用于免疫微球单一分布的微流体芯片、方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种用于免疫微球单一分布的微流体忍片、方法及其应用，更确切地 说是一种可W将免疫磁珠单一分布及将免疫反应、清洗及检测于一体的检测系统，包括微 流体忍片领域和微球免疫检测方法。
【背景技术】
[0002] W微球或磁性微球作为生化反应的固相支持物对生物检测方法具有重要意义。微 球具有的高体表比，使其表面能结合大量的抗体及其他生物分子探针，伴随着轻微震荡，微 球能够悬浮在液相体系中，微球表面充分和溶液接触，表面溶液时刻更新，传质影响较小， 表面修饰的生物分子与溶液中的目标分子相互作用的几率增大，彼此结合的动力学和热力 学性质都得到改善，从而明显缩短了分析时间。微球可W通过不同颜色的巧光物质标记，同 样作为一种高通量分析载体得到了广泛的应用。
[0003] 在常规的反应试管或微孔板里，微球虽然可W较好地悬浮在液相体系里，但是由 于微球表面的电荷特性、微球表面一些基团的交联作用W及缓冲溶液中离子浓度的变化等 原因会导致微球聚集成簇，严重影响微球表面的生物分子反应效率;另外，对于检测巧光信 号的反应体系来说，聚集成簇的微球容易造成巧光信号的干扰。因此，需要一种可将微球能 单一、均匀分布的系统。
[0004] 另外，在对于大部分免疫反应及生化反应来说，反应结束后都需要用洗液清洗未 参与反应的多余的生物分子及信号探针，W降低非特异信号的干扰，获得较高的信噪比。而 如果利用微球作为固相支持物，运个清洗过程就会变得非常为复杂，目前常用的方法就是 离屯、，而离屯、过程不仅比较费时，还会导致磁珠进一步聚集，影响后续信号的检测。微流体 忍片技术的发展可W为解决运个问题提供技术支持。微流体分析忍片是W微机电加工为手 段，把样品预处理、反应、分离、检测等基本操作单元集成在一块几厘米大小的忍片上。利用 微流体忍片不仅可W缩小分析仪器体积，还可W减小试剂消耗，加快反应速度，成本低甚至 一次性使用，还具有易操控、易集成、通量大等优势。因此，利用微流体忍片技术，在玻璃或 PDMS(聚二甲基硅氧烷)等基片上，刻蚀微管道、微孔或微反应腔，从而构建将磁珠单一分 布、免疫反应、清洗及检测为一体的检测体系。
[0005] 专利文献1(CN 1635146A)公开了一种一维微珠忍片用于基因及蛋白的表达分析。 该忍片是在微流控忍片微分离通道上设置多个小室，不同的小室利用显微操作技术放置表 面修饰了不同生物分子的微颗粒;在进行基因分析或蛋白分析时，微颗粒特异性地识别和 捕获多种目标分子，然后引入巧光实际，微颗粒表面最终特异性结合上巧光标记物，再用巧 光成像检测。该方法设计虽然具有微流控技术和阵列分析的优点，但所述的方法需要压力 驱动或者电驱动，微珠分散技术比较繁琐。分析微珠的尺寸比较大，数量低，准确度低，重复 性差。且该忍片只有一个单元，难W实现高通量分析。
[0006] 文南犬2(Henley;2012.Fabrication of microfluidic devices containing patterned microwell arrays .Anal .Qiem. 84(3), 1776-1780)报道了一种基于微孔阵列的 微流体装置，在压力驱动下，将大量的微珠引入微流体装置。此忍片只有一个单元，微珠的 填充率低。在流体驱动下，造成大量微珠流失。文献3(Fi 1 ipponi , L. , 2009. Microbeads on microposts:an inverted architecture for bead microarrays .Biosens .Bioelectron. 24(7), 1850-1857)报道了一种微珠固定在微孔中的 方式，在加热PDMS之前，微珠被均匀分散在娃片阳模上，然后利用PDMS复制阳模上的结构， 标有抗体的微珠被固定在了PDMS上。但此方法易造成蛋白的变性，高溫下，抗原抗体等生物 分子容易失活。
[0007] 因此，目前面临的技术性难题在于研发一款在结构和微珠操控方式上比较简单的 忍片，不仅实现微珠的均匀分布，而且可W达到高通量，高灵敏度的要求。从而引导出本发 明的构思。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于提供一种可将微球单一分布的多通道微流体忍片、制备方法及 其在离体的肿瘤标志物检测方面的应用；
[0009] 首先，本发明提供了一种多通道微流体忍片。该忍片是由平行排列的样品池组成， 每个样品池是由20000个直径ΙΟμπι的微孔组成，每个微孔可W分布一个免疫微球，每个样品 池相互独立，互不影响。样品池的数量可W根据实际需求改变而改变，不只局限于16个。16 个只是为叙述方便和经常使用的样品池数目。
[0010] 本发明提供了一种所述的微流体忍片的制备方法:利用娃片作衬底，在第一层掩 模板的保护下，利用SU-83050光刻胶，经过甩胶，前烘，曝光，后烘，显影后做出阳模的第一 层，厚度大概是200皿左右。运个高度即是后续样片池的高度，可W容纳多达10μ1的液体。然 后在第一层的基础上进行第二层掩模板的套刻。在第二层微柱层掩模板的保护下，利用ΡΙ (聚酷亚胺)光刻胶制备出所要的微柱结构层，8-10WI1左右。运个高度略大于单个聚苯乙締 微珠的直径，刚好容纳一个微珠。两层结构做好后，在170~200°C的热板上硬烘30~60min， 运样防止模具因多次使用而造成光刻胶的脱落。完成整个模具结构的制作后，在娃片上复 制出的阴模结构即为所要的微流体忍片结构。
[0011] 本发明还提供了一种所述的微流体忍片应用于肿瘤标志物的离体的免疫检测:首 先用NHS(N-Hyd;roxysuccinimide，N-?基硫代硫代班巧酷亚胺）/抓C(l-ethyl-3-[3- dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride，1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二 亚胺盐酸盐)活化微球的方式分别标记Ξ种肿瘤标志物的捕获抗体。然后是将一定量的微 球(20000~30000个/反应），一定浓度的混合好的待检测标准品：CYFRA21-1(打agments of 巧tokeratin 19,细胞角蛋白片段 19)抗原、CEA(ca;rcinoemb;ryonic antigen,癌胚抗原）抗 原、N沈(neuron-specific enolase，神经締醇化酶)抗原、空白对照及待测样本(各ΙΟμΙ)和 不同发射波长的量子点标记的检测抗体(QD-625:1.5~2nM;QD-525及孤-585:20~25碰)滴 加到微阵列忍片中间区域37°C解育30~60min;红色量子点孤-625识别CYFRA21-1抗原，黄 色量子点QD-585识别CEA抗原，绿色量子点孤-525识别N沈抗原;解育结束后，可直接将整块 微流体忍片放在自动摇床上W2000~3000转速清洗5分钟，运样可W保证16个反应单元清 洗步骤的同步性，减小操作误差。最后用巧光显微镜观察并拍照，并用现有的图像分析软件 对图形信号进行分析(具体方法见专利CN201510329958X)。
[0012] 在本发明提供的微阵列忍片检测肿瘤标志物方法中，所述的微球是聚苯乙締微 球，直径为6.5皿，本身的背景巧光值低，对于后续的分析不会造成干扰。
[0013] 本发明所提供的微阵列忍片检测肿瘤标志物的方法中，所述的量子点为CdSe/ZnS (砸化儒/硫化锋)氨基量子点。其水溶性好，量子产率高，抗光漂白性强。
[0014] 综上所述，本发明提供的微流体忍片，集成了 16个带有微孔的结构单元，因此可W 在一块忍片上实现对多个样品进行同时检测；且每个单元相互独立，避免了液体回流混合 造成的试剂的交叉污染。所用的免疫微球可W单一地沉积在检测区域的每个微孔里，提高 了微球的分散性，不仅提高了反应的效率，而且避免了微球堆积造成的微球信号之间的干 扰。本发明所提供的微流体忍片，清洗方便，操作简单，大大提高了反应的效率，检测灵敏度 比较也高，