专利名称：可逆封装微流体分离提纯生物样品处理芯片的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种可逆封装微流体分离提纯生物样品处理芯片，用于生物样品中分离提纯，具体涉及从各种生物样品中提取DNA、RNA、蛋白质或细胞等生物样品。
背景技术：
微流体生物芯片是以微机电系统(MEMS)加工技术为基础，结合分析化学和分析生物化学技术，以微沟道网络为结构特征，可完成样品预处理、单成分检测、PCR扩增及DNA测序等多项功能，可实现对基因、配体、抗原和活体细胞等进行测试分析的目的，在生物医学和临床诊断上有着广泛的应用前景。微流体生物芯片体积小，大大减少了试剂的消耗，缩短了反应的时间，同时使高通量、大规模、实时检测成为可能。目前，对微流体生物芯片的研究主要有DNA扩增微流体生物芯片、毛细管电泳生物芯片、介电电泳细胞分离芯片等。
目前，微流体生物芯片大多采用硅-玻璃的键合工艺形成永久性封闭微沟道，这种技术的优点是不会漏液；缺点是永久性微沟道不能反复拆卸，因此不易清洗芯片，芯片易出现堵塞问题。
生物大分子或细胞的分离纯化技术是生化分析的关键技术，可以直接获得高纯度的生物大分子或细胞；而且高纯度的生物大分子或细胞将直接影响后续实验的成功，因此寻求快速、高效、简易、低成本的分离提纯方法一直是生化分析工作者的不断追求。目前，常规的分离纯化的方法有透析、微过滤、盐析和离心等。
透析法是一种简单的分离纯化法，只需将待分离纯化的样品封入由半透膜组成的透析袋中，然后将袋子放入低离子强度的透析液中进行透析。只有膜内分子量小于某一分子量的分子可以透过膜进入透析液中，从而实现了大分子和小分子的分离。这虽是一种简单的方法，但是最大的缺点是耗时，而且使用范围有限，主要用于滤去生物大分子样品中的盐类或样品浓缩。
微过滤法是以多孔薄膜为过滤介质，让样品溶液通过多孔膜过滤。主要用于滤除小颗粒使混浊液澄清，收集纯的沉淀以供分析；也可用于收集细菌细胞。这种方法的最大缺点也是耗时。
盐析法是根据盐类使蛋白质脱去水化膜，同时压缩蛋白质分子周围的双电层使蛋白质分子相互聚集而沉淀，从而实现蛋白质的分离纯化。该法主要用于蛋白质的分离提纯，不同的蛋白质可以选择不同的盐在合适的浓度和pH值的条件下分离提纯。缺点是该方法不但受温度的影响，而且选择合适的盐、调节合适浓度和pH值的做法比较复杂，而最大的缺点是分离提取的蛋白质大多还要进行脱盐步骤。
离心法是利用不同颗粒的质量、密度、大小和形状等各不相同性质，在同一固定的离心场中沉降的速度也不相同，因此得到相互间的分离。它是蛋白质、酶、核酸及细胞亚组分分离的最常用的方法之一。但是也存在很大的不足，例如高速离心可能破坏了某些生物大分子的结构。为了达到最好的分离效果，大多采用某些特殊的溶液进行离心，例如采用苯酚和氯仿提取DNA，该法虽然适用于大多数生物样本，但是操作步骤复杂、提取效率不稳定、离心过程中容易带入污染物，而且苯酚、氯仿均有挥发毒性，长期使用严重危害人体健康。另外，还可以在离心管中加入玻璃珠，同时依赖离心作用和DNA与玻璃珠表面静电吸附作用分离提纯DNA，其优点在于可以去除大部分杂质，对污染生物样本比较适合，但是由于玻璃珠比表面积小，提取效率较低，而且实验过程需要多次离心，步骤繁琐。
本实验室对微芯片固相萃取(SPE法)分离提纯技术已有初步的研究，SPE法是利用一些固体物质的表面，如硅片、玻璃、离子交换树脂或经过修饰的磁珠等材料表面，作为载体特异性吸附生物大分子，然后采用离心法进行分离提纯；微芯片SPE法是指利用芯片中的微结构作为固相萃取的载体，整个分离提纯过程在芯片中完成。但是常规的SPE法大多由于固相载体的比面积的限制，使得提取效率有限。
发明内容
本发明目的在于制备了一种分离提纯效果好、可反复多次使用的可逆封装微流体生物样品处理芯片，提出这种可逆封装微流体生物样品处理片的制备方法及其在生物样品分离提纯中的应用。
为实现上述目的，本发明的技术解决方案是提供一种可逆封装微流体生物样品处理芯片，用于生物样品分离提纯，采用硅片、聚二甲基硅氧烷和玻璃为芯片主体材料，在硅片上刻蚀出微沟道，在微沟道两端刻蚀出进样、出样孔或进样、出样流通池，进样、出样孔或进样、出样流通池的开口向下或向上，聚二甲基硅氧烷膜和玻璃片复合成盖板，聚二甲基硅氧烷膜覆于玻璃片的内表面，与硅片连接；同时对微沟道进行修饰，在微沟道表面制备氧化硅层或多孔氧化硅层，该氧化硅层或多孔氧化硅层作为分离提纯的固相载体；硅片与盖板能进行可逆封装，可反复拆装，多次使用。
所述的可逆封装微流体生物样品处理芯片，其所述硅片与盖板进行可逆封装，是采用硅片与玻璃片内表面的聚二甲基硅氧烷进行可逆封装形成封闭微沟道。
所述的可逆封装微流体生物样品处理芯片，其所述氧化硅层或多孔氧化硅层在芯片微沟道的表面，该氧化硅层或多孔氧化硅层作为分离提纯的固相载体。
所述的可逆封装微流体生物样品处理芯片，其所述微沟道为V形、梯形、U形或者矩形。
所述的可逆封装微流体生物样品处理芯片，其所述矩形微沟道中含有微柱。
所述的可逆封装微流体生物样品处理芯片，其所述微柱为方柱或圆柱。
所述的可逆封装微流体生物样品处理芯片，其所述氧化硅层或多孔氧化硅层在芯片微沟道的表面和微沟道中的微柱壁上。
所述的可逆封装微流体生物样品处理芯片的制造方法，过程是(a)氮化硅作为刻蚀硅片和制备多孔氧化硅层的掩膜，采用负胶或正胶作为光刻掩膜；(b)甩胶后光刻；(c)在硅片上刻蚀出微沟道，进样、出样孔或进样、出样流通池；其在(c)步中，还包括在硅片上刻蚀出微沟道和微沟道中的微柱；(d)在微沟道或微沟道和微沟道中的微柱表面制备氧化硅层或多孔氧化硅层；(e)将聚二甲基硅氧烷预聚物旋涂在打孔或无孔玻璃的内表面上，聚二甲基硅氧烷预聚物固化后与玻璃片形成盖板；将聚二甲基硅氧烷预聚物旋涂在玻璃的内表面上，聚二甲基硅氧烷预聚物固化后与玻璃形成盖板；(f)封装，将硅片与盖板进行可逆封装，得成品。
所述的可逆封装微流体生物样品处理芯片的制造方法，其所述(c)步中，采用各相异性腐蚀液腐蚀硅片形成V形、U形或梯形微沟道，或采用深刻蚀技术，在硅片上刻蚀出矩形微沟道或矩形微沟道和矩形微沟道中的微柱；采用各相异性腐蚀液腐蚀技术或深刻蚀技术制备进样、出样孔或进样、出样流通池。
所述的可逆封装微流体生物样品处理芯片的制备方法，其所述(d)步中，采用电化学腐蚀法在氢氟乙醇溶液中制备多孔硅，然后在低温热氧化制备多孔氧化硅层，温度范围为400-800℃；或直接高温氧化形成氧化硅层，温度范围为1000-1200℃。
所述的可逆封装微流体生物样品处理芯片的制备方法，其所述(d)和(e)步之间，还有在玻璃片上对应硅片进样、出样流通池位置打孔。
所述的可逆封装微流体生物样品处理芯片的制造方法，其所述(f)步中，封装是采用硅片与盖板内表面的聚二甲基硅氧烷进行可逆封装形成封闭微沟道。
所述的可逆封装微流体生物样品处理芯片的制造方法，其所述c)步中，进样、出样孔为硅片上的通孔，进样、出样流通池为盲孔，开口向上。
所述的可逆封装微流体生物样品处理芯片，其特征在于，可在生物样品分离提纯中，多次反复应用。
所述的可逆封装微流体生物样品处理芯片，其可从生物样品中分离提纯DNA，RNA，蛋白质或细胞。
本发明技术效果为通过硅片与聚二甲基硅氧烷膜(PDMS)、玻璃片可逆封装制备封闭微沟道，无需键合工艺完成芯片的制造，提高了芯片的成品率，降低了生产成本，同时由于可逆封装有利于清洗芯片，该芯片可以重复多次使用，延长芯片的使用寿命。
图1为本发明可逆封装微流体分离提纯生物样品处理芯片的硅片开口型多孔氧化硅微流体生物芯片结构示意图；图2为本发明可逆封装微流体分离提纯生物样品处理芯片的盖板开口型多孔氧化硅微流体生物芯片结构示意图；图3为本发明可逆封装微流体分离提纯生物样品处理芯片的硅片开口型多孔氧化硅微流体样品预处理芯片的微沟道表面电化学腐蚀法制备的多孔硅扫描电镜图。
具体实施例方式
本发明可逆封装微流体分离提纯生物样品处理芯片，用于生物样品中分离提纯，采用硅片7、聚二甲基硅氧烷(PDMS)8、玻璃9为芯片主体材料，在硅片7上刻蚀出微沟道1，在微沟道1两端刻蚀出进样、出样孔2或进样、出样流通池3，硅片7上可逆封装聚二甲基硅氧烷8和玻璃9组成盖板4，同时对微沟道1进行修饰，在微沟道1表面制备氧化硅层或多孔氧化硅层5，该氧化硅层或多孔氧化硅层5作为分离提纯的固相载体。微沟道1为V形、梯形或矩形，在矩形微沟道1中制有阵列式微柱6，相邻微柱6的间距按需要选定，微柱6形状通常为圆柱或方柱。氧化硅层或多孔氧化硅层5仅存在于芯片微沟道1表面和微沟道中的微柱6壁上。可逆封装微流体生物处理芯片，其盖板4以聚二甲基硅氧烷(PDMS)层8和玻璃片9组成，聚二甲基硅氧烷(PDMS)层8覆于玻璃片9的内表面，与硅片7连接，玻璃片9为普通玻璃。采用硅片7和盖板4进行可逆封装，形成封闭微沟道1。
多孔氧化硅微流体生物样品处理芯片的制造方法为在硅片7化学气相沉积氮化硅，作为刻蚀硅片7和制备多孔氧化硅层5的掩膜；采用负胶或正胶作为光刻掩膜，甩胶后光刻；采用各相异性腐蚀液腐蚀硅片7形成V形或梯形微沟道1，或采用深刻蚀技术刻蚀出矩形微沟道1或矩形微沟道1和微沟道1中的微柱6；采用各相异性腐蚀液腐蚀技术或深刻蚀技术制备进样、出样孔2或进样、出样流通池3；采用电化学腐蚀法在氢氟(HF)乙醇溶液中制备多孔硅，然后低温热氧化法制备多孔氧化硅层5，温度范围为400-800℃；或直接高温氧化形成氧化硅层5，温度范围为1000-1200℃；刻蚀多余氮化硅；在玻璃片9上对应硅片7进样、出样流通池3位置打孔，将聚二甲基硅氧烷8预聚物旋涂在打孔或无孔玻璃9的内表面上，聚二甲基硅氧烷8预聚物固化后与玻璃片9形成盖板4；采用硅片7和盖板4进行可逆封装形成封闭微沟道1。
本发明中，聚二甲基硅氧烷(PDMS)8与玻璃9形成的盖板4与硅片7进行封装是指将盖板4小心放在硅片7上，由于氢键、范德华力、静电力等的作用，盖板4上的聚二甲基硅氧烷(PDMS)8与硅片7粘接在一起，进而形成了封闭的微沟道1。同时由于氢键、范德华力、静电力的作用力较小的缘故，盖板4可以通过用薄刀片等器具小心剥离下来，对微沟道1可以进行彻底清洗。可逆封装是指由于剥离开的盖板4和硅片7保持完好，在彻底清洗后剥离开的盖板4和硅片7均可再次粘接，重复多次使用。由于传统芯片采用玻璃9和硅片7阳极键合，玻璃9和硅片7之间形成了牢固的化学键，一旦键合完成就无法将玻璃9和硅片7完好的剥离开来，同时由于微沟道尺寸小，在进行生物实验后不易清洗。而本发明采用玻璃9与聚二甲基硅氧烷(PDMS)8形成盖板4可以通过盖板4与硅片7的可逆封装克服上述缺点。
本发明的特点在于硅片7与盖板4进行可逆封装，可反复拆装，多次使用。利用微机电系统(MEMS)加工技术在硅芯片7的微沟道1中制备有氧化硅层或多孔氧化硅层5，该氧化硅层或多孔氧化硅层5作为分离提纯的固相载体，而微芯片上微沟道1的宽度、长度和深度以及微沟道中微柱6的直径、高度和间隙可以根据具体情况有所变化，此外微沟道1可以设计成整体的微池形状，微沟道1及微柱6的任何形状和尺寸均落在本发明的保护范围内。
下面结合附图描述本发明优选的方案，但不限制本发明的范围。
实施例一清洗N型低电阻(0.011-0.014Ω.cm)双面抛光单晶硅片7；生长2000氮化硅(氮化硅厚度可选择1000-7000)作为刻蚀硅片7和制备多孔氧化硅层5的掩膜；甩负性光刻胶BN303(负胶)，在Karlsuss MA4型光刻机上曝光后显影；用KOH各相异性腐蚀液腐蚀出进样、出样孔2，进样、出样孔2为单晶硅片7上的通孔，同时腐蚀出深度为140μm(深度可选择为80-150μm)、宽度为200μm微沟道1；1050℃高温热氧化生长氧化硅5；在等离子刻蚀机上用SF6打掉氮化硅；硅片7和盖板4(盖板4为PDMS8和普通玻璃9复合而成)进行可逆封装，制备如图1所示的芯片。生物样品(PCR反应产物、全血等)和试剂通过蠕动泵导入多孔氧化硅微流体生物样品处理芯片，能在40分钟以内提取DNA。该可逆封装微流体生物样品处理芯片避免了键合工艺，大大提高了成品率和缩短了制备时间，可以批量生产，可多次重复使用，避免了使用过程中生物样品堵塞芯片，从而延长了处理芯片的使用寿命。
实施例二清洗N型低电阻(0.011-0.014Ω.cm)双面抛光单晶硅片7；生长2000氮化硅(氮化硅厚度可选择1000-7000)作为刻蚀硅片7和制备多孔氧化硅层5的掩膜；甩正性光刻胶AZ1500和AZ4620(正胶)，在Karlsuss MA4型光刻机上曝光后显影；深刻蚀技术刻蚀出深度为80μm进样、出样流通池3，进样、出样流通池3为盲孔，开口向上，同时深刻蚀出深度为80μm(深度可选择为80-200μm)、宽度为200μm的微沟道1以及微沟道1中微柱6(微柱6间隙为10μm(间隙可选择为5-50μm)，微柱6高度为80μm(高度可选择为50-200μm)，圆形微柱6的直径为10μm(直径可选择为5-50μm)，或方形微柱6的边长为20μm(边长可选择为5-50μm))；在氢氟酸(HF)乙醇溶液中采用电化学腐蚀法制备多孔硅(多孔硅为树枝状或海绵状)；570℃低温热氧化生长多孔氧化硅层5；在等离子刻蚀机上用SF6打掉氮化硅；硅片7与盖板4(盖板4为PDMS8和普通玻璃9复合而成，在盖板4上与芯片进样、出样流通池3相对应位置上打孔)进行可逆封装，制备如图2所示的芯片。生物样品(PCR反应产物、全血等)和试剂通过蠕动泵导入多孔氧化硅微流体生物样品处理芯片，能在60分钟以内完成DNA的分离提取。
权利要求
1.一种可逆封装微流体生物样品处理芯片，用于生物样品分离提纯，采用硅片、聚二甲基硅氧烷和玻璃为芯片主体材料，在硅片上刻蚀出微沟道，在微沟道两端刻蚀出进样、出样孔或进样、出样流通池，进样、出样孔或进样、出样流通池的开口向下或向上，聚二甲基硅氧烷膜和玻璃片复合组成盖板，聚二甲基硅氧烷层覆于玻璃片的内表面，与硅片连接；其特征在于，对微沟道进行修饰，在微沟道表面制备氧化硅层或多孔氧化硅层，该氧化硅层或多孔氧化硅层作为分离提纯的固相载体；硅片与盖板能进行可逆封装，可反复拆装，多次使用。
2.如权利要求1所述的可逆封装微流体生物样品处理芯片，其特征在于，所述硅片与盖板进行可逆封装，是采用硅片与玻璃内表面的聚二甲基硅氧烷进行可逆封装形成封闭微沟道。
3.如权利要求1所述的可逆封装微流体生物样品处理芯片，其特征在于，所述氧化硅层或多孔氧化硅层在芯片微沟道的表面，该氧化硅层或多孔氧化硅层作为分离提纯的固相载体。
4.如权利要求1所述的可逆封装微流体生物样品处理芯片，其特征在于，所述微沟道为V形、梯形、U形或者矩形。
5.如权利要求4所述的可逆封装微流体生物样品处理芯片，其特征在于，所述矩形微沟道中含有微柱。
6.如权利要求5所述的可逆封装微流体生物样品处理芯片，其特征在于，所述微柱为方柱或圆柱。
7.如权利要求5或6所述的可逆封装微流体生物样品处理芯片，其特征在于，所述氧化硅层或多孔氧化硅层在芯片微沟道的表面和微沟道中的微柱壁上。
8.如权利要求1所述的可逆封装微流体生物样品处理芯片的制造方法，过程是(a)氮化硅作为刻蚀硅片和制备多孔氧化硅层的掩膜，采用负胶或正胶作为光刻掩膜；(b)甩胶后光刻；(c)在硅片上刻蚀或腐蚀出微沟道、进样、出样孔或进样、出样流通池；其特征在于，在(c)步中，还包括在硅片上刻蚀出微沟道和微沟道中的微柱；(d)在微沟道或微沟道和微沟道中的微柱表面制备氧化硅层或多孔氧化硅层；(e)将聚二甲基硅氧烷预聚物旋涂在打孔或无孔玻璃的内表面上，聚二甲基硅氧烷预聚物固化后与玻璃片形成盖板；(f)封装，将硅片与盖板进行可逆封装，制得成品。
9.如权利要求8所述的可逆封装微流体生物样品处理芯片的制造方法，其特征在于，所述(c)步中，采用各相异性腐蚀液腐蚀硅片形成V形、U形或梯形微沟道，或采用深刻蚀技术，在硅片上刻蚀出矩形微沟道或矩形微沟道和矩形微沟道中的微柱；采用各相异性腐蚀液腐蚀技术或深刻蚀技术制备进样、出样孔或进样、出样流通池。
10.如权利要求8所述的可逆封装微流体生物样品处理芯片的制备方法，其特征在于，所述(d)步，采用电化学腐蚀法在氢氟酸乙醇溶液中制备多孔硅，然后在低温热氧化制备多孔氧化硅层，温度范围为400-800℃；或直接高温氧化形成氧化硅层，温度范围为1000-1200℃。
11.如权利要求8所述的可逆封装微流体生物样品处理芯片的制备方法，其特征在于，所述(d)和(e)步之间，还有在玻璃片上对应硅片进样、出样流通池位置打孔。
12.如权利要求8所述的可逆封装微流体生物样品处理芯片的制造方法，其特征在于，所述(f)步中，封装是采用硅片与盖板内表面的聚二甲基硅氧烷进行可逆封装形成封闭微沟道，其中含进样、出样口硅片与无孔盖片封装，含进样、出样流通池硅片与打孔盖片封装。
13.如权利要求8或9所述的可逆封装微流体生物样品处理芯片的制造方法，其特征在于，所述c)步中，进样、出样孔为硅片上的通孔，进样、出样流通池为盲孔，开口向上。
14.如权利要求1所述的可逆封装微流体生物样品处理芯片，其特征在于，可在生物样品分离提纯中，多次反复应用。
15.如权利要求12所述的可逆封装微流体生物样品处理芯片，其特征在于，可从生物样品中分离提纯DNA，RNA，蛋白质或细胞。
全文摘要
本发明可逆封装微流体分离提纯生物样品处理芯片，用于生物样品中分离提纯，采用硅片、聚二甲基硅氧烷和玻璃为芯片主体材料，在硅片上刻蚀出微沟道，在微沟道两端刻蚀出进样、出样孔或进样、出样流通池，聚二甲基硅氧烷和玻璃复合成盖板，对微沟道进行修饰，在微沟道表面制备氧化硅层或多孔氧化硅层，该氧化硅层或多孔氧化硅层作为分离提纯的固相载体。通过硅片与盖板(盖板为聚二甲基硅氧烷和玻璃)可逆封装制备封闭微沟道，无需键合工艺完成芯片的制造，提高了芯片的成品率，降低了生产成本，同时由于可逆封装有利于清洗芯片，该芯片可以重复多次使用，延长芯片的使用寿命。
文档编号G01N1/00GK1880329SQ20051007666
公开日2006年12月20日 申请日期2005年6月13日 优先权日2005年6月13日
发明者崔大付, 陈兴 申请人:中国科学院电子学研究所