专利名称：富集和纯化用于包括基质辅助激光解吸附/电离(maldi)质谱(ms)分析的化学分析的分析 ...的制作方法
背景1发明领域本方面涉及质谱，更确切地说，涉及对诸如人血清的生物样品进行预先富集和纯化，从而进行基质辅助激光解吸附电离质谱(MALDI MS)分析。
2.相关技术背景用基质辅助激光解吸附电离质谱(MS)对沉积在MALDI目标板上的样品进行分析，迅速成为对蛋白质、多肽和其它生物分子进行分析的方法。MALDI-MS方法是非常灵敏的方法，也是与生物缓冲液最相适应的方法。另外，能在皮克摩尔级(subpicomole)高效地产生大量生物大分子的离子，使该技术特别有利于对大分子的的分析。对诸如血液、血浆或血清的生物样品粗品中的肽分析物进行分析，给质谱分析带来下述的很多特殊性难题。
第一个需要克服的难题是，生物样品中有大量盐(例如，钠、钾、氯化物、磷酸盐和碳酸盐)。在通常的MALDI分析方法中，阴离子对多肽样品的离子化尤其具有抑制作用。阳离子也存在使主要质谱峰分裂产生多个小峰，导致产生具有附加的阳离子加合物质量的阳离子加合物光谱的问题。另外，成功的MALDI-MS分析还依赖于分析物在被注入到质谱仪之前，分析物与分析物MALDI基质物质有效地形成结晶的能力。MALDI基质物质需要吸收激光，以使基质和所吸附的样品中的分析物发生气化和离子化，从而进行分析。之后，离子化的分析物分子受质谱仪内阳极和阴极之间的高电压产生的高电场的加速进入质谱仪离子检测器中。即使存在少量污染物如盐或甘油时，MALDI基质对诸如蛋白质和多肽等分析物的解吸附和离子化能力也会大大减弱。另外，高浓度盐提高了MALDI-MS需要的激光强度阈值和盐加合物多肽(在损害游离多肽信号的情况下)的强度。
第二，在诸如人血清的样品中，与干扰蛋白(例如白蛋白、免疫球蛋白和转铁蛋白)相比，通常是分析物多肽的拷贝数(copy number)很低。目标多肽常常只有1微摩尔/升-1皮摩尔/升(例如1毫克/毫升到1皮克/毫升)。与此相反，总白蛋白和γ球蛋白，如IgG，IgM的水平范围从0.01克/毫升到0.1克/毫升，是1×1011倍的数量。因此，主要丰度蛋白质在MALDI混合物光谱中占有优势。主要峰使低强度峰变得微弱，所以含量少的成分较难被发现。这个难题在诸如人血清的生物样品中非常严重，因为生物样品中存在高出多个数量级的干扰蛋白(例如白蛋白、免疫球蛋白和转铁蛋白)和盐(例如，钠、钾、氯化物、磷酸盐和碳酸盐)，使低拷贝数分子的检测变得非常困难。
第三，许多分析物多肽是疏水性的，并且与血液、血浆或血清中的主要蛋白结合，尤其是白蛋白倾向于与疏水性分子非特异性结合。因此，去除不需要的蛋白可能导致分析物多肽的损失。诸如盐和清洁剂等化学裂解剂，有助于分析物多肽与白蛋白的解离，但这些试剂抑制MALDI过程。例如聚乙二醇(PEG)和Trition使MALDI高效解离，并且产生比蛋白质、多肽更强的MALDI信号。因此，这些试剂抑制了蛋白质、多肽的MS信号。在加入化学裂解剂使多肽与白蛋白解离后，必须对化学裂解产生的白蛋白和其它污染蛋白与分析物多肽进行分离。另外，要使用含量少的分析物多肽在分离过程中不损失的分离方法。当分析物多肽是疏水性的，倾向于与疏水表面结合时，分离非常困难。如果用液相色谱方法纯化生物多聚体常会导致30％样品的损失，并且会进一步引入污染物。对于大多数MALDI-MS用户，这样的样品损失是不能接受的。
最后，由于分析物多肽的含量很少，在进行MALDI-MS分析前需要富集。首先进行多肽的解离，成分的分离，然后富集。现有技术采用的方法很费力而且需要很多耗时耗力的步骤。本发明的一个目的是提供一种用简便经济方式进行这些步骤的方法和装置。因此，提高了样品通量，减低了分析成本。
文献中已经报道了许多用麻烦费力的技术，来进行MALDI-MS分析前的污染物的分离。通常，基于液相或亲和色谱的方法得到了最大限度的应用。利用液相色谱进行的分离方法包括将连接体分子用化学方法连接到液相色谱柱的固定相(产生官能性的固定相)上。当样品装入色谱柱后，流动相流经固定相。每一种分析物与固定相的结合时间(而不是在流动相中的时间)决定了不同分析物(以及污染物和干扰物)通过液相色谱柱的相对迁移速度，使分析物得到纯化。例如，诸如蛋白质和多肽等目标分析物分子可以被吸附在官能性的固定相上，而污染物则从色谱柱流出。然后，调整流动相使固定相上的目标分子分离出。适用于MALDI-MS的挥发性缓冲液，诸如乙腈/水混合物，可用作此步骤的流动相。用此方式，纯化后的目标分子从液相色谱柱子流出，收集后用于MALDI-MS分析。此时样品一定程度上，不含会干扰或减弱分析灵敏度的盐、其它污染物。
因此，需要在MALDI-MS分析前对样品进行富集的新的装置、方法和程序。
发明目的本发明的目的之一是提供在对诸如血清、血浆、全血、脑脊液、尿液等生物样品进行灵敏的基质辅助激光解吸附电离质谱分析前进行预处理的方法。另一目的是提供一种简便、高效的方法，提高样品通量(throughput)，降低分析成本。再一目的是提供一种这些方法所使用的装置，该装置具有使用方便、提供高质量数据、生产成本较低的特点。最理想的是，该装置可以为用户提供预清洗和预处理，而需要最少的制备步骤和最少的制备时间。另一目的是提供一种装置，该装置的生产成本低，可单独、经济地使用，因而在临床研究和人、兽医学临床诊断应用中，不必考虑过多的花费而自由使用。由于分析结果不会依赖于前期的使用条件、清洗步骤、或分析装置的磨损程度等，这种可以预清洗的装置给使用者带来了改进的一致性和可靠性。在使用前，为使用者提供了不用进行费力的手工清洗装置的方便。
另外，我们提供了电泳的装置和方法，用于改进基质辅助激光解吸附电离质谱分析前样品的制备。该装置和方法为用户提供了分析物解离、电泳分离、富集以及捕获到MALDI相适的捕获层上。有利的是，捕获层是带有板框架的滑板，该框架与可拆卸的附件组合，使捕获物直接附在质谱分析的MALDI样品板上。滑动装置将样品快速引入到质谱仪中，从而使分析物以一种自动化的方式进行处理。因此滑动装置提供了高通量，减少了样品的分析成本。这些装置和方法提供了对化学分析样品的快速和高效的制备、分离、富集和格式化的改进系统。本发明特别适合于质谱分析之前生物样品的制备。总之，本装置和方法是通用的，并提供了具体实施方式
，可用来富集单电荷阴离子或单电荷阳离子或多电荷阴离子或多电荷阳离子的肽、多肽、寡肽或蛋白质。另外，本方法可用于带电荷的碳水化合物、糖蛋白、DNA、RNA或其它带电荷的代谢中间体。
电中性分子(即内部不带电荷的分子)也可以用本文以下公开的电泳装置和方法进行分析，a)电流通过多孔固定相使固定相带有净电荷，流动的反离子诱导周围溶剂流，此时产生电泳诱导的电渗流(EOF)，或b)通过引入带电胶离子(或带电粒子)使中性分析物分开。后一种分离(通常在毛细管中进行)的基本原理通常被称作胶束电动毛细管色谱(MECC)。这些方法可与本发明公开的用于分析不带净电荷的各种分子的装置和方法联合使用。这样中性分子包括那些没有被离子化的基团、诸如pH值接近等电点的多肽或蛋白质分子的分子、zitterionic species或其它类型的中性分子。
本发明可以用来富集疏水性或亲水性的分子。这种富集的结果是在集中电场的作用下导致多孔膜在一个或多个预定的、离散位点处捕获了分析物，其中，调节多孔捕获膜，使之与用于分析分析物的MALDI质谱仪的样品板相适合。为帮助所捕获的分析物进行离子化，在多孔捕获膜放进MALDI质谱仪前，将MALDI基质引入到膜上的离散位点。带有多孔捕获膜的富集和捕获装置按照如下所述的方法进行使用，以使其能适用于大范围的生物分子中，在MALDI质谱分析之前改进样品的制备。
图1是富集器的透视图。
图2是富集器的俯视图。
图3是富集器的侧视图。
图4a是柱状样品池的放大侧视图。
图4b是柱状样品池的放大俯视图。
图5是与光响应电极相接触的单池和多孔层的放大图。
图6是顶部电极和底部电极与电压电源相连的含分析物样品的单池及多孔膜视图。
图7是MALDI捕获膜(有分析物捕获位点的阵列)固定在MALDI的样品板上的侧视图，其中膜上的捕获位点中加有含MALDI基质的溶剂。
图8是滑动组件，其具有分离层的顶框部件带有样品池，嵌入底表面上具有捕获层的中间框部件中(俯视图)。
图9是图8组件的顶框部件俯仰视图。
图10是图8组件的底框部件俯视图。
图11显示了与电极(500)接触的多孔膜(8)的另一实施方式，具有压缩层(510)，用来将分析物捕获和富集在捕获膜(60)的选择部分(68)上。
图12显示了用于通过电泳富集带电荷分析物的压缩层(510)的俯视图，分析物通过富集孔(518)被富集到捕获膜的选择部分上。
图13是图11所示实施方式的另一种变化形式，在捕获层(60)的底部增加了另外的压缩层(510)。
图14是用于分离和富集分析物的具有二维阵列池的装置。
图15是图14中池的侧视图。
图16是图15所示的带有电极和底部电解液池的装置。
图17是图16所示的多孔捕获膜900的侧视图，其由浇铸到另一固体聚合体层上的孔阵列内的多孔聚合体整体材料(monolith material)组成。
图17A是图16所示的多孔捕获膜900的俯视图，其由浇铸到另一固体聚合体层上的孔阵列内的多孔聚合体整体材料组成。
图18是池阵列的侧视图。
图18A是图15所示装置的一个池的视图，其中使用了多孔层。
图19是特殊压缩层(600)的俯视图，其上有等电聚焦IPG带(610)，用于在进行质谱分析的捕获前提供改进的分离效果。
图20是不渗透层(600)的俯视图，其在IPG带(610)下具有聚焦位点(660)，用于在进行质谱分析的捕获前提供改进的分离效果。
图21是泛素寡肽混合物样品的质谱图，该样品用(0，1，2，3或4分子)的德克萨斯红标记，并且光富集(photo-concentrated)到500MW截留的CEA透析膜上。通过以下步骤得到此图谱从膜上提取寡肽置入含CHCA的基质溶液中，将溶液直接点到不锈钢目标板上，使溶液挥干。
图22是图21所示相同泛素样品的质谱图。不同的是，泛素样品被光富集到250,000MW截留的PVDF透析膜上，含CHCA的MALDI基质溶液直接点到PVDF膜上，挥干，然后用双面胶带(3M)粘贴到不锈钢MALDI样品板上。
图23和23A是被电富集到PVDF捕获膜上(用芥子酸作为MALDI基质)的带负电荷的血清蛋白的质谱图。
图24是被电富集到PVDF捕获膜上(用CHCA作为MALDI基质)的带负电荷的血清蛋白的质谱图。
图25和25A是被电富集到PVDF捕获膜上(用芥子酸作为MALDI基质)的带正电荷的血清蛋白的质谱图。
图26是被电富集到PVDF捕获膜上(用CHCA作为MALDI基质)的带正电荷的血清蛋白的质谱图。
图27显示了焊接工具、多孔膜和PVDF薄层。
图28显示了钻孔导板、焊接导板和底板。
图29显示了焊接的捕获膜的孔区域。焊接周长以直径表示，为0.5-1mm之间。
图30显示了包被有0.5μl的MALDI基质的焊接膜。
图31是5飞摩尔(femtomole)ACTH(片段18-39)的质谱图，其中ACTH位于焊接到固相PVDF膜上的多孔捕获膜上。
图32是附有多孔膜的孔的基本实施方式的示意图。
图33A和33B是用溶剂提取样品前，分析物结合到捕获膜上的荧光性分析物(Tr-泛素)的荧光图象。左侧图(33A)是膜的顶部(施用样品的那一面)的图象，右侧图(33B)是膜的底部(施用样品面的相反面)的图象。
图34A和34B是用适宜的释放溶剂乙腈∶水(50∶50)释放后的分析物结合到PVDF捕获膜上荧光性分析物(Tr-泛素)的荧光图象。左侧图(34A)是膜的顶部(施用样品的那一面)的图象，右侧图(34B)是膜的底部(施用样品面的相反面)的图象。
图35是在聚合体支撑层上经过钻孔形成的直径为200μm的整块多孔捕获位点。
图36A、36B、36C和36D是直接来自于支撑层上的4个分离的整体多孔捕获位点的质谱图。4个位点上都检测到ACTH片段。
本发明的详细说明本发明的一个方面涉及一种对电场内聚集的带电荷分析物的多样品分析物进行分离、富集和捕获的装置和方法。这些装置和方法包括一个或多个下面描述的方面和/或步骤。
A.贮存多样品的池图1，2和3分别给出了富集器的透视图、俯视图、侧视图。该装置是一个多池样品贮存系统，用来在质谱分析中同时制备一个或多个样品。图中给出了本装置的基本功能组成。装置2具有设置在上表面4上的样品池6。尽管该装置可以有不同的外型，但通常为矩形，正如从上表面4所视，每一边的尺寸为0.5cm-50cm之间。该装置更常用的是每边尺寸为2cm-15cm之间的矩形。该装置的样品池可为1-1000个，更常用的是10-100个池，这有赖于样品通量和将样品自动化加到样品池的设备的可行性。样品池的形状可以有多种，如圆柱体、立方体、具有各种形状的横截面的长斜方体，横截面形状为如正方形、六角形、五角形等。池的直径或宽度通常在1mm和1cm之间。深度在1mm和2cm之间，更常用的深度在2mm和10mm之间。
图4a和4b给出了放大的样品池的俯视图、侧视图。每个样品池有侧壁12，顶部开口14和底面16。侧壁12是由可以保留含水液体样品的无孔材料制成，并且有内表面20和外表面22。当样品池贮存样品时，含水样品至少与侧壁12的一部分内表面20接触。含水样品一般来自诸如血液、血浆、血清、脑脊液、尿液、细胞提取物等生物样品。池可以贮存液体样品并使之在分析过程中停留在池内。池是用来贮存液体样品经纯化和分离(和富集)去除其中可能存在的非分析物而得到的分析物。一般地，侧壁12的高度在1mm和1cm之间，可以贮存1μl(微升)至3ml(毫升)体积的液体样品。为了便于操作更大或更小体积的样品，需要的话，本装置可以按比例进行相应的放大或缩小，使侧面和底面的尺寸在0.1mm到10cm之间。本装置的侧壁12和上表面4通常由无孔材料制成。无孔材料可以是陶器或金属，如不锈钢、阳极化处理的铝、铜等。通常无孔材料可以是以下的聚合物，如聚碳酸酯，聚乙烯，聚丙烯，聚苯乙烯，聚酰亚胺，尼龙，人造丝，氟碳化合物，全氟化碳，聚二甲基硅氧烷，聚酯，丙烯酸(酯)类树脂，丙烯腈-丁二烯-苯乙烯，聚甲醛，聚芳酯，聚氯乙烯，PBT-聚酯，聚苯并咪唑乙缩醛共聚物(polybenzimidazone acetalcopolymers)乙缩醛共聚物，聚酰亚胺，乙烯-氯三氟乙烯，PET聚酯，乙烯-四氟乙烯，氟化乙烯丙烯，聚乙烯，聚氨酯，聚酮，聚氯三氟乙烯，聚对苯二甲酸乙二酯聚酯，聚环氧丙烷，聚丙烯苯乙烯，聚醚醚酮，聚芳醚砜，聚酰胺酰亚胺，聚芳酯，聚甲基戊烯，聚酮，聚砜，PBT-聚酯和/或聚合物的混合物。其它物质也可用来制作富集器，这些物质包括丙烯酸(酯)类树脂，如LUCITE或Plexiglas；丙烯腈-丁二烯-苯乙烯(ABS)；聚甲醛(乙缩醛)，聚芳酯(ARDEL)；聚氯乙烯(PVC)；PBT-聚酯(CELANEX)；聚苯并咪唑(Celazole)；乙缩醛共聚物Celcon或Delrin；聚酰亚胺，如Duratron或Kaptone；乙烯-氯三氟乙烯，如Halar；PET-聚酯，如Ertalyte，乙烯-四氟乙烯，如Tefzel；氟化乙烯丙烯(FEP)；聚乙烯；聚氨酯，如Isoplast；聚酮，如Kadel；聚氯三氟乙烯(Kel-F)；聚偏二氟乙烯(PVDF)；聚对苯二酸乙二酯聚酯，如Mylar；聚环氧丙烷和苯乙烯，如Noryl；聚醚醚酮，如PEEKTM；聚四氟乙烯(Teflon)；聚芳醚砜，如Radel；聚酰胺酰亚胺，如Torlon；聚苯硫醚，如Techtron或Ryton；聚芳酯，如Ardel；聚甲基戊烯(TPX)；聚酮，如Kadel；聚砜，如Udel；PBT-聚酯，如Valox。
B.用于分离分析物与干扰物的分离层在样品池内或下方是两层或多层的多孔层8，用来在灵敏的质谱分析中分离、富集、保留和结合分析物。图5是两层或多层的多孔层8的实例结构的放大横切面图。池的底面可全部或部分为多孔的，并且全部或部分暴露于多孔层8。当池底面仅部分是多孔时，池底面通常包括多孔区24和无孔区26。当用作诸如提高层8材料强度的结构或在侧壁12和多孔层8之间形成密封结构时，非多孔区是有利的。
第一多孔吸收层30通常是吸收加到池6中的液体样品的液体吸收层。例如，液体样品可以用移液管或其它样品分配工具加到池中，然后被吸收到层30中。之后，将用于缓冲的导电液体电解质，在不显著稀释样品的情况下，加到被吸收的样品上。未被显著稀释的样品紧邻于多孔层8。吸收层30通常是不溶于水性溶剂的吸水的聚合纤维性材料或微粒状材料，如棉花或玻璃纤维、纸或合成纤维或微粒。纤维或微粒可由以下多种物质制备得，如纤维素、硝化纤维，纤维素酯，玻璃纤维，尼龙，人造丝，碳氟化合物，全氟化碳，聚二甲基硅氧烷，聚酯，丙烯酸(酯)类树脂，丙烯腈-丁二烯-苯乙烯；聚甲醛；多芳基化合物，聚氯乙烯，PBT-聚酯，聚苯并咪唑乙缩醛共聚物，聚酰亚胺，乙烯-氯三氟乙烯，PET聚酯，乙烯-四氟乙烯，氟化的乙烯丙烯，聚乙烯，聚氨酯，聚酮，聚氯三氟乙烯，聚对苯二甲酸乙二酯等。层30的主要要求是a)能吸收含水样品，对于目标分析物而言是多孔的。优选的层30是由Sephadex颗粒(Pharmacia-Amersham)制成。例如，此Sephadex颗粒可以是G-50-Course，被微细尼龙网保留在层32的上表面，尼龙网有20至100微米直径的网眼(即比Sephadex颗粒的直径100-300微米小)。Sephadex的体积可以根据样品体积大小进行调节。通常体积大小在5至100微升之间。
色谱分离层40包括第二多孔层。在装置运行中，层40对于加到池6中的分析物而言有不同的孔。这些分析物可以是蛋白质、多肽或肽，它们根据分子大小的不同、电荷的不同、疏水性的不同或对分离层40的亲和性的不同，以不同的速度通过层40。因此分析物从池6中，以不同的速度通过分离层40，进入下面的捕获层60。通常，层40包括一种或多种分离介质，使高质量(即分子量)样品组分与低分子量样品组分相分离。此时，相比低分子量样品组分，高质量样品组分在通过层40时的速度受到延迟。例如，层40可以由诸如透析膜的分子筛构成。这种透析膜对本领域熟悉临床透析和蛋白纯化的技术人员而言是熟知的。通常这种透析膜可以由以下物质构成，如纤维素，醋酸纤维素，聚酯等。使用这种膜的一个问题是如果过量加载大分子(保留分子)后，该膜容易被污染。过量加载造成的严重污染可以用对流(流动)去除膜表面的保留分子的方法预防。可以利用重力、静水压力、磁力搅拌棒等方法驱动对流。优选地，层40的第一分离层的介质应该是诸如琼脂糖，更优选是聚丙烯酰胺的多孔凝胶状物质。对熟悉用延迟速度的方法将小分子与大分子分离的本领域技术人员而言，当带电大分子(如DNA，RNA，或蛋白质)被置入电场中，这种凝胶不会产生污染。这种依靠电泳对很大范围的生物大分子进行分离的凝胶都是熟知的。这种凝胶的另外一个优点是它可以在电泳分离时，对大量样品进行操作，没有过量的问题。熟知这种凝胶状物质在电场的驱动下通过电泳对高分子蛋白质、DNA、RNA或其它生物聚合物进行过滤时，不会造成污染和堵塞的问题。蛋白和多核苷酸纯化领域的技术人员所熟知的凝胶是聚丙烯酰胺或琼脂糖。通过调整孔径大小可以调整这种介质的滤网性质。例如，聚丙烯酰胺的孔径大小可以通过调整丙烯酰胺单体的浓度(或双-丙烯酰胺交联体的浓度)而改变。
分离层40可以包括多个帮助分离生物大分子的亚层52。第二、三、四或更多的分离介质可以与第一分离介质组合、连续或混合地使用。例如，分离介质的多个亚层可包括不同孔径或大小呈梯度排列的孔径(每种组合中，孔径从上向下依次增加)，进一步预防多孔分离层40的堵塞。例如顶层是2.5％丙烯酰胺，中间层是5％丙烯酰胺，下层是7.5％丙烯酰胺。另外，亚层52可以由结合并去除全血、血浆、血清中白蛋白或IgG的特异性物质组成。对这些物质的特异性清除可以利用亲和色谱的选择性吸附原理。例如，蛋白质、碳水化合物或多核苷酸可被结合在诸如纤维素、糊精、丙烯酰胺、聚合树脂等基质上面的抗体、植物血凝素或寡核苷酸清除。其它选择性清除分析物的方法包括将蛋白质与金属(如锌或镍)螯合、生物素-抗生物素蛋白作用、疏水染料-白蛋白结合等，这些技术在构建亲和基质领域中是熟知的。
C.分析物的富集层和捕获层第三多孔富集层50可任选放在层40下作为富集层。层50由可为分析物提供高迁移率的物质构成，该分析物被富集在捕获层60的捕获区68。构成富集层50的材料例如为高通透性的琼脂糖、纤维素(例如Whatman#1或Whatman#2滤纸或类似物)。此类物质的固相部分有较大孔径，但防止富集层50内的流动仍然是有利的。使用时，富集层50要足够厚，防止分析物从分离层40扩散和流动到下面的捕获层60。通常的厚度在200至3000微米之间。
富集层50有助于将分析物富集(例如浓缩)在与多孔层8平行的平面上。一旦目标分析物在进入捕获层60前，穿过强抗力的分离层40时，富集就发生了。富集层40虽是任选存在的，但存在时，其可帮助富集的分析物进入捕获层60中的捕获区68。
位于分离层40和任选的富集层50下面的是分析物捕获层60。捕获层60也是多孔的以使离子电流通过。捕获层60孔径通常要足够小，可以使依赖捕获机理的捕获效率最佳化。捕获机理可以简化为筛分，在这样情况下孔径尺寸要比目标分析物的尺寸小。当通过筛分捕获小分子蛋白质和寡肽，孔径必须是相当小的，数量级为10-100埃。孔径可以小于或大于目标分析物。当捕获层60的孔径大于目标分析物时，捕获层60必须对目标分析物具有亲合力，如下所述。
捕获层60通常是厚度在1微米和1000微米之间的膜。更通常的厚度为10微米至200微米之间。在薄层中捕获目标分析物便于之后提取用于MALDI-MS分析的分析物。另外，与池深18成比例的薄捕获层60可使分析物按比例富集。捕获层60的厚度必须足以能使膜具有足够的机械强度和结合力。
对于一种典型的分离和捕获方法，采用的电场范围为5-100伏特/厘米。通常的电压为约5伏特(通常为约3伏特至约10伏特)，阳极和阴极之间的距离为约0.4厘米(通常为0.005厘米至约5厘米)。电泳速度为v＝μE (公式1)μ是分析物分子的电泳迁移率，E是电场强度。μ值直接由爱因斯坦关系式，根据扩散系数D计算出D＝(kT/q))μ (公式2)室温下氨基酸和相似大小的分子的扩散系数大约是10-5cm2/秒。从室温下单电荷分子的数值(kt/q)≈0.0259伏特，我们发现这些分子的μ值大约是4×10-4cm2/(伏特·秒)。因此，根据公式1，在约20伏特/厘米的电场中这些分子穿过膜的速度大约为(20伏特/cm)·4×10-4cm2/(伏特.秒)＝8×10-3cm/秒(例如大约80微米/秒)。
我们很快发现，如果膜的厚度为约80微米，穿过膜的时间将约为1秒。如果是较高电场、较高电泳迁移率或膜的厚度较薄，则穿过时间要相应的短(对于较低电场、较低电泳迁移率或较厚的膜，则时间相应变长)。本发明中，穿过膜(分析物和膜之间缺乏亲合力)的时间通常在0.1和100秒之间。
捕获层60的捕获机理优选是基于分析物与层60的结合而不仅是靠筛分。当发生足够结合时，则不再需要通过筛分而捕获。当结合到捕获膜60时，分析物穿过层60的时间极大地提高(与分子在游离状态下的穿过时间成反比)。例如，如果分子平均花费99.99％的时间进行结合(0.01％的时间游离)，则穿过时间提高到104倍。简而言之，不进行结合的穿过时间是1秒，当分析物的结合时间为99.99％时，则穿过时间变成大约10,000秒。通常，穿过膜(与捕获层60结合的情况下)的时间在10至106秒之间。
通过结合进行捕获与通过筛分进行捕获至少有两个优点，a)孔径可以比筛分用的孔径大很多，b)捕获层60是一种在捕获分析物分子后，可以被清洗除去污染物的膜。用亲合捕获时，膜孔径可以比生物样本中的水合离子(如钠、钾、钙和氯化物)的直径大很多。为进行有效的结合捕获，孔径必须仅小于分析物在穿过时间t内穿过膜的扩散距离x。正如以上所讨论，通常t在0.1至1000毫秒之间，d在10-5至10-7cm2/秒之间。以三维扩散的表达式x2＝6Dt (公式3)代表小分子蛋白质(扩散系数大约为10-6cm2/秒)的捕获效率，甚至是上述最快通过时间(例如0.1毫秒)，我们发现孔径x也可能达到8000埃(或几乎1微米)。相对照，为了去除分子量1000-60,000的小分子分析物，用筛分捕获时的孔径常常得小很多倍(大约15-40埃)。因此，对于电泳速度很高(或使用薄膜)的亲合捕获，允许使用孔径从10埃至大约1微米的多种孔径。较慢的电泳速度或使用厚膜则使孔径相应增大(从10埃至10微米或更大)。
这样的捕获可以是任何结合机理。例如含带疏水性侧链的氨基酸的多肽和蛋白质。如此疏水表面和多孔疏水膜倾向于以适当高的亲合力结合这样的分子。这种多孔膜材料为如乙烯-四氟乙烯，例如Tefzel；氟化乙烯丙烯(FEP)；聚乙烯；聚氯三氟乙烯(Kel-F；)；聚偏二氟乙烯(PVDF)；苯乙烯，例如Noryl；聚四氟乙烯(Teflon)多孔Teflon，或类似能很好地结合多肽和蛋白质分析物的物质。优选分子量大约250,000的PVDF透析膜(从SpectrumLaboratories；Rancho Dominguez，CA获得)用于捕获这样的多肽。另外，由硝化纤维素，尼龙，人造丝，聚酯等类似物制成的多孔捕获膜，具有与蛋白质和多肽的固有亲合力，可以用作这些分子的捕获膜。另外，捕获层60可用硝化纤维素，纤维素，尼龙，人造丝，聚酯，多孔PVDF等类似物的薄膜制成。
捕获层60可以是多肽结合层，可以由结合多肽的物质或衍生后能结合多肽的物质制成。一般地，整个捕获层60由相同物质制成。另外，层60具有隔离的多肽结合区或岛。由此，分析物可被富集并结合层60，然后用蒸馏或净化水或预定pH和离子强度的缓冲液如碳酸铵缓冲液清洗。通过清洗结合有分析物的表面，使可能存在于样品中的杂质，如盐、或清洁剂被去除。这样抑制或干扰分析物MALDI信号的物质显著减少，提高了对分析物分子检测的灵敏度。
用于捕获多肽的捕获层60通常由薄的、微孔物质制成，如是由蛋白结合物质如聚偏二氟乙烯(PVDF)制成的透析膜。层60的多孔材料必须经得住水或有机溶剂，如水溶液缓冲液和电解液、甲醇、乙醇，和乙腈，所有的这些试剂被经常用于MALDI-MS样品和MALDI基质中。为了结合多肽和蛋白质，结合层60通常是疏水性的。疏水性可以来自烷基或芳基的有机基团，或是天然存在于聚合物中或通过化学方法连接到表面上，这种方法在本领域中是众所周知的。另外，疏水性也可以来自碳氯化合物和碳氟化合物，如乙烯-氯三氟乙烯，全氟化碳，如聚氯三氟乙烯，乙烯-四氟乙烯，氟化乙烯丙烯，聚氯三氟乙烯(Kel-F；)；聚偏二氟乙烯(PVDF)；聚四氟乙烯(Teflon)乙烯-四氟乙烯，例如Tefzel；氟化乙烯丙烯(FEP)等。透析膜的孔隙率还可以允许依靠分子大小进行选择性的捕获而不是单独靠疏水性进行选择。例如5,000分子量大小的疏水性透析膜可用于选择性保留分子量大于5,000的全部分子。用含有诸如辛基葡糖苷、Triton X-100、NP-40等类似物的清洁剂，或诸如乙醇、甲醇、乙腈、乙酸乙酯等类似物的有机溶剂的洗脱溶液清洗膜，可以将小分子量的分析物从膜上洗脱出。然后去除洗脱物，蛋白质通过疏水性作用结合到捕获膜上。
组成捕获层60的物质也可以包括其它与蛋白质结合的聚合物，如聚二甲基硅氧烷，聚酯，丙烯酸(酯)类树脂，丙烯腈-丁二烯-苯乙烯；聚甲醛；聚芳酯，聚氯乙烯，PBT-聚酯，聚苯并咪唑，PET聚酯，聚乙烯，聚氨酯，聚对苯二酸乙二酯聚酯，聚环氧丙烷，聚丙烯苯乙烯，聚醚醚酮，聚芳醚聚芳酯，聚甲基戊烯，PBT聚酯，和/或聚合物的混合物。其它可以用来制造富集器的物质包括，丙烯酸(酯)类树脂，如LUCITE或Plexiglas；丙烯腈-丁二烯-苯乙烯(ABS)；聚甲醛(乙缩醛)，聚芳酯(ARDEL)；聚氯乙烯(PVC)；PBT-聚酯(CELANEX)；聚苯并咪唑(Celazole)；乙缩醛共聚物Celcon或Delrin；聚酰亚胺，如Duratron或Kaptone；Halar；PET-聚酯，如Ertalyte，聚乙烯；聚氨酯，如Isoplast；聚酮，如Kadel；聚对苯二酸乙二酯聚酯，如Mylar；聚环氧丙烷和苯乙烯，如Noryl；聚醚醚酮，如PEEKTM；聚芳醚砜，如Radel；聚酰胺酰亚胺，如Torlon；聚苯硫醚，如Techtron；聚芳酯，如Ardel；聚甲基戊烯(TPX)；聚酮，如Kadel；聚砜，如Udel；聚丙硫醚，如Ryton；PBT-聚酯，如Valox；聚合物的混合物形成的膜，例如Xenoy；或两层或多层聚合物膜的层压层。
多孔捕获膜具有质谱仪可识别的标记位置，在该标记位置上至少有一预定位置，其与标记位置的距离是已知的。预定位置相应于捕获区，捕获区是捕获层上富集目标分子的区域。标记位置可以是黑色不透明区。装置2聚焦的电泳电流优先通过捕获膜60中的捕获区68而不是区域62，从而导致所选分析物在区域68得到富集。富集量与区域68的面积(见66线所示的横截面(cross-section)成反比，该面积与捕获膜60上方的全部样品池6的横截面积相关。线64显示了池的横截面。因此富集量与线66长度的平方除以线66长度的平方所得数值成正比。富集的分析物被捕获膜60捕获，以使它们后来以富集形式(如浓缩形式)被放置在MALDI目标板上，从而能从该富集形式中被提取出来。样品富集区的直径大小通常在1至1000微米之间。更通常的富集区域的直径在50至200微米之间。
如果分析物穿过捕获层60，可以在捕获层60下面放置阻挡层70以预防分析物的漏出。类似于层30、40、50和60，层70也是多孔的。层70的孔径要足够小，以防止所有选择的目标分析物从层70漏出。阻挡层70可以是任何能截留小分子量物质的透析膜，例如从Spectrum Laboratories，Inc.获得的CEA透析膜能截留分子量大约500的物质，其与PVDF捕获膜40能很好地合作，用于保留人血浆或血清中可能存在的目标肽。任何适当的透析膜，或其它带有合适小孔的膜，都可用作阻挡层。如果分析物被层60的上层61通过筛分而捕获，则无需阻挡层70。
同样地，设置在捕获层60和阻挡层70下面的是任选存在的缓冲层80。缓冲层可以是固体、液体，或者二者的联合。例如缓冲层可以是浓缩的缓冲基质的液体溶液，如250mM的组氨酸水溶液。最佳的缓冲液的pH值接近所需缓冲物质的等电点，对于组氨酸而言，为大约7.5-8.0。从而在最小的离子导电率下，缓冲能力很强。同时，天冬氨酸或谷氨酸的饱和溶液，或其它的两性离子缓冲液也可用于等电点pH2.5-3.0范围的类似缓冲。或者，这样的缓冲液可以被混入到包括诸如琼脂糖或聚丙烯酰胺的水性凝胶或溶胶-凝胶中。
多孔层8可以包括层30、40、50、60、70和80中的所有各层或其中的几层。分离层40和捕获层60是装置必需的，层30、50、70和80是可任选存在的。这些任选的层，提高了装置的性能，包括更坚固的操作性，快速分离，更完全捕获，或改善pH的稳定性或者兼具。
D.用于聚焦电场的电极多孔层8的底面是底部电极100，该电极可提供电流从而使多孔层8内产生离子流。包括层30、40、50、60、70和80的层8的所有层，它们对电解液样品中的离子是多孔性的，由此使电泳吸引分析物向电极100运动时，离子流聚集到捕获薄膜60的区域68上。
图6给出了单个样品池6的示意图，其含有在导电离子液体电解质90中的样品分析物。
顶部电极140浸入在样品电解液90中作为反电极与导线150相连接。导线150的另一端连接于电源160，该电源也连接于导线120，导线120也连接于底部电极100。电源向顶部电极140施加偏压，顶部电极140相对于底部电极具有电势。元件6、8、12、90、100、120、140、150和160共同作用形成有电泳分离功能的电解池。如用一个稳压器，该偏压可以是预先确定的、或是恒定值或编程随时间而变。另外，电源可以是恒电位计，其中穿过电解池的电流是预定的或固定的。在一个优选的工作模式中，电源是恒电位计，电解池可以在100微安至10毫安之间范围内按恒电位模式运行。更常见的是，电流在大约400微安至1毫安之间。电流值被预定后，电压在约1至100伏特之间的范围。更常见的是，电压在2.0伏特和20伏特之间。
优选的底部电极是光导(photoconductive)电极，其使电极内的电流路径限制在电极100的光导区域200内。光导材料可以是诸如掺杂硅或锗、砷化镓、二氧化钛、氧化钨或类似物的半导体。这些光响应(photoresponsive)材料可以是单晶体，或多晶体，即多个小晶体。另外，光导电极100可以是非晶材料制成的膜。例如，可以通过蒸发或溅射沉积方法得到这样薄膜。优选的半导体材料可以是通过低成本丝网印刷技术沉积TiO2或类似的半导体材料而制成的厚膜。用来制造薄或厚的膜的光导材料的方法在现有技术中是众所周知的。
使用来自光源180的聚焦或平行的光束190照射光导电极，将导致光导区域200的产生。区域200包括电极100的被照射区域和围绕各被照射区域少数载流子的扩散距离d。对于诸如纯的单晶锗的材料，距离d可以基本在1毫米数量级或更大。在纯的单晶硅内距离d可以在100-500微米数量级，或通过在单晶半导体中适量掺入可以缩短少数载流子寿命的材料，使距离小于100微米甚至小于1微米。这样的材料或″寿命杀手″是本领域所熟悉的比如黄金、铁、铜等的金属。因此，可以基本控制光导区域200的尺寸。光束的直径通常在0.001至1毫米之间。利用小的聚焦光源，比如激光或其它的光源直接穿过孔径透镜或聚焦透镜，光的宽度可以是1-100微米或更少，产生直径从1-500微米或更小的光导区域200。
可以用单个连续的半导体电极作光响应电极，以产生许多有两个或两个以上光导区域200的含多个电解池的阵列(例如参见图1，2和3)。光响应电极100可以通过一个或一个以上的导线120连接到电源160，给光响应电极100相对于反电极140施加偏压。两个或两个以上的电解池与单个光响应电极连接，通过控制射向光响应电极100的光导区域200的光强度，使穿过每个电解池的光流分别得到控制。可以通过控制光束190的光强度独立地控制穿过每个电解池的光流。例如，恒电位模式下，可以通过在电极140和100之间预先设置单个偏压，分别对电解池进行操作，但要分别独立地监测通过电解池的光流，分别为向每个电解池提供光束的光源提供反馈信号，使穿过电解池的光流保持预定值。在恒电位方式下，通过控制照明强度可以对各电解电池进行操作。在一优选的运行方式中电源是恒电位计，选择的电流在100微安到10毫安范围内。更常见的电流在大约400微安到1毫安之间。电流预定后，电压在1-100伏特范围之内。更常见的电压在2.0伏特和20伏特之间。
充当反电极的顶部电极140，不必是光响应的。顶部电极140优选由诸如铂、黄金、钯等的插入材料组成。顶部电极140也可以用价格比较低廉材料，比如不锈钢、钛、铬等物质。事实上任何导电的物质都可以用做顶部电极，只要那些电极材料不被含水样品腐蚀或溶解。为了减低费用又保持最佳耐腐蚀性，顶部电极140可以是将惰性材料镀到价格比较低廉的材料，比如铁、铜、钛、钨黄铜等之上。反电极也可由导电的含碳材料如碳、石墨等构成。其优势是，可用丝网印刷技术将含碳物质置于非导电聚合体上，由此用便宜的制造方法生产导电物质。
本发明提供了一个快速体系，用来从诸如血浆、血清和脑脊液等存在盐、脂质和糖等干扰物质的复杂生物样品中制备和分离需要的分析物。然后分离的分析物以“Z”维(dimension)方式被富集、捕获到膜60上。通过捕获区68将电场聚集在各样品电解池内，分析物也可以以“X”和“Y”维，即在捕获膜60的平面内被富集到捕获区68上。
E.具有捕获位点阵列的捕获板，可向MALDI目标板提供其上的可移动负载物用于MALDI质谱分析在分析物分离和富集在捕获膜60的区域68后进行MALDI质谱分析，将结合层60与其它多孔层分离，并将结合层60附着在适于MALDI质谱分析的样品板300上，然后引入图7所示的质谱仪中。然后将溶于适当基质溶剂中的适宜MALDI基质以小滴350加到结合膜的捕获区域68上。使溶剂溶解分析物，待溶剂蒸发后，在捕获膜60的顶面61上形成掺入分析物的MALDI基质晶体。在MALDI质谱分析领域，众所周知的基质通常是有机酸，这些有机酸在紫外激光器(脉冲氮激光器)激发的电磁波谱范围(例如337纳米)有强的能量吸收。通常MALDI基质以液态形式加入以再溶解分析物，以小体积比如0.5到5.0微升加入，为了不将样品分析物显著稀释，以免使其平铺在一稍大面积，以至超过分析物捕获膜60捕获区域68的顶面61。借助于自动化分配装置可以减少基质的体积，例如1皮升到1纳升。更常见的基质体积在1微升和1纳升之间。待溶剂液体蒸发形成MALDI基质晶体以后，样品板即将被送进质谱仪。在MALDI样品板300被插进质谱仪后，MALDI基质晶体被强烈的紫外激光脉冲照射，导致一部分分析物分子被电离，该技术为本领域众所周知。然后测定是否存在离散分子量的离子，该方法也为本领域众所周知。
利用装置2对标准样品板上的样品进行MALDI-MS分析。MALDI-MS样品板通常由导电材料构成，来防止激光辅助电离过程中样品表面的静电充电。装置2内部的捕获膜60的横截面通常很薄，例如在10微米到200微米厚之间，静电电荷可以与MALDI样品板电容耦合。
电容耦合防止样品表面充电产生高压从而防止电场的任何不良作用，该电场可以加速MALDI质谱仪中的电离样品。另外的薄的非导电装置可以由导电物质构成，以便该装置有合理的厚度。在本例子中，捕获膜60的厚度可以是1mm或更厚。
导电物质可以是前面提到的任何添加了导电物质的聚合体。例如添加了以无定形碳或石墨的导电的碳或，可以极大地增加捕获膜的导电率，这是众所周知的。另外该装置可由导电性的金属，比如不锈钢、铝、黄金、银、钯、铜、铬等构成。在另外的实施方案中，掺杂的或本征的半导体材料也可以给装置提供导电率。如果半导体是本征的，高于半导体带隙的电磁辐射可以为半导体装置提供充分的导电率，消除捕获膜上的任何电荷。
对MALDI质谱仪的操作人员众所周知的是，可以将小样品池22定位，可以用激发激光来激发池22表面。如下面实施例中所示的，包括池底面区域26在内的富集分析物30部位的激发，可以提高分析物检测的灵敏度。基质一般是放到酸性溶液中与有机溶剂混合来提高基质的可溶性，当有机溶剂蒸发后，基质就结晶了。
本发明中典型的MALDI基质的例子包括，但不限于芥子酸(C11H12O5)，通常被称为CHCA的α-氰基-4-羟基肉桂酸(C10H7NO3)，3，4，5-三甲氧基肉桂酸，龙胆酸(C7H6O4)，三羟基苯乙酮C8H8O4)，蒽三酚(C14H10O3)，2-4-羟基苯基偶氮基)-苯甲酸(C13H10N2O3)，2-氨基苯甲酸，反式-3-吲哚基丙烯酸(C11H9NO2)、阿魏酸(C10H10O4)、烟酸-氮氧化物(C6H5NO3)，2’-6’二羟基苯乙酮(C8H8O3)、甲基吡啶酸(C6H5NO2)、3-羟基甲基吡啶酸和6-氮杂-2-胸腺嘧啶(C4H5N3OS)。通常，这些MALDI基质分子溶于与水混溶的有机溶剂，比如乙腈、丙酮或甲醇中。溶剂和基质与这些分子的酸性水溶液，如蚁酸、乙酸或三氟乙酸相混合。其中的酸用以使MALDI基质溶液的pH保持充足的酸性，保证风干后形成酸性结晶而不是盐结晶。酸性溶液也保证多肽和蛋白质分析物以质子化状态存在，此时MALDI的激发效果最好，这是本领域众所周知的。典型的MALDI基质溶液包括50％(体积)的乙腈溶液(包含20mg/ml的CHCA或芥子酸)和50％的0.1％TFA水溶液。
为了便于对装置进行操作，制作能提供有两个或两个以上样品池的阵列并能提供密封多孔层8以及快速拆卸该装置的部件，可将保留样品的捕获层40和MALDI基质方便、直接地插入质谱仪中。图8给出了滑动组件400的俯视图，它有顶框部件410和底框部件440。在完成样品分离和分析物被捕获到捕获膜40后，顶框部件和底框部件可以被相互拆卸下来。顶框部件和底框部件440利于捕获层的拆卸和安装。顶框部件410构成了分离和富集装置2的顶面4。在顶面4上浇铸或钻出锯齿状缺口形成样品池6。将诸如含丙烯酰胺单体和交联剂的聚合液体倒入池中形成需要厚度，可方便地将分离层40插入池6。如通过加入过硫酸胺等链激发剂或核黄素等光敏剂或让核黄素吸收紫外或400-450nm光的方法，液体就聚合了。这种利用聚合作用制备凝胶的方法为本专业已知。
图9为示出底面414的顶框部件410的仰视图，底表面414有从顶面4向下突出的凸起(projections)412。分离层40填充每个凸起的底部覆盖底表面416。通过此途径，分离层可以直接与随后的多孔层例如捕获层60或任选的富集层50接触。框部件410通常有0.5到10mm的厚度，更常见的从0.7到2毫米。池6的总深度等于框部件410的厚度加上凸起412的长度减去凸起中分离层40的厚度(以及减去任选的保护层30的深度)。
图10显示出滑板组件400的底框部件450的俯视图。框架部分450的顶面452有洞454，在任何方向延伸穿过框部件450。在框部件450的底表面456的上面放置捕获层60(或先放任选的富集层50，然后是捕获层60)，以便分离层40(放在顶框部件410的凸起412中)可以与捕获层60或富集层50直接接触，顶框部件410中凸起412的长度与框架部分450的厚度近似相等。
在底框部件450的上边452中，压出一凹陷458，凹陷458是一磁铁材料，比如一大约1毫米厚的钢片。在质谱分析膜60上的样品被分析时，磁铁材料的功能是将底框部件(连同附着的捕获膜60)牢固地固定到MALDI样品板300上。为此，MALDI样品板在相应部位已经安装固定磁铁。
F.用来提高电场聚集和从捕获滑板化学提取分析物的装置一中可选择的具体实施方案见图11。该方案与图10类似，除了在分离层40和捕获层60之间增加了压缩层510。图12所示，压缩层510有不渗透性区域512和小孔518，允许从分离层40透过不渗透区域512到捕获层60的离子导电。孔518的功能是强迫离子电流只通过捕获膜60的小横截面捕获区域68，孔518的中心实际上与捕获膜60的捕获区域68的中心对齐。孔的直径通常在10微米和2毫米之间。更常见的直径在50和500微米之间。压缩层510可以是任一厚度，但为达到持久和紧凑的目的，通常在50微米和1000微米厚之间。尤其是压缩膜厚度大于200微米时，它对在孔中沉淀多孔的、吸水的、亲水的物质非常有用，以保持孔中的水相缓冲液没有气泡。吸水的疏水物可以是从多种材料中选择的，例如琼脂糖、交联葡聚糖凝胶、乳液、二氧化硅微粒、玻璃粒子等。亲水粒子的直径要比压缩层510的厚度小。小心注意粒子表面的电荷。例如当带正电荷的高分子分析物穿过孔518被电泳富集时，吸水的疏水物应选择中性或表面净电荷为正的物质。表面净电荷为负时，只可以被用作在当表面电荷间的距离远大于大分子带正电时的距离。同样地，当带负电荷的高分子分析物穿过孔518被电泳富集时，吸水的疏水物将选择中性或表面净电荷为负的物质。表面净电荷为正时，只可以被用在当表面电荷间的距离远大于大分子带负电时的距离。
可以用来制备压缩层510的材料包括金属，如铝、钛、铬、锌、钽、钨，或其与其它元素的混合物。优选的聚合体材料为如聚碳酸酯，聚乙烯，聚丙烯，聚苯乙烯，聚酰亚胺，纤维素，硝化纤维，纤维素酯，尼龙，人造丝，碳氟化合物，全氟化碳，聚二甲基硅氧烷，聚酯，丙烯酸(酯)类树脂，丙烯腈-丁二烯-苯乙烯；聚甲醛；聚芳酯，聚氯乙烯，PBT-聚酯，聚苯并咪唑；乙缩醛共聚物；聚酰亚胺；乙烯-氯三氟乙烯；PET-聚酯，乙烯-四氟乙烯；氟化乙烯丙烯；聚乙烯；聚氨酯；聚酮；聚氯三氟乙烯；聚对苯二酸乙二酯聚酯；聚环氧丙烷；聚丙烯苯乙烯；聚醚醚酮；聚芳醚砜；聚酰胺酰亚胺；聚芳酯；聚甲基戊烯；聚酮；聚砜；PBT-聚酯和/或聚合物的混合物。其它可以用来制造富集器的物质包括，丙烯酸(酯)类树脂，如LUCITE或Plexiglas；丙烯腈-丁二烯-苯乙烯(ABS)；聚甲醛(乙缩醛)，聚芳酯(ARDEL)；聚氯乙烯(PVC)；PBT-聚酯(CELANEX)；聚苯并咪唑(Celazole)；乙缩醛共聚物Celcon或Delrin；聚酰亚胺，如Duratron或Kaptone；乙烯-氯三氟乙烯乙烯，如Halar；PET-聚酯，如Ertalyte，乙烯-四氟乙烯，如Tefzel；氟化乙烯丙烯(FEP)；聚乙烯；聚氨酯，如Isoplast；聚酮，如Kadel；聚氯三氟乙烯(Kel-F)；聚对苯二酸乙二酯聚酯，如Mylar；聚环氧丙烷和苯乙烯，如Noryl；聚醚醚酮，如PEEKTM；聚四氟乙烯(Teflon)；聚芳醚砜，如Radel；聚酰胺酰亚胺，如Torlon；聚苯硫醚，如Techtron；聚芳酯，如Ardel；聚甲基戊烯(TPX)；聚酮，如Kadel；聚砜，如Udel；PBT-聚酯，如Valox。其它的无孔材料也可使用，但尤其优选的材料是聚酰亚胺(Kapton)。
任选的第二压缩层520可以放在捕获膜60下面，捕获膜60以″三明治″的方式放在第一和第二压缩层之间，如图13所示。
第一压缩层510的不渗透区域512可以与捕获膜60的保留区域、第二压缩层不渗透区域522焊接在一起，以防止捕获膜60捕获区域68中的分析物移动(扩散、对流或电场内的漂移)到捕获膜60的区域62。该捕获分析物将被保留在区域68中，在后续的样品制备步骤中，例如加入MALDI基质后会保留更多。可以用溶剂或加热的手段焊接薄膜，这种聚合物和金属材料的制备和焊接的技术已经众所周知。
G.进一步提高检测灵敏度的分离步骤本发明的装置和方法可以和传统的分离和富集步骤结合，达到进一步提高分离和富集效果，产生高检测灵敏度。附加的步骤需要额外的时间，但附加的步骤可以与本发明中的步骤结合进行自动化方式操作。因此这些步骤操作简便，要求很少或不必人员干预或人员参加。
i)等电聚焦例如，等电聚焦步骤可以与前面提到的提纯和富集步骤结合。可以用图14所示的改进装置进行样品的等电聚焦。改进的地方包括在富集层50使用1个以上的等电聚焦条610。等电聚焦条可以被连续地放在装置的第一个方向620。二个以上的离散的等电聚焦条可以放在与第一个方向垂直的第二方向630。要将二个或以上的条平行放置。将各等电聚焦条610放在压缩层510的下面，在压缩层510中富集裂孔的中心下面有裂孔660。图14中的虚线640给出了每个富集条610的中心轴。各裂孔660可以看作孔518在第一个方向620的伸长。每个富集条640的中心轴直接在不渗透压缩层600的裂孔660下面。在有二个以上等电聚焦条610的地方，有二个以上的裂孔660，每个裂孔沿着等电聚焦条610的中心轴640排列，实质上与相互间的裂孔平行。
可以在任何适当的静止基质上进行等电聚焦(IEF)，比如纤维素(或玻璃)或其它的碳水化合物纤维膜、交联葡聚糖凝胶粒子的柱床、琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶。静止相可以防止流体对流，提供稳定的pH梯度，这种等电聚焦的工艺是已知。例如P.Glukhovskiy和G.Vigh.等电聚焦分离对映体的分析和制备。分析化学1999，71，(17)，3814-3820。
简要地说，IEF是在水相电解质中形成pH梯度，二电极间相隔一段距离，一个做阳极另一个作阴极进行电泳。可以在阳极端加入酸性介质(如高pH)，在阴极端加入更多的碱性介质(如低pH)形成pH梯度。也可以让电流自然地经过电解液，从一电极到另一电极形成pH梯度。这是因为按照等式(4)，水在阳极被氧化，pH自然降低(4)相反，按照等式(5)，水在阴极被还原，pH升高
(5)通过向电解液中加入两性电解质的方法可以使pH梯度得到稳定和线性化。两性电解质是两性的分子，有可被替代的酸性和碱性基团。为了在IEF过程中建立稳定的pH梯度，可以使用不同两性电解质的混合物。每种两性电解质有不同的等电点(pI)，它是两性电解质上净电荷等于零时的pH。
两性电解质在外加电场中迁移，直到它们到达它们pI的pH梯度处。然后它们的速度变成零。它们可以缓冲任何外部的pH变化，例如当样品中的分析物进入梯度时。当相对于阴极向阳极施加正电压时，不同的两性电解质在阳极和阴极之间的电场中以连续的方式被安排，最低pls的物质最靠近阳极，最高pls的物质最靠近阴极。方利的pH为3.0-10的两性电解质混合物来自西格玛化学公司，例如号码为p1647的产品。
可用共价结合将两性电解质固定到基质上，在条或平板上形成固定pH梯度(IPG)。
例如，可以从Amersham生物科学公司购买这样的IPG strips条。Amersham号码为17-6003-73的产品可用来在7厘米的距离上形成pH3-11的梯度。除去IPG技术具有电流弱、稳定性高、两性电解质不和分析物一起流出不干扰后续的分析的特点外，IPG技术与两性电解质移动形成pH梯度相似。
为了对带电荷分析物进行等电聚焦，分析物被加到等电聚焦条610的pH梯度中，用同样的方法加入两性电解质。与两性电解质一样，分析物析物迁移到它们的等电点并被富集。在稳定状态下，带电荷的分析物富集到在等电聚焦条带460。在此点，等电聚焦停止。
然后多孔层60，70和80被组装在压缩层600的下面，附加了顶部电极(140)和底部电极500，加入足够量的水相缓冲液，使离子穿过多孔层与电极接触。如前所述施加适当的的偏压(bias potential)，通过穿过压缩层的裂缝660进入捕获层60的窄带，等电聚焦带中分析物被进一步富集。当分析物被捕获到捕获膜后，拆卸装置2，捕获膜60作为滑板组件，如以前描述的那样，使用适当的MALDI基质溶液并进行烘干使之与分析物一起形成MALDI结晶，然后放到MALDI样品板上。
按此方法，被分析物在电场中被等电聚焦富集在第一方向620，然后再沿垂直方向650的电场被富集到捕获膜上预定的离散分子线，分子线的定义是压缩层600中相应的裂缝660。因此可在高的检测敏感性下，方便地检测被分析物的质谱特性。
实施例1分离来自血清白蛋白的泛素多肽在PVDF薄膜上进行MALDI-TOF分析，用十二烷基硫酸钠(SDS)提高多肽的迁移率标记的蛋白标准用得克萨斯红(Cat No.T-6134，Molecular Probes，Eugene OR)的NHS-酯和Marina Blue(product# M-10165，Molecular Probes，Eugene OR)分别制备得克萨斯红标记的泛素(TR-泛素)和Marina Blue牛血清白蛋白(MB-BSA)。使用Molecular Probes推荐的标记程序。简而言之，将NHS-荧光标记物约1□g/ml置入二甲基甲酰胺(DMF)中，然后通过搅拌加入到中性标准磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的浓度为lmg/毫升或更高浓度的蛋白质样品中，使标记试剂与蛋白质的摩尔比为10/1。使标记物与蛋白质样品反应一个小时。然后反应混合物通过经250mM L-组氨酸(sigma)缓冲液平衡的P6离心柱(spin column，Bio-Rad)。将标记的蛋白质样品25微升等份分装，冷冻贮藏。
电解池、聚丙烯酰胺，琼脂糖和多孔膜用光电印迹方法(photo-electroblotting)分离和富集分析物的基本系统如图6所示。末端开口的样品池是由一大约2厘米长和大约2厘米直径的短圆筒的聚苯乙烯小管形成。分离层附着在管的一端形成样品池的底部。分离层由10％聚丙烯酰胺预制的2-3毫米厚片(从biorad处获得)而制得。聚丙烯酰胺作为分子量筛，延迟大蛋白的电泳速度超过小蛋白和多肽。可以减少聚丙烯酰胺的交联，允许大蛋白迁移加快或可提高交联以更好地延迟蛋白和多肽的迁移速度，这种凝胶基质中电泳分离蛋白质的技术是众所周知的。
任选地，在样品加入前，用1％琼脂糖密封聚丙烯酰胺凝胶的边缘与样品池的侧壁(为了防止漏液)。在使用之前，琼脂糖和聚丙烯酰胺用250mM组氨酸缓冲液(pH 7.8)平衡。或者，丙烯酰胺凝胶可以原位聚合，不需要密封材料。琼脂糖(Type 1-Blow EEO)来自Sigma Chimical company。通常，称出100毫克的琼脂糖放入带螺旋帽的玻璃瓶中。为了促进蛋白质和多肽的电迁移率，使用时加入十二烷基硫酸钠(SDS)，使它们的电迁移率较少受周围环境pH的影响。当使用SDS时，将含有10□L的10％十二烷基硫酸钠水溶液(SDS)(Sigma)的10毫升250mM的L-组氨酸西格玛加到100毫克的琼脂糖中。(如果不使用SDS时，则不加入SDS)。在使用之前，将琼脂糖在微波炉中加热成液态。沿着聚苯乙烯圆筒的侧壁将一层琼脂糖倒在预制的聚丙烯酰胺上面，以密封所有漏液。然后冷却琼脂糖使凝固。接着，将样品加到1-10微升的含10％甘油250mM的L-组氨酸中。然后将一层running buffer(和上面提到的琼脂糖溶液相同，但是不含琼脂糖)小心加到样品上面。
为了进行分析物分子的分离和捕获，将预制的聚丙烯酰胺放到一系列多孔膜8的上面。薄膜如下所述，是购得和贮存的，干的或预先水合的。将膜切成正方形(大约1.5厘米×1.5厘米)，用甲醇漂洗，以湿润并清洗疏水的聚合物。在转移到缓冲水溶液(250mM组氨酸)中后，将它们冷藏直至使用。PVDF透析膜(截留分子量250,000)，再生纤维素透析膜(截留分子量1000)和CEA透析膜(不对称纤维素酯)截留分子量500都来自Spectrum Laboratories，Rancho Domingez，CA。PDVF-P(0.45微米池径)和PDVF-PSQ(0.2微米池径)来自Millipore，Billerica，Massachusetts。Zeta膜(0.45微米池径)来自BioRad，Hercμles，CA。
半导体和光学仪器n型锗晶片(厚14mil，直径5厘米)购自美国的Polishing Corporation公司。晶片的电阻率小于0.4欧姆-厘米。在晶片的上表面使用镓/铟共熔物和铜丝制作欧姆接触。。欧姆接触用五分钟快干环氧胶层机械加固。用作光阳极的强化锗片，与激光和聚焦光学器件在一起被安装到光学台上。安装过的锗片用夹子连接到实验室支架上。用1毫瓦功率的633纳米的氦氖光进行光电印迹。用直径100微米到1mm之间的集中光束冲击底面玻璃的表面。
在这个实施例中，强化的锗晶片被用作光响应电极100，如图100所示。缓冲层80由被250mM组氨酸缓冲溶液饱和的PVDF-P膜组成。在PVDF-P膜上，放置由CEA透析膜形成的阻挡层70。捕获层60由如上所述的PVDF-透析膜构成。聚丙烯酰胺分离层40，与上所述的附加材料一起形成样品池，被直接组装到捕获层、缓冲层和光响应电极上。
电泳分离和杂交将0.2μL的TR-泛素、MB-BSA(1-2μg/μL)或两者加到2μL样品中，样品含有包括25％(v/v)甘油的250mM组氨酸缓冲水溶液。混匀样品，在大约1000xg下旋转2分钟。大约0.5μL的上清液用于分离和电杂交。蛋白质混合物的质谱结果与纯化的标准蛋白质或多肽样品(只包含泛素和1％TFA)的结果相当。将纯化(标准)的泛素样品直接稀释在0.1％TFA(达到800fmol/μl或10fmol/μl)中，以便进行MALDI质谱分析前，当溶剂蒸发后，没有干扰物质存在。
为了进行电泳，将光响应电极上的欧姆接触与稳压器(普林斯顿应用研究)连接。在样品和顶部光响应电极之间放置了处于″湿润/缓冲″状态的膜组合。在膜层之上放一塑料圆筒(直径为2厘米，高度为2厘米)。加入热的琼脂糖使液体达到3-5毫米的高度。一旦琼脂糖固化，加入另一个3-5毫米高的水相缓冲液(250mM组氨酸的0.01％SDS)。将电解池顶部的反电极(铂、钯、或碳)浸入，保持其与琼脂糖的接近。加入含25％甘油和75％组氨酸缓冲液的样品(TR-Ub或MB-BSA)，与电解池顶部的圆形反电极形成电接触。其余的分离和富集程序是在暗室中进行。
在光响应电极和反电极之间施加偏压，光源(4毫瓦二极管激光器发射600-700纳米波长)聚焦在晶片的背面(低的)形成大约50微米直径的点，它的中心与电解池顶部的反电极中心垂直。通常施加给锗电极(相对于铂的反电极)的偏电为+4伏特，可以产生大约500μA的总电流(其中40％是光电流，黑暗时的电流大约是300μA)。通常允许电泳分离和捕获的过程进行大约9-20分钟。
在分离和富集完成后，移出样品池中的反电极和顶部缓冲液。然后移走丙烯酰胺分离层，将捕获膜浸没在去离子水(或优选浸入0.1％三氟乙酸)中2-5分钟，去除盐。然后将捕获膜(如PVDF薄膜)用3M双面胶带粘贴在不锈钢MALDI样品板上。然后将基质溶液加到薄膜上，风干。将样品板放到质谱仪中进行分析。
对不锈钢MALDI样品板直接进行MALDI-MS分析，包含样品的0.5到2.0μl的基质溶液直接加到不锈钢MALDI样品板上，风干。然后把样品板放到质谱仪中进行分析。
MALDI-MS的分析方法使用提供的QGEN_PR2方法在ABI/Perceptive Biosystems VoyagerDE(MALDI-TOF)仪器中进行分析。使用CHCA为基质溶液，设定条件为25kV加速电压，89％栅电压(grid voltage)、0.25％导线电压、200ns延迟、2800激光、64平均扫描、3.45e-7托、100低质量栅极、负离子扣除。
结果如上所述将TR-泛素直接光-电富集到CEA透析膜上(没有PVDF膜)。图16所示的质谱图是将从膜上提取的寡肽加到含CHCA的MALDI基质溶液中，将溶液直接加到不锈钢板上风干后获得。多峰代表了共价结合了0、1、2、3或4个分子的得克萨斯红的各个泛素多肽。
用于比较，图17显示了相同泛素样品的质谱图，该样品经光-富集到截留250,000MW的PVDF-透析膜上(由截留500MW的CEA透析膜支撑(backed))，光电杂交后，用水清洗PVDF透析膜，干燥，然后将含CHCA的MALDI基质溶液直接加到样品富集位点上。基质溶液被蒸发风干后，将PVDF透析膜直接用(3m)双面胶带粘贴到不锈钢MALDI样品板上，放到质谱仪中进行MALDI-MS分析。图16和17显示了两个主要区别。首先，当用PVDF薄膜时，最大强度峰的离子流的强度是最大的。这表明如果用PVDF薄膜时，捕获效率是最大的。第二，用二种不同的膜捕获，可以看到标记了0、1、2、3或4分子的得克萨斯红的泛素的比例是不同的。用CEA膜捕获得到的是用0或1分子的得克萨斯红标记的每摩尔泛素的较少分子量。因此表明CEA透析膜更优先结合得克萨斯红-高标记(更多阴性电荷)的泛素分子。相反，通过与直接地将标记的泛素样品加到不锈钢MALDI目标板上的比较结果分析(未显示数据)，表明PVDF薄膜看来更优先结合所有标记的泛素分子。
实施例2用MALDI适合的膜从人血清中分离带负电荷的血清多肽分析血液、血浆和血清中低丰度多肽的一个主要问题是高丰度蛋白掩盖了低丰度多肽的存在。已有报道，从血液、血浆和血清的样品中清除高丰度白蛋白的同时也去除了很多低丰度多肽。因此找到一个低丰度多肽与白蛋白分离的方法是很重要的任务。为了促进解离，本研究中用清洁剂处理血清样品。
人血清样品制备清洁剂处理的血清样品在Eppendorf微管(500μL体积)中，将5mg/mL辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷(OG)加到10μL人血清(来自Sigma ChemicalCo.)中。然后，将清洁剂处理的血清在4℃过夜贮存，14小时后放在室温。然后用3μL的清洁剂处理的血清制备样品、1μL 250mM组氨酸缓冲液、1μL得克萨斯红-标记的Leu enkephalen(在250mM组氨酸缓冲液中作为示踪剂)和0.5μL甘油制备样品。样品混合物在约1000g下离心约1分钟，得到1和3μl的液滴。
样品池和分离层然后将样品放进Serum Profiler analytical cell的样品贮池中以便分离、富集到MALDI的适合的膜上，进行质谱分析。富集器的贮池是由非导电物质制成的样品环构成，非导电物质为如聚苯乙烯，聚乙烯，聚丙烯，聚碳酸酯，聚甲基丙烯酸甲酯，多甲基戊烯，TeflonTM等，这些物质形成样品贮池的侧壁。
样品贮池的底面将样品带进与之离子电接触的分离结构中，该分离结构由一个或多个分离介质层形成。本实施例中，分离层由10％聚丙烯酰胺预制的2-3毫米厚片(从BioRad处获得)而制得。聚丙烯酰胺作为分子量筛可以延缓大分子蛋白的电泳迁移率，但能提高小分子蛋白和多肽的电泳迁移率。聚丙烯酰胺可以是较低交联度使大分子蛋白的电泳迁移率变快，也可以是高交联而延缓小分子蛋白和多肽的电泳迁移率，这是本领域凝胶基质电泳分离蛋白的人员所熟知的。任选地，凝胶边缘用1％琼脂糖密封。琼脂糖和聚丙烯酰胺在使用前，用pH 7.8的250mM组氨酸缓冲液平衡。(另外丙烯酰胺可在原位聚合而不需要密封材料。)
捕获层、阻挡层和缓冲层在聚丙烯酰胺分离层下，与之离子电接触的是捕获多肽分析物的捕获层，多肽分析物包括多肽、寡肽和蛋白质。捕获是靠多肽和聚合物捕获膜的疏水性作用而进行。由多孔Teflon或PVDF物质组成的膜，对靠疏水性作用进行的多肽捕获十分有用。在本实施例中，捕获膜由PVDF-透析膜组成(截留分子量250,000)，用前在缓冲液水溶液(250mM组氨酸)中于4℃下保存。
捕获层下方与之离子电接触的是任选存在的阻挡层，其用于防止非疏水性蛋白质和多肽的逃脱。CEA透析膜(不对称纤维素酯，截留分子量500)用作阻挡层，用前干燥保存。捕获膜和阻挡膜被切成正方形(大约1.5cm×1.5cm)，用前用甲醇清洗，以保证清洁。这两种膜都来自SpectrumLaboratories，Rancho Domingez，CA。分析物在捕获层被捕获后直到加入小体积如0.3-2μl的MALDI基质溶液前，不需要洗脱步骤。因此疏水性蛋白质和多肽被PVDF透析膜捕获，与捕获膜的截留分子量无关。
缓冲区域在捕获层和阻挡层的下面，与其离子电接触的是缓冲区域，缓冲区域是用来缓冲(或捕获)电极表面形成的产物，电极是用来产生电场使分析物在捕获膜中产生电泳、分离和富集。本发明中，缓冲区域由一单层的Immobilon-P膜(来自Millipore Inc.)构成，并用pH 7.8的250mM L-组氨酸缓冲液饱和。
光导电极与缓冲层离子电接触并正好位于其下的是由n-型锗晶片制成的光响应阳极。锗晶片(厚14mil和直径5cm)购自美国Polishing Corporation公司，电阻率小于0.4ohm-cm。用五分钟快干环氧胶安装在玻璃板上的锗晶片作为工作电极和光阳极。使用镓/铟共熔物和铜线在晶片上制作的欧姆接触与铜导线连接。欧姆接触用五分钟快干环氧胶层机械性加固。
人血清样品分析的方法为了进行样品的分离和结合，在丙烯酰胺/琼脂糖层上部的样品池中，加入一管(0.5-8μl)经清洁剂处理的样品混合物。然后直接放进一个环形的与池内壁松散接触的反电极(阴极)，该反电极(阴极)由铂构成。铂阴极和光响应阳极与稳压器(Princeton Appllied Research，model 273)连接，在暗室中(room darkened)，将+4V偏置电压用于光响应阳极和铂阴极。用1毫瓦输出的氦/氖633nm光线进行光响应阳极(光照射在电解液相对的片上)背面表面的光激发。制造了激光聚焦系统，加强了照射玻璃底部的激光，该激光聚焦光束的直径在100微米到1mm范围内。4V的偏压和同时照射产生了700mA的总电流(大约30％是光电流)。偏置电压调零之前，进行了大约20分钟的分离，然后分开连接上下电极的导线。
然后，拆开聚集室，检测胶和膜的荧光性。如果捕获过程彻底，所有的荧光都包含在捕获膜内。切下带荧光性的点，浸入去离子水中数分钟。PVDF膜风干，按实施例子1描述的方法进行MALDI分析。按实施例子1描述的方法，直接在Voyager DE工作站中对捕获的来源于PVDF膜的蛋白质进行分析。
图18，18a和19所示的是用MALDI基质溶液中的CHCA或芥子酸分析带负电荷的蛋白质和多肽的通常结果。用MALDI基质溶液中的CHCA对1000到15,000道尔顿的低分子量的肽和多肽进行质谱分析可以得到最好结果。相反，基质溶液中的芥子酸使高分子量(＞15,000道尔顿)分子的信号得到改进。因此，分析物与这两种基质物质中的每个分别进行MALDI分析，可以为低分子量和高分子量分子都提供理想的结果。
实施例3在PVDF薄膜上对来自人全血清的带正电荷的多肽进行电泳分离以进行MALDI-TOF分析与实施例1和实施例2相似，在本实施例中，人血清样品中的多肽和小分子血清蛋白质通过凝胶被电泳富集到捕获膜上，从而使大分子蛋白质与小分子目标多肽和小蛋白质分离。同前实施例，带电荷的多肽和蛋白质分子在外加阳极和阴极的电场中迁移。本实施例中，带正电荷的分析物分子向带负电的阴极迁移，在捕获膜60的捕获区68得到富集并与之结合。同前实施例所述，来自捕获膜的所捕获的带正电荷的蛋白质被直接进行分析。同前实施例2所述，用Voyager DE质谱仪进行MALDI分析。
实施例1，2和本实施例3的主要区别在于光导电极在本实施例3中不是必需的。作为一种替代，与前面所述的顶部电极140相似，非光导电极物质也可作为底部电极500，底部电极可作为阴极或阳极。虽然光导电极在一些实施例中不是必需的，但至少需要带有孔518的压缩层510，其用于将分析物富集到捕获膜60的捕获区68。如图13所示，优选地，也可使用第二压缩层520。压缩层对离子流而言是不能渗透的，只能通过孔518使目标分析物富集到捕获膜60的捕获区域68分析物上池。因此，不需要光导电极的导向作用。
材料底部电极(500)用Kapton(聚酰亚胺)粘性胶带覆盖钯(Pd)薄片，在底部电极中留出需要的传导区域。对于实施例，在Kapton胶带中留有的2mm直径的洞用来暴露此位置的钯，用作底部电极的表面。
顶部电极(140)顶部电极由铂(Pt)线构成，是3mm直径的圆环形状。为了与3极的稳压器或趋电器匹配，将顶部电极与稳压器或趋电器的控制电极和参考电极的导线连接。
在1”×3”的Kapton胶带上钻2.4mm的洞制备底部电极(500)。粘性胶带放在一小块钯(Pd)薄片上，然后两者放到显微镜的玻璃玻片上。稳压器的工作电极导线直接通过夹子连到薄片。
缓冲层(80)缓冲层由Immobilon-P膜组成，来自Millipore，Inc。Immobilon-P膜用pH 7.8的250mM L-组氨酸水溶液进行饱和。
阻挡层(70)截留分子量500，CEA透析膜，来自Spectrum Laboratories，Inc.。
捕获层(60)截留分子量500，聚偏二氟乙烯的透析膜(PVDF-DM)，来自Spectrum Laboratories，Inc.。
分离层(40)10％聚丙烯酰胺，来自Bio-Rad Laboratories，Inc.。
由饱和的DL-谷氨酸和DL-天门冬氨酸水溶液中的1％低EEO琼脂糖组成的凝胶(来自Sigma Chem.Co.)用于密封分离层(40)和样品池(6)的侧壁(12)。
样品缓冲液用缓冲水溶液稀释样品，使顶部电极和底部电极电接触。用L-谷氨酸和DL-天门冬氨酸(来自Sigma Chem.Co.)饱和缓冲液水溶液，缓冲液的pH是大约3.0。
样品池(6)上部开口的带底聚碳酸酯圆筒被用于制造有单池的分离和富集器。单池是19.15mm O.D.×16.95mm I.D.×17.32mm高。
样品1μl甘油+1μl泛素(来自Sigma Chem.Co.)，其参照制造商的说明用得克萨斯红进行标记(Molecular Probes，Inc.)+8μl人血清(来自Sigma Chem.Co.)+≈1μg辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷(来自Sigma Chem.Co.)+3μl样品缓冲液。一旦加入样品的所有成分，离心并旋涡混匀(混匀)。然后5μl的样品被移液管加到样品池。
MALDI基质溶液第一MALDI基质溶液是在50％乙腈和0.1％三氟乙酸中饱和的a-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)。第二MALDI基质溶液是溶解在50％乙腈和50％的0.1％三氟乙酸中的10mg/mL芥子酸(SA)。MALDI基质溶液的所有材料来自Sigma Chem.Co.。
仪器电极偏压或电流控制用来自EG&G Princeton Applied Research的273型号稳压器/趋电器进行稳压或趋电模式的操作。
数据的获得来自Dell的Powerlab/4SP，AD仪器和台式电脑。
MALDI质谱仪Voyager DE Biospectrometry Workstation，(AppliedBoosters，Inc.)。
膜的制备在样品分离、富集和结合到PVDF捕获膜(60)之前，PVDF膜在甲醇中浸泡1分钟。因为PVDF膜是疏水性，甲醇的作用是首先使膜润湿，其次还能用来清洗膜。然后将湿润的PVDF膜放在去离子水中保存。用预制的来自Bio-RadLaboratories的10％聚丙烯酰胺的凝胶制备分离层(60)。从盒子中取出聚丙烯酰胺，用作为样品池侧壁(12)的聚碳酸酯圆筒切成圆盘状池。将切下的圆盘与用作阻挡层(70)的CEA膜一起在去离子水中浸泡过液。预制聚丙烯酰胺胶的高浓度盐需要在水中浸泡过液，使导电率减少到适合的范围。虽然装置可以在很广的分离层和样品缓冲液的导电率范围进行操作，比如1micro-siemen至100milli-siemens，但装置的理想操作范围是10micro-siemens至10milli-siemens的较窄范围。
装置的构建按下列顺序将多孔层放在底部电极上建造分离和富集器(2)缓冲层、捕获膜、压缩层、分离层、加热的琼脂糖胶密封分离层的侧壁、水相缓冲液和顶部电极。加热的琼脂糖加到样品池四周的侧壁达1-2mm深度。当琼脂糖胶凝固，将用作顶部电极的铂圆环小心降低到池中，使它接触琼脂糖。然后加入足够的水相缓冲液覆盖铂圆环的顶部电极。该装置的示意图见6.
装置的操作加入1μl甘油+1μL得克萨斯红标记的泛素+8μL人血清+＜1μgoctyt-(3-D-glucopyranoside+3μl水相缓冲液，制备包含人血清的样品。溶液经简单的离心、涡旋后，5μl样品通过铂圆环的中心加到小室中。底部电极的偏压为-5V。连续监测电流。经开始瞬态后，在后续45分钟的分离和富集步骤中，电流稳定到大约200μA。得克萨斯红标记的泛素作为标记分析物，来跟踪被分析物分离和捕获的过程。调节适合分离的时间和电流，以达到最佳分离和捕获结果。
在分离步骤和富集步骤结束时，将偏置电压调到零，拆卸装置。用Mineralight，Entela UVGL-58的荧光灯的366nm投影光观察荧光标记的示踪蛋白质，如捕获膜上的得克萨斯红标记的泛素。切下PVDF-DM捕获膜上的荧光点，浸入去离子水2分钟，在氮气下干燥。为了粘贴到MALDI样品板上，将膜分成2个或多个2平方毫米大小的小片。当小片放到不锈钢MALDI样品板上，至少有1小片上加入了1μl的CHCA基质，其余的小片上加入1μl的SA基质。一旦基质溶剂完全干燥，用干净的镊子将膜放到预先以预定位置粘附在另一个不锈钢MALDI目标板上的2平方毫米大小的3M双面胶带上。
MALDI-质谱分析Voyager DE质谱仪的参数如下20,000V加速电压，94.1％栅电压、0.05％导线电压、11ns延迟、激光设定为2800、平均扫描数64、负离子扣除。
结果图20、20a和21给出了典型的带正电荷多肽和蛋白质的MALDI质谱结果。从图中可见，检测到了包括标记的泛素示踪蛋白质(参见8600，9330和10,100质谱单位)信号在内的大量低分子量蛋白的质谱峰。图18显示了用芥子酸作为MALDI基质(更易使大于20,000分子量的中等程度的蛋白质分子离子化)，只有中等程度的白蛋白(大约68,00质谱单位)出现。
另外可见34,000质谱单位处的小质谱峰。除这两个质谱峰以外，可见的几个大于11,000道尔顿的质谱峰，无疑是来自于聚丙烯酰胺凝胶分离层中与小分子多肽分离的大分子蛋白质。
实施例4将多孔捕获介质捕获的分析物附着在电富集孔的阵列中在本发明的一个具体实施方式
中，固体材料上的二维阵列的孔是用来电泳富集带电的分析物至孔处。将捕获分析物的多孔介质附着在孔处(在出口或入口处或之内)以捕获富集的分析物。每个孔由无孔周界围绕成捕获介质的预定区域。无孔周界用来在预定区域内保留溶液避免占用更大区域。具有一个或更多孔的装置在使用中就具有以下步骤1.)沉积步骤，带电的分析物作为液体以保留样品的容量而沉积，其被置于与孔一端的阳极和孔另一端的阴极相接触的电解液中。
2.)富集和捕获步骤，分析物被电泳驱动并在孔中富集。在此步骤中仍然带电的分析物被捕获到预先置于孔处(在孔内或在孔的出口或入口)的多孔捕获介质的预定区域上，由此在预定区域内富集带电的分析物。
3.)分析步骤，对在前面步骤中得到的在预定区域被富集的捕获的带电分析物进行分析。
分析步骤还包括以下亚步骤a)向多孔捕获介质中加入包含液体溶剂和溶解基质物质的液体分析基质溶液，使分析物释放到液体溶剂和多孔介质的上表面，b)多孔捕获介质的预定区域内，用无孔周界保留液体溶剂，c)蒸发溶剂使溶解的基质物质和捕获的分析物留在多孔介质上表面的预定区域内，d)分析预定区域上表面的分析物的特征。
通常分析步骤还进一步包括将孔和所附着的多孔捕获介质置入分析分析物的质谱仪中。且，质谱仪通常是具有对分析物和基质进行激光辅助共解吸附的激光的MALDI质谱仪。分析物通常是蛋白质，多肽或/和肽。孔通常是以阵列形式排列的基本上相同的孔。
下面描述的电泳装置可与孔阵列联合使用，进行本发明的步骤。进一步描述的是可用于构建和使用孔阵列的物质和方法的实施例孔。
下面的实施例A)中的多孔捕获膜是将多孔聚偏二氟乙烯(PVDF)(来自Millipore Corporation.Billricia，MA)作为Immobilon-PSQ膜，孔阵列是在固相PVDF(来自McMaster Carr Corporation，Atlanta，GA)的薄片制成。如所述的，用热焊接在孔四周将多孔膜焊接到固相薄片上制备无孔周界。
将Immobilon-PSQ膜焊接到聚偏二氟乙烯(PVDF)片上在本实施例中，描述了将诸如Immobilon-PSQ的多孔PVDF捕获膜永久性附着在固相PVDF片(膜)上的多种方法。这些方法包括将多孔膜热焊接到诸如由0.010″厚的固相PVDF制成的聚合物片的固体材料上。在该方法中，多孔膜被放在固相聚合物片上的小孔阵列上。孔的功能是使吸附的物质，诸如多肽和蛋白质，利用溶剂流经孔到达多孔捕获膜的上表面。
可按图27给出的加热压模装置进行焊接。理想的压印装置，需要有温度控制装置，在个特殊的温度范围内控制温度，在超过熔点温度和低于自动着火温度时至少有一个膜被焊接。另外，焊接压印一般有平的底区域可以向至少一个膜的表面施压。但一般在压印中心，也有小洞，用于在膜的未焊接的四周部分形成焊接周长。压印可用如下面描述的常规烙铁制成。为制备焊接压印，去除圆锥形烙铁尖头的底部，然后在头部钻洞，5mm长18G皮下注射用针头正好穿过该洞。然后烙铁头被放到钻床中，用62°高速不锈钢钻池打磨皮下注射用针头的内部。
在焊接时，要特别注意使焊接工具对准PVDF片中的孔。可以制备钻模(jig)并使钻头在25个洞的阵列上对准，然后用焊接烙铁在相同小洞上对膜进行适当的热焊接，如图28所示。钻模由3部分组成，聚碳酸酯基质平板，铝钻头平板(有25小洞的阵列，0.024″直径)，和铝焊接烙铁平板(有25小洞的阵列，0.052″直径)。
将PVDF多孔膜焊接到PVDF固相膜的方法用3M双面胶带的粘贴层将45mm×45mm、0.01″厚的固相PVDF片粘贴到聚碳酸酯基质平板的中心。
将铝钻头平板拧到PVDF片上的基板上。
用钻床中设计使用的0.024″英寸直径的钻头和针钳通过钻固相PVDF片形成25个洞的阵列。
去除钻头平板，Immobilon-PSQ膜放在洞上，将焊接烙铁平板拧到基板上。焊接烙铁平板中的洞正好在PVDF片中的洞上排列对准。
烙铁被调到大约850，保温数分钟。
用力将烙铁头推进铝板中平板的洞中，直到接触到膜。握住对着膜的烙铁1-10秒直到产生可接受的焊接。
完成对所有25个洞上的膜的焊接后，去除平板，用显微镜观察膜。
用镊子，去除焊接点周围的膜。
然后将焊接的阵列浸于甲醇中进行10分钟声处理。
有焊接膜的片风干后，放入塑料袋中以备使用。
图29和30给出了膜焊接和含MALDI基质物质的溶液的应用结果。
提取的样品的质谱分析用上述方法将PDVF-PSQ膜焊接到固相PVDF片上的孔。然后将多孔膜用1μl的甲醇润湿，将含ACTH的多肽片断的分析物放到约0.5μl PBS缓冲水溶液中的多孔膜的正面(与固相PVDF相对的一面)。分析物用含芥子酸(SA)基质的80∶20ACN/水的混合物(以10mg/mL溶解于80％乙腈，20％0.1％三氟乙酸中)组成的2×0.3μl MALDI基质溶液将分析物流到相对表面。所有的MALDI基质溶液来自Sigma Chem.Co.。对膜的背面进行MALDI-TOF分析。结果见图31的质谱图。
实施例5固相聚合膜的孔中多孔整体浇铸塑料中富集和捕获的蛋白质分析物以及用于MALDI-TOF分析的后续提取图32给出了用于MALDI-质谱分析的蛋白质和多肽分析物的捕获和后续提取的基本结构示意图。此结构由包含一个或多个微孔的塑料框组成。孔或穿孔优选为小直径，通常为1微米至2毫米。更通常的穿孔直径是100微米至1毫米之间。小室的下部分覆盖有多孔蛋白质捕获膜，如PVDF-PSQ(Immobilon膜，来自Millipore Corp.，Billericia，MA)。用一种或多种密封方法将捕获膜密封在塑料框上。最简单的密封件是由定位环组成，如与定位环相适的尼龙垫圈。加入样品和溶剂后，用玻璃盖片覆盖小室。
方法将少量(大约10皮摩尔)德克萨斯红标记的泛素(在水中)加到干燥的PVDF-PSQ膜的上部分。样品在真空下干燥。向样品加入40μl乙腈/水溶液，在塑料框上盖上盖子。从下面流出溶液并蒸发。该步骤重复2次，因此每个样品都使用了全部溶液。为了便于进行研究，用下面的溶液对Tr-泛素的最佳提取效果进行研究。使用的乙腈与水(ACN/水)的比例为100∶0；95∶5；90∶10；80∶20；70∶30；50∶50。
结果荧光图像来自于膜的上部分(点样样品)和膜的下部分(提取的样品)。图33A与33B和34A与34B给出了一些结果。溶剂或最佳提取效果为80∶20。
实施例6将分析物捕获在电富集孔阵列中形成的整体多孔捕获材料中在该具体实施方式
中，整体多孔捕获物质形成于固相物质中的二维孔阵列中。在该具体实施方式
中，带电分析物被电泳富集到电富集孔阵列的整体塑料的多孔捕获材料中。捕获分析物的多孔介质被浇铸到一系列直径200μm的小洞中，该小洞是预先在聚偏二氟乙烯(PVDF)支撑层上钻孔而形成。一旦完成多孔聚合作用，洞的内侧壁可用以更好地支撑聚合物物质。多孔物质是用甲基丙烯酸甲酯作为聚合体物质进行原位制造的。一般地，支撑层被放在紫外下透明的Tefon-包被的石英片的上面，聚合物物质被加样器加到小洞中。然后用另一紫外下透明的Tefon-包被的石英片覆盖其上，避免有空气气泡存在。最后用紫外线照射该物质一段适当时间形成多孔″填充″。观察各点，发现孔隙率是一致的，顶部和底部被支撑层的顶面和底面齐平(flush)。
在我们的试验中，每块整体多孔捕获位点都经去离子水彻底冲洗并超声，去除残留的聚合物和其它潜在的污染物。经水清洗后，每个位点都彻底用甲醇冲洗，然后用0.1％TFA漂洗。接着，用移液管取溶于500fmol BSA中的500fmol ACTH片断18-39，向每块整体多孔捕获位点上加入0.5μl的一滴所取溶液。一旦样品在整体板上风干，用水清洗各位点，将80∶20乙腈/0.1％TFA的1μl饱和的芥子酸加到整体板的背面(加入样品的相反一面)。最后，使围绕整体多孔捕获位点阵列的支持层彻底风干，放到MALDI质谱仪中进行分析。图35给出了一单个多孔捕获位点通过原位多孔聚合方法原位铸件图。图36给出了来自阵列中4个不同整体多孔捕获位点的几个MALDI质谱图。在所有的例子中，都检测到了目标ACTH片断。
权利要求
1.一种富集器，其包括顶面，其包括至少一个形成池的孔；捕获层；和分离层，其位于顶面和捕获层之间。
2.权利要求1的富集器，其中捕获层是多孔的。
3.权利要求2的富集器，其中多孔捕获层是膜。
4.权利要求3的富集器，其中膜是疏水性膜。
5.权利要求2的富集器，其中捕获层是由结合蛋白质的材料构成的透析膜。
6.权利要求1的富集器，其中顶面包括多个孔，每个孔形成一个池。
7.权利要求6的富集器，其包括10至100个池。
8.权利要求1的富集器，其包括位于顶面和分离层之间的多孔层。
9.权利要求1的富集器，其包括位于捕获层和分离层之间的多孔层。
10.权利要求1的富集器，其包括与捕获层邻近的阻挡层。
11.权利要求10的富集器，其包括缓冲层，其中阻挡层位于捕获层和缓冲层之间。
12.权利要求1的富集器，其包括位于顶面和分离层之间的多孔层。
13.权利要求1的富集器，其具有相对于顶面的底面，其中底面是电极。
14.权利要求13的富集器，其中底部电极是光导电极。
15.权利要求14的富集器，其中光导电极是单个连续的半导体电极。
16.权利要求14的富集器，其中光导电极是非连续的半导体电极。
17.权利要求1的富集器，其包括位于捕获层和分离层之间的压缩层，其中压缩层包括不渗透性区域和至少一个孔，其中所述至少一个孔通过多孔材料与一个池孔液液相通。
18.权利要求17的富集器，其中压缩层至少一个孔内置有多孔的、吸水的、亲水性的物质。
19.权利要求17的富集器，其中压缩层的不渗透性区域与捕获层相附着。
20.权利要求19的富集器，其中用热焊接方法在压缩层的至少一个孔周围形成环形焊缝，使压缩层的不渗透性区域与捕获层相附着。
21.权利要求1的富集器，其中压缩层位于捕获层的下方，压缩层包括不渗透性区域和至少一个孔，其中所述至少一个孔通过多孔材料与一个池孔液液相通。
22.权利要求21的富集器，其中压缩层的不渗透性区域与捕获层相附着。
23.权利要求22的富集器，其中用热焊接方法在压缩层的至少一个孔周围形成环形焊缝，使压缩层的不渗透性区域与捕获层相附着。
24.权利要求1的富集器，其包括第一压缩层和第二压缩层，其中捕获层位于第一压缩层和第二压缩层之间。
25.权利要求1的富集器，其中第一压缩层和第二压缩层都至少含有一个孔，该至少一个孔通过多孔材料与所述池孔液液相通。
26.权利要求1的富集器，其中捕获膜包括至少一种可被质谱仪识别的标记物。
27.权利要求1的富集器，其中捕获层具有可被质谱仪识别的标记物位置，其中预定位置与标记物位置的距离是已知的。
28.一种富集器，其包括顶面，其包括至少一个形成池的孔；底面，其是光导电极；多孔捕获层；分离层，其位于顶面和多孔捕获层之间；压缩层，其位于分离层和多孔捕获层之间，其中压缩层包括不渗透区域和至少一个与至少一个顶面孔同中心的孔；和压缩层上的环形焊缝，其中环形焊缝至少围绕着一个压缩层的孔。
29.用质谱仪测定分析物的方法，包括(a)提供富集器，该富集器包括顶面，其包括至少一个形成池的孔；捕获层；和位于顶面和捕获层之间的至少一个分离层；(b)将包含多个分析物的样品定位于富集器中；(c)在捕获层上形成捕获区；(d)捕获区至少富集一种分析物；(e)从富集器中取出分离层；(f)将MALDI基质加到捕获区上；(g)将富集器附着在MALDI质谱分析仪的分析板上；和(h)用质谱仪对捕获区域的分析物进行分析。
30.权利要求29的方法，其中捕获层具有可被质谱仪识别的标记物位置，捕获区与标记物位置的距离是已知的。
31.权利要求29的方法，其中富集器包括具有与小室对准的光导区域的电极层，其中在富集器中，通过置入与样品电性相通的反电极，使至少一种分析物在捕获区得到富集；在电极层和反电极之间施加电流；通过导向光源使其通过光导区域而使聚焦光源照射捕获区域。
32.权利要求29的方法，其中富集器包括磁性部分，MALDI质谱仪分析板包括磁性部分，其中富集器与该板通过磁性相连。
33.权利要求29的方法，其中通过将所述样品定位到至少一个池内而使样品定位到富集器内。
34.权利要求29的方法，其中，在至少一个分离层从富集器取出后，干燥捕获层。
35.权利要求29的方法，其中仅将MADLI基质施加到捕获区域上。
36.多孔捕获膜，其具有通过聚焦电场在一个或多个预定离散位置上捕获的分析物，其中多孔捕获膜被合适地安装在MALDI质谱分析仪样品板上。
37.权利要求36的膜，其中MADLI基质物质被加到每个离散的位置上，形成一个或多个MADLI基质与分析物的结晶体。
38.制备权利要求36的多孔捕获膜的装置，包括(a)容纳样品的一个或多个小室，其中含有电解液从而使样品与至少一层分离层相接触；(b)多孔捕获膜，其位于至少一层分离层的下方；(c)电极层，具有与小室对准的光导区域；(d)电极，在小室内与样品电性相通；(e)光源，其照射光导区域，导致样品中的分析物富集到捕获膜上的预定离散位置上。
全文摘要
本发明公开了首先利用电泳驱动分析物通过滤网基质去除大分子物质的分离低丰度物质的方法和装置，然后保留的低丰度物质与捕获膜上的小的捕获位点结合，电泳富集到捕获膜上。捕获膜被风干，并被置于导电的MALDI样品板上。
文档编号H01J49/02GK1890774SQ200480036663
公开日2007年1月3日 申请日期2004年10月12日 优先权日2003年10月10日
发明者迪定·G.·哈费曼, 基利恩·迪尔, 詹姆斯·B.·哈金斯四世, 理查德·M.·卡普廖利, 杰里米·诺里斯, 内森·S.·刘易斯, 丹尼尔·库班, 查尔斯·E.·威特诺斯基二世 申请人:蛋白质发现公司