六方氮化硼纳米片在制备基质溶液中的用途以及质谱检测方法与流程

本发明涉及质谱分析领域，具体地，本发明涉及采用基质辅助激光解吸/电离质谱分析小分子的方法。

背景技术：

分子量是有机化合物最基本的理化性质参数。分子量正确与否往往代表着所测定的有机化合物及生物大分子的结构正确与否。基质辅助激光解吸/电离质谱(MALDI-MS)是近年来的一种新型软电离生物质谱，基质辅助激光解吸/电离(MALDI)的原理是用激光照射基质与样品分子形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量传递给样品分子，将质子传递给样品分子或从样品分子中得到质子，从而实现样品分子的电离，可以不产生或产生较少的碎片离子。通常基质辅助激光解析/电离技术采用飞行时间质谱(TOF-MS)作为质量分析手段。它可直接应用于混合物的分析，也可用来检测样品中是否含有杂质及杂质的分子量。分子量也是生物大分子如多肽、蛋白质等鉴定中首要的参数，也是基因工程产品报批的重要数据之一。MALDI-TOF的准确度高达0.1％～0.01％，远远高于目前常规应用的聚丙烯酰胺凝胶(SDS)电泳与高效凝胶色谱技术。MALDI-TOF-MS具有操作简单、快速、谱图直观、能耐受一定浓度的盐和去垢剂等特点，特别适合于混合多肽、蛋白、寡核苷酸的精确质量数测定，其测定质量数范围最高可达40万Da以上，灵敏度可达10-15～10-18摩尔，质量准确度可达5ppm。MALDI-TOF-MS仪器主要由两部分组成：基质辅助激光解吸/电离离子源(MALDI)和飞行时间质量分析器(TOF)。TOF的原理是离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测即测定离子的质荷比(m/z)与离子的飞行时间成正比，从而完成对待测物质的检测。MALDI-TOF-MS具有灵敏度高、准确度高及分辨率高等特点，为生命科学等领域提供了一种强有力的分析测试手段，并正扮演着越来越重要的作用。然而由于基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)常用的基质(例如α-腈基-4-羟基肉桂酸(CHCA)、2,5-二羟基苯甲酸(DHB)、芥子酸(SA)、3-羟基-2-吡啶甲酸(3-HPA)、蒽三酚(DI)以及3-氨基喹啉(3-AQ)等)在分析过程中发生碎裂及分子之间的缔合等，常常会在质荷比(m/z)小于1000的范围内产生严重的基质背景干扰现象，因此严重影响分析质荷比小于1000的小分子化合物的效果。目前，纳米材料(包括纳米金、纳米银、碳量子点、石墨烯、TiO₂、TiN、Si)在激光解吸/电离离子源 质谱分析中已经可作为基质应用，辅助分析多种有机化合物。

然而，用于基质辅助激光解吸/电离质谱的基质以及基于基质辅助激光解吸/电离质谱分析小分子的方法仍有待改进。

技术实现要素：

本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：

尽管纳米材料基质相对于传统有机基质，已经极大程度地减小了低分子量背景干扰，但复杂的制备和昂贵的成本令这一方法难以普及。因此，寻找一种操作制备简单、成本低廉、灵敏度高、在检测范围内没有背景干扰的基质，对当前MALDI-MS分析具有重要的意义。发明人经过深入研究以及大量实验发现，六方氮化硼(h-BN)纳米片在兼具纳米基质材料优点的同时，具有较高的热传导性以及稳定性，高抗氧化性以及良好的化学稳定性。六方氮化硼纳米片，即所谓的“白石墨烯”，由数层六方氮化硼构成。它具有独特的物化性质，例如高的能带宽、良好的电绝缘性、具有紫外光致发光特性、高热传导性以及良好的稳定性(真空中超过3000开)等。并且，h-BN纳米片具有的高比表面积以及B-N键的极性有利于h-BN纳米片与其他分子发生如相互作用，并且能够提供良好的吸附性能。此外，发明人经过大量实验证实，h-BN纳米片在低质量范围内，即质荷比(m/z)为0～1500范围内完全没有背景干扰。因此，可以将h-BN纳米片作为基质，用于MALDI-MS。

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明提出一种采用六方氮化硼纳米片作为基质的MALDI-MS分析小分子的方法。采用该方法分析质荷比为0～1500范围内的小分子，分析结果不受基质的背景峰干扰，因此提高了分析结果的准确性。

在本发明的一个方面，本发明提出了六方氮化硼纳米片在制备基质溶液中的用途，所述基质溶液用于基质辅助激光解吸/电离质谱检测。由此，可以避免基质在分析过程中产生背景峰进而对样品的检测造成干扰，从而提高了质谱检测的准确性。

在本发明的另一方面，本发明提出了一种样品检测的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：(1)将基质溶液与样品混合，所述基质溶液含有六方氮化硼纳米片；以及(2)将步骤(1)中所得到的混合物加入到基质辅助激光解吸/电离质谱仪中，以便对所述样品进行基质辅助激光解吸/电离质谱检测。由此，可以采用含有六方氮化硼纳米片的基质溶液辅助待测物进行电离，进而可以提高质谱检测的效果以及检测结果的准确性。

根据本发明的实施例，所述样品为质荷比为0～1500的分子。由此，可以利用根据本发明实施例的方法，实现上述样品的质谱检测，进而扩展该方法的应用范围。

根据本发明的实施例，所述样品是生物组织切片，并且所述方法进一步包括：(3)基 于所述基质辅助激光解吸/电离质谱检测的结果，构建所述生物组织切片的图像。由此，可以利用该方法实现质谱成像分析，进而可以扩展该方法的应用范围。

根据本发明的实施例，在该方法中，步骤(1)进一步包括：(1-1)将所述六方氮化硼纳米片与溶剂混合，以便获得所述基质溶液，其中，所述六方氮化硼纳米片的浓度为0～1mg/ml，所述溶剂包括选自水、甲醇、乙醇以及乙腈的至少之一，任选地，所述六方氮化硼纳米片的浓度为0.1～1mg/ml；以及(1-2)将所述样品与所述基质溶液等体积混合，其中，所述样品与所述基质溶液的浓度比为(1～5mmol/L)：(0～1mg/ml)，任选地，所述样品与所述基质溶液的浓度比为1mmol/L：0.25mg/ml。其中，当基质溶液与样品溶液的混合物中基质溶液的含量过低时，无法有效地辅助样品发生电离，而当基质溶液含量过高时，则会造成基质的浪费。由此，当样品与基质溶液的浓度比例为上述范围内时，可以保证样品的有效电离同时不会造成基质溶液的浪费，进而进一步提高质谱检测的检测效果。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种通过质谱法检测质荷比为0～1500的小分子的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：(1)将六方氮化硼纳米片与溶剂混合，以便获得基质溶液，其中，所述六方氮化硼纳米片的浓度为0～1mg/ml，所述溶剂包括选自水、甲醇、乙醇以及乙腈的至少之一，并且，将所述小分子与所述溶剂混合，以便获得小分子溶液，所述小分子溶液的浓度为1mmol/L；将所述基质溶液与所述小分子溶液按照体积比为1:1进行混合，以便形成混合样品；(2)将1μl所述混合样品加入到靶板上，并在空气中干燥，以便除去所述溶剂；以及(3)将步骤(2)中获得的所述靶板放入质谱仪中，以便完成所述质谱检测，其中，所述质谱仪为基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱仪，所述质谱检测采用负离子模式，所述质谱检测条件为：加速电压为19.000kv，延迟引出电压为14.920kv，反射器电压为20.000kv，透镜电压为7.000kv，频率为1.000Hz，激光器能量为75-80％，累加次数为90次。由此，可以利用该方法完成质荷比为0～1500的小分子的质谱检测，并避免基质在分析过程产生背景峰而对分析结果造成影响，进而提高了该方法的检测效果。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种通过质谱法检测水体污染物的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：(1)将六方氮化硼纳米片与溶剂混合，以便获得基质溶液，其中，基于所述基质溶液的总体积，所述六方氮化硼纳米片的浓度为0～1mg/ml，所述溶剂包括选自水、甲醇、乙醇以及乙腈的至少之一，并且，将污水与体积比为1：1的甲醇与水的混合物进行混合，配置水体污染物待测液，将所述基质溶液与所述水体污染物待测液混合，以便形成混合样品；(2)将1μl所述混合样品加入到靶板上，并在空气中干燥；以及(3)将步骤(2)中获得的所述靶板放入质谱仪中，以便完成所述质谱检测，其中，所述质谱仪为基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱仪，所述质谱检测采用负离子模式，所述质 谱检测条件为：加速电压为19.000kv，延迟引出电压为14.920kv，反射器电压为20.000kv，透镜电压为7.000kv，频率为1.000Hz，激光器能量为75-80％，累加次数为90次。由此，可以利用该方法完成复杂体系中水体污染物的质谱检测，并避免基质在分析过程产生背景峰而对分析结果造成影响，进而提高了该方法的检测效果。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种通过质谱法检测微生物代谢产物的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：(1)将所述微生物培养到OD值为0.8～1.0时收集，采用磷酸盐缓冲溶液洗涤所述微生物，将经过所述洗涤的所述微生物在9000g条件下离心，以便获得沉淀，取10mg所述沉淀，并向10mg所述沉淀中加入体积分数为80％的甲醇水溶液进行混合，加入的所述甲醇水溶液的体积为10mg所述沉淀的3倍，静置，以便获得微生物样品；(2)将六方氮化硼纳米片与溶剂混合，以便获得基质溶液，其中，基于所述基质溶液的总体积，所述六方氮化硼纳米片的浓度为0～1mg/ml，所述溶剂包括选自水、甲醇、乙醇以及乙腈的至少之一，并将所述微生物样品与所述基质溶液混合，以便获得待测样品；(3)将所述待测样品滴加到靶板上，并在空气中干燥；以及(4)将步骤(3)获得的所述靶板放入质谱仪中，以便完成所述质谱法检测，其中，所述质谱仪为基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱仪，所述质谱法检测采用负离子模式，所述质谱法检测条件为：加速电压为19.000kv，延迟引出电压为14.920kv，反射器电压为20.000kv，透镜电压为7.000kv，频率为1.000Hz，激光器能量为75-80％，累加次数为90次。由此，可以利用该方法在非均质体系中完成微生物代谢产物的质谱检测，并避免基质在分析过程产生背景峰而对分析结果造成影响，进而提高了该方法的检测效果。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种对组织切片进行质谱成像分析的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：(1)将冷冻的组织在冷冻切片机上进行切片，以便获得所述组织切片，其中，所述组织切片的厚度为5μm-50μm；(2)将六方氮化硼纳米片与溶剂混合，以便获得基质溶液，其中，基于所述基质溶液的总体积，所述六方氮化硼纳米片的浓度为0～1mg/ml，所述溶剂包括选自水、甲醇、乙醇以及乙腈的至少之一；(3)将所述组织切片与所述基质溶液进行混合并贴至ITO(氧化铟锡)玻璃表面，并干燥，以便获得待测样品；以及(4)将所述待测样品放入质谱仪中，以便完成所述质谱成像分析，其中，所述质谱仪为基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱仪，所述质谱成像分析采用负离子模式，所述质谱法检测条件为：加速电压为19.000kv，延迟引出电压为14.920kv，反射器电压为20.000kv，透镜电压为7.000kv，频率为1.000Hz，激光器能量为75-80％，累加次数为90次，扫描分辨率为100μm，激光光斑为50μm，成像数据采用FlexImaging v3.0或者BioMap v3.8处理。由此，可以利用该方法完成组织切片的质谱成像分析，并避免基质在分析过程产生背景峰而对分析结果造成影响，进而提高了该方法的检测效果。

附图说明

图1显示了根据本发明一个实施例的样品检测方法的流程图；

图2显示了根据本发明另一个实施例的样品检测方法的流程图；

图3显示了根据本发明实施例1的含有六方氮化硼纳米片的基质溶液的基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱检测图；

图4显示了根据本发明实施例2的氨基酸基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱检测图；

图5显示了根据本发明实施例3的丝氨酸、苯丙氨酸富集前后的基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱检测图；

图6显示了根据本发明实施例4的水体污染物9-硝基蒽富集前后的基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱检测图；

图7以及图8显示了根据本发明实施例5的大肠杆菌代谢产物的基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱检测图；以及

图9以及图10显示了根据本发明实施例6的小鼠脑组织质谱成像检测图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

在本发明的一个方面，本发明提出了六方氮化硼纳米片在制备基质溶液中的用途，上述基质溶液用于基质辅助激光解吸/电离质谱检测。根据本发明的实施例，将六方氮化硼纳米片加入到水、甲醇、乙醇以及乙腈或者上述物质形成的互溶体系中，配置含有六方氮化硼纳米片的基质溶液，并用于基质辅助激光解吸/电离质谱的检测。由此，可以避免基质在检测过程中在质荷比为0～1500范围内出现背景峰，进而提高基质辅助激光解吸/电离质谱检测的效果。

在本发明的另一方面，本发明提出了一种样品检测的方法。根据本发明的实施例，参考图1，该方法包括：

S100：将基质与样品混合

根据本发明的实施例，在该步骤中，将含有六方氮化硼纳米片的基质溶液与待测样品混合。需要说明的是，在本发明中，配置基质溶液的溶剂以及六方氮化硼纳米片相对于基质溶液总体积的具体浓度不受特别限制，本领域技术人员可以根据实际情况，例如，根据待测样品的浓度以及种类，选择适当的物质作为溶剂，配置具有一定浓度的含有六方氮化硼纳米片的基质溶液。本领域技术人员能够理解，只要选择的溶剂能够与后续的质谱分析 兼容，并且基质溶液中六方氮化硼纳米片的含量能够满足吸收激光并将能量传递给待测物质，使足够的待测物被离子化即可。具体地，根据本发明的实施例，基质溶液可以按照以下方法制备：选择水、甲醇、乙醇以及乙腈的至少之一，或者含有上述物质组成的互溶体系作为溶剂，将六方氮化硼纳米片纳米片与溶剂混合，配置基质溶液。需要说明的是，在本发明中，术语“互溶体系”特指含有水、甲醇、乙醇以及乙腈的至少之一的、体系中各组分可按照任意比例互溶的液体混合物。并且，在基质溶液中，六方氮化硼纳米片的浓度可以为0～1mg/ml(不包含0)。例如，根据本发明的一些实施例，六方氮化硼纳米片的浓度可以为0.1～1mg/ml。由此，可以获得具有适当浓度并且与后续质谱检测相兼容的含有六方氮化硼纳米片的基质溶液，进而可以提高后续质谱检测的检测效果，并且避免由于基质溶液在质谱检测的过程中产生背景峰而对检测结果造成的负面影响。

根据本发明的实施例，在该步骤中，将待测样品与基质溶液等体积进行混合，待测样品与基质溶液的浓度比可以为(1～5mmol/L)：(0～1mg/ml)。由此，可以待测样品在基质溶液的辅助下更好地发生电离。优选地，待测样品与基质溶液的浓度比可以为1mmol/L：0.25mg/ml。由此，可以在保证待测样品能够高效地发生电离的同时，避免添加过多的基质溶液而造成浪费，进而可以进一步提高该方法的检测效率以及检测效果。

根据本发明的实施例，在本发明中，待测样品可以为质荷比为0～1500的分子。需要说明的是，待测样品的种类并不受特别限制，只要能够适用于采用MALDI-MS方法进行质谱检测的物质均可作为本发明的待测样品。本领域技术人员可以选择适用于采用MALDI技术进行电离的物质作为待测样品，以便更好地发挥根据本发明实施例的方法的特点以及优势。例如，根据本发明的一些实施例，待测样品可以为氨基酸、维生素、有机酸、多肽、甾体、有机污染物、硫苷脂或者为上述物质构成的混合物。在本发明中个，术语“有机污染物”包含但不限于常见的水体中的污染物。例如，根据本发明的一些实施例，有机污染物可以包含氨基酸、蛋白质、油类以及脂类等耗氧有机物、多环芳烃类物质、有机磷农药、有机氯农药等物质。由此，可以更好地发挥该方法在质谱检测中的特征以及优点，进而可以高效准确地对待测样品进行分析。

S200：质谱检测

根据本发明的实施例，在该步骤中，将含有待测样品以及基质溶液的混合物加入到基质辅助激光解吸/电离质谱仪中，以便对样品进行质谱检测。具体地，根据本发明的实施例，可以将含有待测样品以及基质溶液的混合物滴加到靶板或者玻璃板上，在空气中进行干燥以便通过挥发除去混合物中的溶剂。然后，将含有待测样品以及六方氮化硼纳米片基质的靶板或者玻璃板送入质谱仪中，完成对待测样品的质谱检测。

根据本发明的实施例，在利用该方法对样品进行检测，当样品为生物组织切片时，参 考图2，该方法进一步包括：

S300：质谱成像

根据本发明的实施例，在该步骤中，基于基质辅助激光解吸/电离质谱检测的结果，构建生物组织切片的图像。具体地，在该步骤中，对生物组织切片做逐点扫描的质谱检测，以便获得生物组织切片中每一像素点的化学成分，并基于同一化学成分，构建该成分在生物组织切片中的分布图。由此，可以利用该方法实现对组织切片中特定成分分布的检测，进而可以进一步提高该方法的应用范围。

此外，需要说明的是，本发明以六方氮化硼纳米片作为MALDI的基质的质谱分析法，通常是用飞行时间质谱(TOF-MS)作为质量分析手段，但与其他质谱质量分析器也兼容。

根据本发明的实施例，由于六方氮化硼纳米片在检测m/z值在0～1500范围内的分子时，完全不产生背景干扰，因此可以提高采用该方法对上述分子进行质谱检测时的检测效果。此外，采用六方氮化硼纳米片作为基质可以在正离子和负离子两种模式下对不同类型的小分子进行检测，由于氮化硼自身的理化性质，该方法在负离子模式下能够获得更加优异的检测效果。并且，由于六方氮化硼纳米片本身容易获得质子，因此在质谱检测过程中无需加入离子化试剂，进而降低了利用该方法进行质谱检测时对于样品处理的要求。

此外，根据本发明的实施例，采用本发明的方法对痕量物质进行富集检测实验时，氮化硼由于其具有高表面积富电子疏水性质，可作为固相微萃取的材料，实现富集检测与辅助解吸电离的双重作用，因此可以用于对样品中的痕量成分进行分析。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种通过质谱法检测质荷比为0～1500的小分子的方法。根据本发明的实施例，上述质荷比为0～1500的小分子可以为质荷比在0～1500的氨基酸、短肽(肽键数不超过10个)、维生素、有机酸以及甾体。具体地，根据本发明的实施例，该方法包括：

(1)将小分子与溶剂混合，配置小分子溶液。具体地，根据本发明的实施例，选择水、甲醇、乙醇以及乙腈的至少之一，或者包括上述物质组成的混溶体系作为溶剂，将一定量的小分子加入到上述溶剂中，配置小分子浓度为1mmol/L的小分子溶液；并且，将一定量的六方氮化硼纳米片加入到前面描述的溶剂中，配置基质溶液。根据本发明的实施例，基质溶液的浓度可以为0～1mg/ml(不包含0mg/ml)，例如，根据本发明的实施例，基于基质溶液的总体积，六方氮化硼纳米片的浓度为0.1mg/ml。然后，将前面配置的小分子溶液与基质溶液按照体积比为1:1进行混合，以便获得混合样品。由此，可以获得具有适当小分子含量以及六方氮化硼纳米片含量的混合样品，进而可以更好地使小分子电离，从而提高后续质谱检测的检测效果。

(2)根据本发明的实施例，在该步骤中，将1μl混合样品加入到靶板上，并在空气中 干燥，以便除去混合样品中的溶剂。由此，可以在该步骤中除去混合样品中的溶剂，进而提高后续质谱检测的检测效果。

(3)将含有混合样品的所述靶板放入质谱仪中，以便完成所述质谱检测。具体地，根据本发明的实施例，质谱仪为基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱仪，采用负离子模式，质谱检测条件为：加速电压为19.000kv，延迟引出电压为14.920kv，反射器电压为20.000kv，透镜电压为7.000kv，频率为1.000Hz，激光器能量为75-80％，累加次数为90次。由此，可以在不产生背景峰的前提下，完成对小分子的质谱检测，进而可以调高质谱检测的检测效果。

需要说明的是，由于在该方法中采用了含有六方氮化硼纳米片的基质溶液，因此前面描述的样品检测方法中的特征以及优点同样适用于通过质谱法检测质荷比为0～1500的小分子的方法，在此不再赘述。

在本发明的另一方面，本发明提出了一种通过质谱法检测水体污染物的方法。需要说明的是，在本发明中个，术语“水体污染物”包含但不限于常见的水体中的污染物。例如，根据本发明的一些实施例，水体污染物可以包含硫化物、氟化物、氨基酸、蛋白质、油类以及脂类等耗氧有机物、多环芳烃类物质、有机磷农药、有机氯农药等物质。具体地，根据本发明的实施例，该方法包括：

(1)选择选自水、甲醇、乙醇以及乙腈的至少之一，或者由上述物质组成的混溶体系作为溶剂，将六方氮化硼纳米片与溶剂混合，以便获得基质溶液，其中，基于基质溶液的总体积，六方氮化硼纳米片的浓度可以为0～1mg/ml(不包含0mg/ml)；并且，将污水与体积比为1：1的甲醇与水的混合物进行混合，配置水体污染物待测液，将基质溶液与水体污染物待测液混合，以便形成混合样品。需要说明的是，配置的水体污染物待测液可以取上清液部分与基质溶液进行混合，也可以不对水体污染物待测液进行处理，直接取浑浊的水体污染物待测液与基质溶液进行混合。由此，可以获得具有适当污水以及六方氮化硼纳米片含量的混合样品，进而可以更好地使水体污染物中的待测物电离，从而提高后续质谱检测的检测效果。

(2)将1μl混合样品加入到靶板上，并在空气中干燥。由此，可以在该步骤中除去混合样品中的溶剂，进而提高后续质谱检测的检测效果。

(3)将含有混合样品的靶板放入质谱仪中，以便完成所述质谱检测。其中，根据本发明的实施例，质谱仪为基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱仪，采用负离子模式，质谱检测条件为：加速电压为19.000kv，延迟引出电压为14.920kv，反射器电压为20.000kv，透镜电压为7.000kv，频率为1.000Hz，激光器能量为75-80％，累加次数为90次。由此，可以在不产生背景峰的前提下，在复杂体系中完成对水体中污染物的质谱检测，进而可以调 高质谱检测的检测效果。

需要说明的是，由于在该方法中采用了含有六方氮化硼纳米片的基质溶液，因此前面描述的样品检测方法中的特征以及优点同样适用于通过质谱法检测水体污染物的方法，在此不再赘述。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种通过质谱法检测微生物代谢产物的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：

(1)将微生物培养到OD值为0.8～1.0时收集，采用磷酸盐缓冲溶液洗涤微生物，将经过洗涤的所述微生物在9000g条件下离心，以便获得沉淀，取10mg沉淀，并向其中加入体积分数为80％的甲醇水溶液进行混合，加入的所述甲醇水溶液的体积为10mg沉淀体积的3倍。然后静置，以便获得微生物样品。

(2)选择选自水、甲醇、乙醇以及乙腈的至少之一，或者由上述物质组成的混溶体系作为溶剂，将六方氮化硼纳米片与溶剂混合，配置基质溶液。其中，基于基质溶液的总体积，六方氮化硼纳米片的浓度为0～1mg/ml(不包括0)。并将步骤(1)中获得的微生物样品与基质溶液混合，以便获得待测样品。

(3)将待测样品滴加到靶板上，并在空气中干燥。

(4)将含有待测样品的靶板放入质谱仪中，以便完成所述质谱法检测。其中，根据本发明的实施例，质谱仪为基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱仪，采用负离子模式，质谱法检测条件为：加速电压为19.000kv，延迟引出电压为14.920kv，反射器电压为20.000kv，透镜电压为7.000kv，频率为1.000Hz，激光器能量为75-80％，累加次数为90次。由此，可以在简便有效地检测微生物代谢产物，并且，利用根据本发明实施例的方法进行的质谱检测不会在检测过程中出现背景峰，进而可以进一步提高微生物代谢产物检测的准确性。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种对组织切片进行质谱成像分析的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：

(1)将冷冻的组织在冷冻切片机上进行切片，以便获得组织切片。根据本发明的实施例，该组织切片的厚度可以为5μm-50μm。

(2)选择选自水、甲醇、乙醇以及乙腈的至少之一，或者由上述物质组成的混溶体系作为溶剂，将六方氮化硼纳米片与溶剂混合，配置基质溶液。其中，基于基质溶液的总体积，六方氮化硼纳米片的浓度为0～1mg/ml(不包括0)。并将步骤(1)中获得的微生物样品与基质溶液混合，以便获得待测样品。

(3)将组织切片与基质溶液进行混合并贴至ITO(氧化铟锡)玻璃表面，(即具有氧化铟锡层的玻璃表面，其中，组织切片贴在氧化铟锡层的表面)并干燥，以便获得待测样品。根据本发明的实施例，在该步骤中，组织切片与基质溶液进行混合的具体方式不受特 别限制。例如，根据本发明的一些实施例，可以先将基质溶液喷洒在组织切片表面，然后将含有基质溶液的组织切片贴合在ITO玻璃表面；也可以现将基质溶液喷洒到ITO玻璃表面，再将组织切片贴合至喷洒了基质溶液的ITO玻璃上；此外，还可以预先在ITO玻璃表面喷洒基质溶液后将组织切片贴合至ITO玻璃表面，然后再在组织切片的上表面再喷洒一层基质溶液。

(4)将步骤(3)中获得的含有组织切片的ITO玻璃放入质谱仪中，以便完成所述质谱成像分析。根据本发明的实施例，质谱仪为基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱仪，采用负离子模式，质谱法检测条件为：加速电压为19.000kv，延迟引出电压为14.920kv，反射器电压为20.000kv，透镜电压为7.000kv，频率为1.000Hz，激光器能量为75-80％，累加次数为90次，扫描分辨率为100μm，激光光斑为50μm，成像数据采用FlexImaging v3.0或者BioMap v3.8处理。由此，可以在简便有效地实现对于组织切片的质谱成像检测，并且，利用根据本发明实施例的方法进行的质谱检测不会在检测过程中出现背景峰，进而可以进一步提高对于组织切片进行质谱成像分析的准确性。

下面通过具体的实施例对本发明进行说明，本领域技术人员能够理解的是，下面的具体的实施例仅仅是为了说明的目的，而不以任何方式限制本发明的范围。另外，在下面的实施例中，除非特别说明，所用的基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱仪的型号为BIFLEXTM III(Bruker)和UltrafleXtreme(Bruker)。所采用的材料和设备均是市售可得的。如果在后面的实施例中，未对具体的处理条件和处理方法进行明确描述，则可以采用本领域中公知的条件和方法进行处理。

实施例1基质溶液背景峰测试

采用水作为溶剂，配置六方氮化硼纳米片浓度为0.25mg/ml的基质溶液。质谱条件为：电压：加速电压：19.000kv；延迟引出电压：14.920kv；反射器电压：20.000kv；透镜电压：7.000kv；频率：1.000Hz；激光器能量：75-80％；累加次数：90次；负离子模式。参考图3，在m/z值0～1000范围内，没有基质相关的质谱信号。因此，采用含有六方氮化硼纳米片的基质溶液对测试样本，包括复杂体系进行质谱检测，不会造成干扰。

实施例2小分子质谱分析

采用含有六方氮化硼纳米片的基质溶液对含有不同小分子的溶液进行质谱分析。

分别取配制好的浓度均为1mmol/L的色氨酸溶液(Trp)(图4A)亮氨酸溶液(Leu)、(图4B)、天冬氨酸溶液(Asn)(图4C)、谷氨酸溶液(Glu)(图4D)、精氨酸溶液(Arg)(图4E)各1μL，分别与含有六方氮化硼纳米片(浓度为0.1mg/mL)的基质溶液1μl进行混合。上述溶液的溶剂均为体积比为1:1的甲醇水溶液。将上述含有氨基酸的溶液分别与基质溶液混合均匀，然后分别向MALDI靶板加入1μL混合样品，空气中干燥后进入质谱 分析。质谱条件为：电压：加速电压：19.000kv；延迟引出电压：14.920kv；反射器电压：20.000kv；透镜电压：7.000kv；频率：1.000Hz；激光器能量：75-80％；累加次数：90次；负离子模式。

在MALDI电离方式下，基质可以吸收激光能量转移给待测物使待测化合物电离，负离子模式下形成去质子峰，从而被质谱检测。实验证明，参考图4，该基质对于以上氨基酸均具有较好的分析性能。图中待测物的量均为500pmol，可以看出该利用基质分析灵敏度较高。除了图中列出的化合物以外，对图中每一类物质的同类化合物，该基质均可以得到较好的分析结果。

实施例3对丝氨酸以及苯丙氨酸的富集和检测

采用含有六方氮化硼纳米片的基质溶液对含有不同小分子的溶液进行固相微萃取以及质谱分析。

将丝氨酸(ser)和苯丙氨酸(phe)各自配制成浓度为5μmol/L的溶液，分别取495μL(与ser溶液混合)与5μL(与phe溶液混合)0.25mg/mL的h-BN纳米片悬浮液混合。摇床中孵育15min后离心(10000g)，将沉淀用体积比为1:1的甲醇水溶液重悬为10μL，取1μL点靶。进行质谱测试。质谱条件为：电压：加速电压：19.000kv；延迟引出电压：14.920kv；反射器电压：20.000kv；透镜电压：7.000kv；频率：1.000Hz；激光器能量：75-80％；累加次数：90次；负离子模式。

参考图5，分别为丝氨酸(ser)富集前(图5A)、富集后(图5B)以及苯丙氨酸(phe)富集前(图5C)、富集后(图5D)的MALDI-TOF MS质谱图。从富集前后对比可见，待测物信号均得到了不同程度的增强。具有SPE吸附剂和MALDI基质双重能力的六方氮化硼纳米片具有在检测低分子量物质的同时简化样品制备的潜力。进一步的工作可以应用到大气，水体环境污染物的直接提取分析。

实施例4对水体污染物(硝基多环芳烃)的富集和检测

将9-硝基蒽配制成系列浓度分别为50μmol/L、1μmol/L以及0.5μmol/L的溶液，溶剂为体积比为1:1的甲醇水溶液。分别取495μL上述浓度的9-硝基蒽溶液与5μL六方氮化硼纳米片浓度为0.1mg/L的基质溶液混合。摇床中孵育15min后离心(10000g)，将沉淀用体积比为1:1的甲醇水溶液重悬为10μL，取1μL点靶。进行质谱测试。质谱条件为：电压：加速电压：19.000kv；延迟引出电压：14.920kv；反射器电压：20.000kv；透镜电压：7.000kv；频率：1.000Hz；激光器能量：75-80％；累加次数：90次；负离子模式。参考图6(a)，在负离子模式下，不对待测溶液进行富集时，50μmol/L的9-硝基蒽溶液是检测不到的。

参考图6(b)以及图6(c)对浓度为1μmol/L以及0.5μmol/L的9-硝基蒽溶液经过富集之后，均可以检测出9-硝基蒽。富集过程如下：取495μl浓度为1μmol/L或者0.5μmol/L 的9-硝基蒽溶液，与5μL实施例1中配置的基质溶液混合，超声15分钟之后，在摇床中孵育15min。在1000g条件下进行离心15分钟，取离心后的沉淀，使用体积比为1:1的甲醇水溶液重悬为10μL，取1μL点靶。

因此，该基质可用于水体污染物(9-硝基蒽)的检测。另外，还可对其进行定量检测，线性范围为1-50μmol/L。

实施例5微生物代谢物的分析

液体培养的大肠杆菌生长到OD＝0.8～1.0后收集。收集的菌体用50倍pH值为7.4的磷酸盐缓冲液洗涤后，悬浮的细菌用去离子水置换，9000g离心留沉淀，向10mg沉淀中加入3倍体积的体积分数为80％的甲醇溶液，悬浮后静置10min，再经9000g离心后取上清液。取5μl上清液与495μl浓度为0.1mg/L的六方氮化硼纳米片基质溶液进行混合，取1μl混合溶液点靶进行质谱检测。质谱条件为：电压：加速电压：19.000kv；延迟引出电压：14.920kv；反射器电压：20.000kv；透镜电压：7.000kv；频率：1.000Hz；激光器能量：75-80％；累加次数：90次；负离子模式。

参考图7，在负离子模式下，可以产生丰富的大肠杆菌代谢物谱峰。并且标准培养(图7a)与饥饿培养(图7b)的大肠杆菌代谢物谱峰有明显的差异。其中，质荷比为180.06的峰为酪氨酸，质荷比为267.31的峰为肌苷，质荷比在400-900之间的峰为脂类化合物。参考图8，图8a为图7a中质荷比为400～900区域的放大图。采用浓度同为0.25mg/L的盐酸萘乙二胺溶液作为基质溶液，在相同的条件下(标准培养)对微生物代谢产物进行分析可以发现，采用盐酸萘乙二胺溶液作为基质的质谱结果中(图8b)，检测出的脂类化合物的特征峰明显不如采用含有六方氮化硼纳米片的基质溶液(图8a)的质谱结果丰富。因此，含有六方氮化硼纳米片的基质在质谱检测中对于脂类物质的检测具有选择性。

实施例6鼠脑成像

取两只小鼠做平行实验，小鼠通过颈部脱臼法处死，冷冻的新鲜脑部在冷冻切片机上进行切片，切片厚度为10μm。随后将切片贴于ITO玻璃片上，室温真空条件下干燥30-60min，干燥之后，将含有0.1mg/L的六方氮化硼纳米片基质溶液喷洒到组织切片上，进行质谱成像检测。质谱条件：电压：加速电压：19.000kv；延迟引出电压：14.920kv；反射器电压：20.000kv；透镜电压：7.000kv；频率：1.000Hz；激光器能量：75-80％；扫描分辨率为100μm，激光光斑为50μm；负离子模式。成像数据采用FlexImaging v3.0或者BioMap v3.8处理。

参考图9可以看出，在小鼠脑检测中，该基质最显著的特点是倾向选择性检测硫苷脂，即位于质荷比为500～1000的峰。例如，位于888.6的C24:1(脂肪链含24个C，并包含一个不饱和键)硫苷脂。还检测到N-乙酰基-L-天冬氨酸(N-Acetyl-L-aspartic acid)，油酸(oleic acid)，C18硫苷脂(C18sulfatide)，C24:1硫苷脂(C24:1sulfatide)以及C24-OH硫苷脂(C24-OH sulfatide)。

此外，该基质也支持高分辨率的质谱成像。参考图10，分别对两只小鼠的切片进行检测，对两份切片样品中质荷比(m/z)为888.8的硫苷脂(ST)(结构式见图9)以及质荷比为(m/z)885.6的磷脂酰肌醇(PI)(结构式见式1)的含量进行检测，由质谱成像图中可以清晰地看出上述两种物质在两只小鼠脑切片中的位置分布以及含量(由图中的亮度表示)。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。