一种氨基磁珠、其制备方法及应用与流程

本发明属于生物
技术领域：
，更具体地，涉及一种氨基磁珠、其制备方法及应用。
背景技术：
：基因组dna携带有生命活动的全部遗传信息，是生物体发育和正常运作必不可少的生物大分子。从全血中提取dna是获得生物基因组遗传信息较为简单的方法，也是进行基因相关性研究的重要手段和技术。dna提取的质量和产量直接影响着后续实验的准确性。纳米磁珠是由磁性材料与高分子材料通过化学或者物理键合的方法制备而成的一种性能优越的功能材料。纳米磁珠法属于固相萃取法，磁性纳米材料的使用使得固相分离过程变得更为简便与高效。磁性纳米颗粒具有比表面积大、表面活性高和生物相容性好等优良特性，能够充分地与dna相互作用，并在外加磁场作用下高效地进行固液分离，从而提高dna的提取效率。由于dna核酸骨架上具有磷酸基团，带有负电荷，因此不需要任何额外的结合剂，dna就可以有效的吸附在带正电荷基团修饰的磁珠表面，并且吸附的dna被保护免于酶切割。基于这些优势，磁珠法dna提取试剂盒可用于临床疾病诊断、环境微生物检测、食品安全检测、实验室研究等多种领域。氨基磁珠即为表面修饰有氨基官能团且具有超顺磁性的磁性微粒，是一种被广泛应用的功能性生物磁珠，主要用于免疫磁珠的制备。在一定条件下，氨基磁珠通过交联试剂(如戊二醛等)的介导，可与蛋白配体(如抗原、抗体等)、寡核苷酸探针等生物分子共价偶联，这类偶联有生物配体的氨基磁珠即为免疫磁珠。氨基磁珠被广泛应用于蛋白质的分离提纯、细胞分离、酶的固定、免疫分析等多个领域。氨基磁珠表面接枝的氨基基团，可以通过静电相互作用与dna分子上的磷酸基团相互作用，达到吸附目的，在温和的吸附条件可以与dna下游分析条件较好的兼容，减少了纯化步骤。因此，为了提高dna捕获的效率，应尽量提高磁性纳米颗粒表面氨基修饰的密度。技术实现要素：针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种氨基磁珠、其制备方法及应用，其目的在于通过进一步提高氨基磁珠表面键合氨基密度并通过富氨基基团的结构，提高氨基磁珠对dna特异性的亲和能力，从而简化提取步骤、降低提取难度、缩短提取时间，由此解决现有技术的技术提取时间较长、步骤繁琐、回收率不高的问题。为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种氨基磁珠，包括二氧化硅包被的四氧化三铁纳米颗粒，其表面共价接枝有富氨基基团，磁纳米颗粒表面键合氨基密度大于0.18μmol/mg。优选地，所述氨基磁珠，其所述富氨基基团，为c3以上的直链。优选地，所述氨基磁珠，其所述富氨基基团为-ch2nh-c2h5nh-c2h5nh2。优选地，所述氨基磁珠，其所述四氧化三铁纳米颗粒粒径≤30nm，所述二氧化硅包被的四氧化三铁纳米颗粒粒径在35nm-50nm之间。按照本发明的另一个方面，提供了所述的氨基磁珠的制备方法，其包括以下步骤：将二氧化硅包被的四氧化三铁纳米磁珠颗粒，采用3-[2-(2-氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基三甲氧基硅烷作为烷基化试剂，进行表面改性，共价接枝富氨基基团。优选地，所述氨基磁珠的制备方法，其包括以下步骤：(1)将二氧化硅包被的四氧化三铁纳米磁珠颗粒分散于有机溶液中，使得二氧化硅包被的四氧化三铁纳米磁珠颗粒的浓度在2-7mg/ml，获得二氧化硅包被的四氧化三铁纳米磁珠颗粒分散液；(2)向步骤(1)中加入烷基化试剂3-[2-(2-氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基三甲氧基硅烷、以及氨水，使得每0.1g氧化硅包被的四氧化三铁纳米磁珠颗粒，对应添加烷基化试剂4-10mmol、以及氨水0.15-0.2ml，维持纳米颗粒的分散状态获得前体分散液；(3)对于步骤(2)中获得的前体分散液，在室温至100℃反应8～12h发生烷基化反应，洗涤烘干后获得所述氨基磁珠。优选地，所述氨基磁珠的制备方法，其步骤(1)所述有机溶液优选为二甲基甲酰胺(dmf)、和/或甲苯；所述氧化硅包被的四氧化三铁纳米磁珠颗粒的粒径在35nm-50nm之间。优选地，所述氨基磁珠的制备方法，其所述二氧化硅包被的四氧化三铁纳米磁珠颗粒按照以下方法制备：取纳米四氧化三铁颗粒分散与醇水溶液中，加入正硅酸四乙酯的乙醇溶液和氨水，使得每0.1g四氧化三铁粉末相应添加0.4-0.6g的正硅酸四乙酯、以及1-2.5ml的氨水，发生溶胶凝胶反应，洗涤烘干获得所述二氧化硅包被的四氧化三铁纳米磁珠颗粒，所述纳米四氧化三铁颗粒粒径≤30nm优选20nm，所述醇水溶液乙醇与水体积比为3:1-4:1；所述硅酸四乙酯的乙醇溶液浓度在0.1-0.5g/ml之间；所述溶胶凝胶反应的反应条件为维持纳米颗粒分散、60℃～100℃反应8～12h。按照本发明的另一个方面，提供了一种所述的氨基磁珠的应用，其应用于全血dna提取。优选地，所述氨基磁珠的应用，其包括以下步骤：s1、向经蛋白酶预处理的全血样本中加入dna结合液和本发明提供的氨基磁珠，混匀反应10min-40min，固液分离获得吸附有dna的氨基磁珠；每200μl全血样本对应使用所述氨基磁珠2mg-3mg；s2、采用乙醇的水溶液进行洗涤；所述乙醇的水溶液1ml-3ml，浓度在70-75v/v％之间，洗涤次数大于等于两次，获得磁珠-dna复合物；所述磁珠-dna复合物可直接用于扩增、测序，也可以进行步骤s3洗脱；s3、向所述磁珠-dna复合物加入洗脱液，将dna洗脱，固液分离收集液相获得提取的全血dna样本。总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果：本发明提供的氨基磁珠，表面键合氨基密度进一步提高，吸附dna的浓度和纯度都得到明显提供，具有良好的回收率。本发明提供的氨基磁珠应用全血dna提取，能够一次性提取大量dna样本供扩增和检测之用。附图说明图1为本发明实施例5-7中使用实施例1磁珠提取全血dna的琼脂糖凝胶电泳条带；图2为本发明实施例8-9中使用实施例1磁珠提取全血dna免洗脱的琼脂糖凝胶电泳条带。具体实施方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。本发明提供的氨基磁珠，包括二氧化硅包被的四氧化三铁纳米颗粒，其表面共价接枝有富氨基基团，磁纳米颗粒表面键合氨基密度大于0.18μmol/mg。所述富氨基基团，为c3以上的直链，优选为-ch2nh-c2h5nh-c2h5nh2，由于氨基吸附dna，如果磁纳米颗粒表面键合氨基密度过大，可能由于空间位足或导致吸附效果提高有限，采用直链的富氨基基团可以减小吸附dna的空间位阻；-ch2nh-c2h5nh-c2h5nh2基团，氨基集中且呈直链排列，与dna的吸附/分离作用更容易发生，当处于吸附反应时，更容易与dna结合形成dna-磁珠复合体，从而具有较高的吸附率，而处于洗脱反应时，磁珠与dna更容易分离，总体而言能较容易的获得高的回收率，甚至可以在洗脱dna的情况下，直接使用dna-磁珠复合体进行pcr扩增。所述四氧化三铁纳米颗粒粒径≤30nm，所述二氧化硅包被的四氧化三铁纳米颗粒粒径在35nm-50nm之间。所述二氧化硅包被的四氧化三铁纳米颗粒粒径过小，由于空间位阻和分子间作用力较大，则造成其表面接枝有富氨基基团难度增加，反应困难；粒径过大则造成比表面积较小，吸附dna时不能与dna充分接触，导致最终的提取效果不佳。本发明提供的氨基磁珠的制备方法，包括以下步骤：将二氧化硅包被的四氧化三铁纳米磁珠颗粒，采用3-[2-(2-氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基三甲氧基硅烷作为烷基化试剂，进行表面改性，共价接枝富氨基基团；具体为：(1)将二氧化硅包被的四氧化三铁纳米磁珠颗粒分散于有机溶液中，使得二氧化硅包被的四氧化三铁纳米磁珠颗粒的浓度在2-7mg/ml，获得二氧化硅包被的四氧化三铁纳米磁珠颗粒分散液；所述有机溶液优选为二甲基甲酰胺(dmf)、和/或甲苯；所述氧化硅包被的四氧化三铁纳米磁珠颗粒的粒径在35nm-50nm之间；所述二氧化硅包被的四氧化三铁纳米磁珠颗粒按照以下方法制备：取纳米四氧化三铁颗粒分散与醇水溶液中，加入正硅酸四乙酯的乙醇溶液和氨水，使得每0.1g四氧化三铁粉末相应添加0.4-0.6g的正硅酸四乙酯、以及1-2.5ml的氨水，发生溶胶凝胶反应，洗涤烘干获得所述二氧化硅包被的四氧化三铁纳米磁珠颗粒，所述纳米四氧化三铁颗粒粒径≤30nm优选20nm，所述醇水溶液乙醇与水体积比为3:1-4:1；所述硅酸四乙酯的乙醇溶液浓度在0.1-0.5g/ml之间；所述溶胶凝胶反应的反应条件为维持纳米颗粒分散、60℃～100℃反应8～12h。(2)向步骤(1)中加入烷基化试剂3-[2-(2-氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基三甲氧基硅烷、以及氨水，使得每0.1g氧化硅包被的四氧化三铁纳米磁珠颗粒，对应添加烷基化试剂4-10mmol、以及氨水0.15-0.2ml，维持纳米颗粒的分散状态获得前体分散液；(3)对于步骤(2)中获得的前体分散液，在室温至100℃反应8～12h发生烷基化反应，洗涤烘干后获得所述氨基磁珠。本发明提供的氨基磁珠应用于全血dna提取，具体为：s1、向经蛋白酶预处理的全血样本中加入dna结合液和本发明提供的氨基磁珠，混匀反应10-40min，固液分离获得吸附有dna的氨基磁珠；每200μl全血样本对应使用所述氨基磁珠2-3mg；s2、采用乙醇的水溶液进行洗涤；所述乙醇的水溶液1-2ml，其浓度(本发明所采用的乙醇浓度皆以体积比计)在70-75％，洗涤次数大于等于两次，获得磁珠-dna复合物；所述磁珠-dna复合物可直接用于扩增、测序，也可以进行步骤s3洗脱；s3、向所述磁珠-dna复合物加入洗脱液，将dna洗脱，固液分离收集液相获得提取的全血dna样本；每2.5mg氨基磁珠，使用200至1000微升洗脱液。一般全血dna提取方法，200μl全血样本dna提取方法的洗脱后样品体积在50-80μl，浓度可达到pcr反应所需。本发明提供的氨基磁珠具有较高的回收率，200μl全血样本最终洗脱得到200至1000μl的浓度达到pcr反应所需的样品，dna浓度在20μg/ml以上，可供多次实验或大量扩增所需。以下为实施例：实施例1本发明提供的氨基磁珠的制备方法，包括以下步骤：将二氧化硅包被的四氧化三铁纳米磁珠颗粒，采用3-[2-(2-氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基三甲氧基硅烷作为烷基化试剂，进行表面改性，共价接枝富氨基基团；具体为：(1)将二氧化硅包被的四氧化三铁纳米磁珠颗粒分散于有机溶液中，使得二氧化硅包被的四氧化三铁纳米磁珠颗粒的浓度在5.5mg/ml，获得二氧化硅包被的四氧化三铁纳米磁珠颗粒分散液；所述有机溶液为二甲基甲酰胺(dmf)；所述氧化硅包被的四氧化三铁纳米磁珠颗粒的粒径在35nm-50nm之间；所述二氧化硅包被的四氧化三铁纳米磁珠颗粒按照以下方法制备：取纳米四氧化三铁颗粒分散与醇水溶液中，加入正硅酸四乙酯的乙醇溶液和氨水，使得每0.1g四氧化三铁粉末相应添加0.5g的正硅酸四乙酯、以及2ml的氨水，发生溶胶凝胶反应，洗涤烘干获得所述二氧化硅包被的四氧化三铁纳米磁珠颗粒，所述纳米四氧化三铁颗粒粒径20nm，所述醇水溶液乙醇与水体积比为2.5:1；所述硅酸四乙酯的乙醇溶液浓度在0.25g/ml之间；所述溶胶凝胶反应的反应条件为维持纳米颗粒分散、80℃反应10h。(2)向步骤(1)中加入烷基化试剂3-[2-(2-氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基三甲氧基硅烷、以及氨水，使得每0.1g氧化硅包被的四氧化三铁纳米磁珠颗粒，对应添加烷基化试剂5.4mmol、以及氨水0.18ml，维持纳米颗粒的分散状态获得前体分散液；(3)对于步骤(2)中获得的前体分散液，在60℃反应10h发生烷基化反应，洗涤烘干后获得所述氨基磁珠。制备得到的氨基磁珠，表面接枝-ch2nh-c2h5nh-c2h5nh2，表面键合氨基密度0.1884μmol/mg。实施例2本发明提供的氨基磁珠的制备方法，包括以下步骤：将二氧化硅包被的四氧化三铁纳米磁珠颗粒，采用3-[2-(2-氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基三甲氧基硅烷作为烷基化试剂，进行表面改性，共价接枝富氨基基团；具体为：(1)将二氧化硅包被的四氧化三铁纳米磁珠颗粒分散于有机溶液中，使得二氧化硅包被的四氧化三铁纳米磁珠颗粒的浓度在6.5mg/ml，获得二氧化硅包被的四氧化三铁纳米磁珠颗粒分散液；所述有机溶液为二甲基甲酰胺(dmf)；所述氧化硅包被的四氧化三铁纳米磁珠颗粒的粒径在35nm-50nm之间；所述二氧化硅包被的四氧化三铁纳米磁珠颗粒按照以下方法制备：取纳米四氧化三铁颗粒分散与醇水溶液中，加入正硅酸四乙酯的乙醇溶液和氨水，使得每0.1g四氧化三铁粉末相应添加0.55g的正硅酸四乙酯、以及2ml的氨水，发生溶胶凝胶反应，洗涤烘干获得所述二氧化硅包被的四氧化三铁纳米磁珠颗粒，所述纳米四氧化三铁颗粒粒径30nm，所述醇水溶液乙醇与水体积比为4:1；所述硅酸四乙酯的乙醇溶液浓度在0.45g/ml之间；所述溶胶凝胶反应的反应条件为维持纳米颗粒分散、80℃反应10h。(2)向步骤(1)中加入烷基化试剂3-[2-(2-氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基三甲氧基硅烷、以及氨水，使得每0.1g氧化硅包被的四氧化三铁纳米磁珠颗粒，对应添加烷基化试剂10mmol、以及氨水0.2ml，维持纳米颗粒的分散状态获得前体分散液；(3)对于步骤(2)中获得的前体分散液，在室温℃反应12h发生烷基化反应，洗涤烘干后获得所述氨基磁珠。制备得到的氨基磁珠，表面接枝-ch2nh-c2h5nh-c2h5nh2，表面键合氨基密度0.1968μmol/mg。实施例3本发明提供的氨基磁珠的制备方法，包括以下步骤：将二氧化硅包被的四氧化三铁纳米磁珠颗粒，采用3-[2-(2-氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基三甲氧基硅烷作为烷基化试剂，进行表面改性，共价接枝富氨基基团；具体为：(1)将二氧化硅包被的四氧化三铁纳米磁珠颗粒分散于有机溶液中，使得二氧化硅包被的四氧化三铁纳米磁珠颗粒的浓度在2.2mg/ml，获得二氧化硅包被的四氧化三铁纳米磁珠颗粒分散液；所述有机溶液为二甲基甲酰胺(dmf)；所述氧化硅包被的四氧化三铁纳米磁珠颗粒的粒径在35nm-50nm之间；所述二氧化硅包被的四氧化三铁纳米磁珠颗粒按照以下方法制备：取纳米四氧化三铁颗粒分散与醇水溶液中，加入正硅酸四乙酯的乙醇溶液和氨水，使得每0.1g四氧化三铁粉末相应添加0.4的正硅酸四乙酯、以及1的氨水，发生溶胶凝胶反应，洗涤烘干获得所述二氧化硅包被的四氧化三铁纳米磁珠颗粒，所述纳米四氧化三铁颗粒粒径20nm，所述醇水溶液乙醇与水体积比为3:1；所述硅酸四乙酯的乙醇溶液浓度在0.15g/ml之间；所述溶胶凝胶反应的反应条件为维持纳米颗粒分散、60℃反应12h。(2)向步骤(1)中加入烷基化试剂3-[2-(2-氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基三甲氧基硅烷、以及氨水，使得每0.1g氧化硅包被的四氧化三铁纳米磁珠颗粒，对应添加烷基化试剂4mmol、以及氨水0.15ml，维持纳米颗粒的分散状态获得前体分散液；(3)对于步骤(2)中获得的前体分散液，在60℃℃反应12hh发生烷基化反应，洗涤烘干后获得所述氨基磁珠。制备得到的氨基磁珠，表面接枝-ch2nh-c2h5nh-c2h5nh2，表面键合氨基密度0.1933μmol/mg。实施例4全血dna提取实验使用实施例1至3的氨基磁珠和用作对比的磁珠1、磁珠2和磁珠3，表面键合氨基密度如下表所示：磁珠1：aptes键合氧化硅包被的四氧化三铁合成方法：0.1g氧化硅包被的四氧化三铁超声30min分散于95ml乙醇和5ml组成的混合溶液中，加入0.65mlaptes，室温机械搅拌反应12h。磁珠2：eptes键合氧化硅包被的四氧化三铁合成方法：0.1g氧化硅包被的四氧化三铁超声30min分散于16mldmf中，加入0.18ml氨水和2mleptes，室温机械搅拌反应12h。磁珠3：edps键合氧化硅包被的四氧化三铁合成方法：0.1g氧化硅包被的四氧化三铁超声30min分散于16mldmf中，加入0.18ml氨水和2mledps，室温机械搅拌反应12h。四种磁珠萃取全血中dna步骤如下：1.取200μl全血加入20μltritonx-100和20μl0.5μg/ml蛋白酶k，56℃放置10min；2.在处理好的全血样本中加入1.76mldna结合液(ph3.0,10mmtris-hcl，1mmedta)，再分别加入2.5mg以上四种氨基键合磁珠，震荡10min；3.70％乙醇洗涤三次，磁铁分离；4.加入200μldna洗脱液(ph10.0，10mmtris-hcl，1mmedta)，70℃，500rpm，20min；5.8000rpm离心3min，取上清液，进行dna浓度和纯度测定，结果如下表。简称dna浓度(μg/ml)a260/a280aptes25.11.42eptes25.01.59edps32.22.16实施例149.01.85实施例247.91.80实施例347.71.82a260/a280指标用于表征dna的纯度，接近1.80则显示样本具有较高的纯度。上表显示本发明实施例1至3制备的氨基磁珠进行dna提取时，吸附的dna浓度和纯度明显高于对比用的氨基磁珠。对核酸样本的检测灵敏度高、以鲑鱼精dna作为模型dna萃取计算的萃取的回收率可以达到92％以上，明显高于其他方法制备的磁珠。本方法不但可以采用洗脱的方法回收dna用于下游分析；也可以直接将磁珠-dna复合物作为pcr反应的模板进行pcr扩增，都可以取得很好的效果。实施例51.取200μl全血加入20μltritonx-100和20μl0.5μg/ml蛋白酶k，56℃放置10min；2.在处理好的全血样本中加入1.76mldna结合液(ph3.0,10mmtris-hcl，1mmedta)，再加入2.5mg实施例1氨基键合磁珠，震荡10min；3.70％乙醇洗涤三次，磁铁分离；4.加入200μldna洗脱液(ph10.0,10mmtris-hcl，1mmedta)，70℃，500rpm，20min；5.8000rpm离心3min，取上清液，作为dna模板进行pcr和rt-pcr。6.pcr引物β-acting序列名称序列β-actin-fggcatgggtcagaaggattβ-actin-rcacacgcagctcattgtaga7.pcr反应体系组分体积2×pcrmix12.5μlf/r各1μldna0.5μl灭菌注射用水10.5μl总体积25μlpcr反应程序实施例61.取200μl全血加入20μltritonx-100和20μl0.5μg/ml蛋白酶k，56℃放置10min；2.在处理好的全血样本中加入1.76mldna结合液(ph3.0,10mmtris-hcl，1mmedta)，再加入2.5mg实施例1氨基键合磁珠，震荡10min；3.70％乙醇洗涤三次，磁铁分离；4.加入600μldna洗脱液(ph10.0,10mmtris-hcl，1mmedta)，70℃，500rpm，20min；5.8000rpm离心3min，取上清液，作为dna模板进行pcr和rt-pcr。6.pcr引物序列、pcr反应体系和pcr反应程序同实施例5。实施例71.取200μl全血加入20μltritonx-100和20μl0.5μg/ml蛋白酶k，56℃放置10min；2.在处理好的全血样本中加入1.76mldna结合液(ph3.0,10mmtris-hcl，1mmedta)，再加入2.5mg实施例1氨基键合磁珠，震荡10min；3.70％乙醇洗涤三次，磁铁分离；4.加入1mldna洗脱液(ph10.0,10mmtris-hcl，1mmedta，)，70℃，500rpm，20min；5.8000rpm离心3min，取上清液，作为dna模板进行pcr和rt-pcr。6.pcr引物序列、pcr反应体系和pcr反应程序同实施例5。实施例81.取200μl全血加入20μltritonx-100和20μl0.5μg/ml蛋白酶k，56℃放置10min；2.在处理好的全血样本中加入1.76mldna结合液(ph3.0,10mmtris-hcl，1mmedta)，再加入2.5mg实施例1氨基键合磁珠，震荡10min；3.70％乙醇洗涤三次，磁铁分离；4.室温晾干后，将磁珠-dna复合物分散于500μlte缓冲液(ph10.0,10mmtris-hcl，1mmedta)中；5.直接取磁珠-dna复合物的分散液5μl作为dna模板进行pcr。6.pcr引物egfr序列名称序列egfr-fcaggaggtggctggttatgtegfr-ragctccttcagtccggtttt7.pcr反应体系pcr反应程序实施例91.取200μl全血加入20μltritonx-100和20μl0.5μg/ml蛋白酶k，56℃放置10min；2.在处理好的全血样本中加入1.76mldna结合液(ph3.0,10mmtris-hcl，1mmedta)，再加入2.5mg实施例1氨基键合磁珠，震荡10min；3.70％乙醇洗涤三次，磁铁分离；4.室温晾干后，将磁珠-dna复合物分散于500μlte缓冲液(ph10.0,10mmtris-hcl，1mmedta)中；5.直接取磁珠-dna复合物的分散液5μl作为dna模板进行pcr和rt-pcr。6.pcr引物egfr序列名称序列egfr-fcaggaggtggctggttatgtegfr-ragctccttcagtccggtttt7.pcr反应体系组分体积2×pcrmix12.5μlf/r各1μldna10μl灭菌注射用水0.5μl总体积25μlpcr反应程序本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12