷。
为了解决传统微流控芯片成本较高、制作过程复杂、需要外置驱动来操控流体流动等缺陷，我们进行了深入研究。结果发现，通过在带有双面黏胶层的中隔层上以模切或者其他切割的方式制作的微流控通道，并与带有测试电极的绝缘底板以及带有亲水性质的上盖组装制成的免疫微流控芯片可以很好的解决上述问题，并在检测灵敏度、准确度、测试线性及测试CV等方面均获得理想的效果，从而完成了本实用新型。
本实用新型的技术方案如下：
本实用新型的电化学免疫微流控检测卡，包含亲水上盖、中隔层和绝缘底板，在绝缘底板上含有至少一对测试电极和至少一个检测试剂喷涂区，所述的测试电极连有电极引线，电极引线与测试仪器的检测模块相连，测试电极需通过印刷的方式或其他方式预先制作在绝缘底板上。带有测试电极的绝缘底板覆盖有中隔层，该中隔层上含有按预先设计方案制作好的微流控通道；中隔层上覆盖有一层亲水上盖。所述的亲水上盖设有加样孔和排气孔。
所述的测试电极和电极引线所用的材料为导电材料，通过丝网印刷或其他方式附着在绝缘底板上，优选丝网印刷的方式制作。
所述的检测试剂喷涂区喷涂有为检测血液中特定目标成分的物质配方组合物，该配方组合物可以在中隔层粘贴于绝缘底板之前喷涂上去也可以在中隔层粘贴于绝缘底板之后喷涂上去，优选在中隔层粘贴于绝缘底板之后喷涂上去的方案。
所述的中隔层含有粘性的疏水性物质，其成分可以是硅胶、聚丙烯酸酯或其他成分，优选为硅胶或聚丙烯酸酯。
所述的中隔层上含有按照预先设计方案制作的微流控通道，微流控通道可以使用模切、激光切割等方式制作，其中优选模切的方式。
所述的检测卡亲水上盖通常可以由硬质或软质材料做成。出于切割方便及成本考虑，优选软质塑料材质的材料，如PET、PVC、PC等，其中优选PET材质的软质塑料材料。
所述的亲水上盖的亲水性可以是将亲水性的物质均匀的喷涂于上盖上做成的，也可以是通过等离子处理或电晕处理等手段做成的；为了保证上盖亲水性的稳定，优选将亲水性物质均匀喷涂于上盖的方案。
所述的制作好的微流控检测卡需要与配套仪器协同进行检测，仪器可以通过测定测试电极区域发生反应后的电信号(如电流、电阻、电导以及电阻抗等)的变化对检测样本中的目标物质进行定性或定量测量。
本实用新型的电化学免疫微流控检测卡的制作是通过首先将带有双面黏胶层的中隔层按预先设计好的方案切割成成需要的微流控通道，然后将切割好的中隔层粘贴于带有测试电极的绝缘底板上，再在中隔层上面粘贴上带有亲水性的上盖，最后分切成所需大小和形状，即为完整的检测卡。具体制作过程如下：
(1)选择一种表面光洁、不导电、对样本无渗透性和吸收性的塑料材料作为试纸条的绝缘底板，该塑料的材质可以是PET、PVC、PE、PP、PS、ABS等，优选为PET。
(2)在绝缘底板上通过丝网印刷或其他方式附着上测试电极和电极导线并干燥，以确保电极和导线附着牢固。可用十字划格法检测以确保附着的牢固程度符合要求。制作电极和电极导线的材料为导电材料，如碳以及金、银、铂等贵金属材料，优选为金。
(3)配制用于测试的配方试剂，配方试剂含有可与检测样本中目标物质发生免疫反应的抗体，抗体可以是单抗也可以是多抗；抗体可以用标记探针标记也可以不标记；标记探针可以是非导电的也可以是导电的。本方案优选导电的胶体金标记探针标记抗体，以便起到放大测试信号，提高检测的灵敏度。
(4)选择一种含粘性的疏水性物质的中隔层，其成分可以是硅胶、聚丙烯酸酯或其他成分，优选为硅胶和聚丙烯酸酯。该中隔层由绝缘性材料做成，其材质可以是PET、PC、PVC等，其中优选软质PET材质的材料。中隔层宽度应小于或等于绝缘底板的宽度、长度应小于绝缘底板的长度以确保电极导线可以和试纸条检测仪器连通。
(5)将选择好的中隔层用设计好的方案进行切割。
(6)将切割好带有微流控通道的中隔层粘贴于绝缘底板上，绝缘底板的材质可以是PET、PC、PVC等，其中优选PET材质的材料。
(7)将粘贴好中隔层的底板用辊压机压平，将粘贴过程中产生的气泡挤出并使中隔层与底板粘贴严实，避免在进行加样反应时出现样品的渗漏。
(8)在粘贴好中隔层的绝缘底板的试剂喷涂区用仪器喷涂上用于测试的配方试剂并干燥，干燥后附着在测试电极上的试剂层形状最好为规则形状。
(9)在已喷涂好检测试剂的绝缘底板上粘贴亲水上盖。亲水上盖的亲水性可以是将亲水性的物质均匀的喷涂于上盖上做成的，也可以是通过等离子处理或电晕处理等手段做成的；为了保证上盖亲水性的稳定，优选将亲水性物质均匀喷涂于上盖的方案；亲水上盖通常可以由硬质或软质材料做成。出于观察和切割方便及成本考虑，优选软质透明塑料材质的材料，如PET、PVC、PC等，其中优选PET材质的软质透明塑料材料。
(10)将粘贴好亲水上盖的绝缘底板用辊压机压平，将粘贴过程中产生的气泡挤出并使亲水上盖与中隔层粘贴严实，避免在进行加样反应时出现样品的渗漏。
(11)粘贴好亲水上盖的检测卡大板用切割机分切成所需大小和形状，即为成品检测卡。
评估方案：
(1)采集血液样本，将血液样本用待测目标物质调节成至少5个测试浓度的样本。
(2)将每个待测浓度的血样样本分成二等分。第一份用标准检测仪器检测血样中目标物质的含量；第二份用本方案制作的免疫微流控检测卡在配套检测仪器上进行检测。
(3)比较用本方案制作的免疫微流控检测卡血样测试结果与标准仪器检测结果的偏差，并计算测试CV和测试线性。
本实用新型具有如下技术效果：本实用新型鉴于现有技术存在的问题，提供了一种基于生物传感器技术的免疫微流控检测卡的设计方案。通过该方案，可以不仅使原本需要在一个实验室完成的工作可以在一张芯片上即可完成，而且大大简化了微流控芯片的制作过程以及大大降低了微流控芯片的制作费用，在检测的灵敏度、准确度、测试线性及测试CV等方面均获得理想的效果。根据本实用新型，我们实现了微流控芯片大批量快速廉价的制作，制作的免疫微流控芯片以测试CRP血液样本为例，CRP测试线性范围可达0.5mg/L～200mg/L，测试CV小于10％，与对照仪器的准确度偏差控制在10％范围以内。
附图说明
图1为本实用新型电化学免疫微流控检测卡整体外观图。
图2为电化学免疫微流控检测卡印刷有测试电极的绝缘底板图。
图3为带有微流控通道的中隔层示意图。
图4为亲水上盖示意图。
图中1-1为检测卡加样孔，1-2为检测试剂喷涂区，1-3为测试反应检测区，2-1为绝缘底板，2-2为测试电极，2-3为电极引线，3-1为中隔层，3-2为微流控通道，4-1为亲水上盖，4-2为排气孔。
具体实施方式
下面结合具体实施例来详细地说明本实用新型，但本实用新型的技术范围不限于这些实施例。
本实用新型的电化学免疫微流控检测卡，包含亲水上盖、中隔层和绝缘底板，所述的绝缘底板上设有检测试剂喷涂区、测试反应检测区、测试电极和电极引线，所述的电极引线与测试仪器的检测模块相连，所述的测试电极印刷在绝缘底板上，所述的亲水上盖覆盖在中隔层上，所述的中隔层覆盖在绝缘底板上，所述的中隔层上设有微流控通道；所述的亲水上盖设有加样孔和排气孔。
本实用新型的电化学免疫微流控检测卡的制备步骤如下：
(1)选择一种表面光洁、不导电、对样本无渗透性和吸收性的PET绝缘底板。
(2)在绝缘底板上通过丝网印刷的方式印刷上测试电极和电极导线并烘干。制作电极和电极导线的材料为金。
(3)配制用于测试的配方试剂。试剂组成为：10％(W/V)羧甲基纤维素钠，3％(W/V)羟乙基纤维素，0.5％(W/V)BSA，0.1M pH 7.0PBS缓冲液，1mg/mL标记有胶体金探针的CRP多抗。
(4)选择一种含粘性的疏水性聚丙烯酸酯的中隔层，该中隔层由绝缘性材料做成，其材质为软质PET材质的材料。中隔层宽度等于绝缘底板的宽度、长度小于绝缘底板的长度以确保电极导线可以和试纸条检测仪器连通。
(5)将选择好的中隔层用设计好的模具进行模切。
(6)将切割好带有微流控通道的中隔层粘贴于PET材质的绝缘底板上。
(7)将粘贴好中隔层的底板用辊压机压平，将粘贴过程中产生的气泡挤出并使中隔层与底板粘贴严实，避免在进行加样反应时出现样品的渗漏。
(8)在粘贴好中隔层的绝缘底板的试剂喷涂区用仪器喷涂上用于测试的配方试剂并干燥，干燥后附着在测试电极上的试剂层外观应均匀规则。
(9)在已喷涂好检测试剂的绝缘底板上粘贴亲水上盖。亲水上盖的亲水性是将亲水性的物质均匀的喷涂于上盖上做成的，亲水上盖为透明的PET材质的软质塑料材料。
(10)将粘贴好亲水上盖的绝缘底板用辊压机压平，将粘贴过程中产生的气泡挤出并使亲水上盖与中隔层粘贴严实，避免在进行加样反应时出现样品的渗漏。
(11)粘贴好亲水上盖的检测卡大板用切割机分切成所需大小和形状，即为成品检测卡。
评估本实用新型设计的免疫微流控检测卡检测CRP血液样本检测灵敏度、准确度、测试线性及测试CV等方面的效果，具体步骤如下：
(1)采集血样，用CRP抗原标准品调节血样中CRP的浓度，将血样调节成0.5mg/L、10mg/L、50mg/L、100mg/L、150mg/L以及200mg/L六个浓度的样本。
(2)将每个浓度的血样样本分成二等分。第一份用对照检测仪器检测；第二份用本方案制作的微流控检测卡在配套检测仪器上检测，本示例的仪器采用交流阻抗法进行检测。
(3)比较用本方案制作的检测卡测试结果与标准仪器检测结果的偏差与线性相关性。
(4)计算用本方案制作的检测卡检测结果的CV。
其检测结果如下：
表1用对照仪器及本方案制作的微流控检测卡测试结果
从表1的测试结果可看出：本方案制作的免疫微流控检测卡在检测CRP血液样本时与对照仪器相比较，两者之间具有良好的线性相关性；本方案制作的检测卡检测灵敏度可达到0.5mg/L，测试CV均小于10％，与对照仪器的准确度偏差亦均小于10％，表现出了优良的测试性能。