专利名称：生物功能化纳米钛材及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物医学材料领域，涉及一种生物功能化纳米钛材，还涉及该钛材的 制备方法。
背景技术：
20世纪40年代初，Bothe等人将钛植入老鼠的股骨中发现其与骨之间无任何不良 反应，从而将钛引入到生物医学材料领域。自20世纪60年代钛种植体被广泛应用于口腔 医学领域以来，钛用作种植材料得到了不断发展，且随着研究的不断深入，钛材被普遍认为 是很有前途的医学植入材料。由于钛及钛合金具有生物惰性，骨整合性差，不能很好地与人体周围组织结合，存 在愈合时间长、初期稳定性差等缺点，导致钛种植体的植入成功率较低。为提高钛及钛合金 的生物活性，进一步提高其骨整合性，钛及钛合金的表面工程研究已成为生物医学材料领 域的一大热点。已有研究表明，材料在机体内的骨整合性与材料表面的形貌结构有关。由于细胞 在机体内所接触的界面均为纳米结构，如各种组织的基膜均由5(T200nm大小的凹、突、孔 和纤维组成，因此在材料表面仿生构建纳米尺度的表面形貌可能对细胞生长有积极影响。 例如，在钛材表面构建具有细胞响应性的纳米结构，有望提高钛材的生物活性，使其能够在 生物体微环境的生理信号刺激下作出响应，达到自我修复的目的。除了材料表面的形貌结 构会影响细胞行为外，材料表面的化学成分也会对细胞生长产生一定影响。表面修饰是改 变材料表面化学成分的重要方法。例如，通过化学或物理方法，可将生长因子、激素或其它 化学物质固定在材料表面。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种生物功能化纳米钛材，通过改变材料 表面的拓扑结构和化学成分，协同提高细胞在钛材表面的增殖及分化能力，进而提高钛材 的骨整合性。为达到上述目的，本发明提供如下技术方案
生物功能化纳米钛材，钛材表面具有管径为3(Tl00nm的TW2纳米管阵列，所述TW2纳 米管阵列表面还固定有骨形态发生蛋白2 (BMP2)。进一步，所述BMP2通过聚多巴胺固定在TW2纳米管阵列表面。本发明的目的之二在于提供一种所述生物功能化纳米钛材的制备方法，操作简便 易行，周期短，成本低。为达到上述目的，本发明提供如下技术方案 生物功能化纳米钛材的制备方法，包括以下步骤
a、将钛材按照常规方法进行预处理；
b、采用阳极氧化法在步骤a预处理后的钛材表面制备管径为3(Tl00nm的TW2纳米管阵列；
C、在步骤b制得的TW2纳米管阵列表面沉积聚多巴胺；
d、通过接触反应使BMP2固定在步骤c制得的表面沉积有聚多巴胺的TW2纳米管阵列 表面，即制得生物功能化纳米钛材。进一步，所述步骤a是将钛材依次用丙酮、无水乙醇、去离子水超声清洗1(Γ30分 钟，干燥备用。进一步，所述步骤b是以步骤a预处理后的钛材为阳极，钼电极为阴极，置氟化铵 电解液中，在1(T25V的恒电压下电解，将氧化后的钛材用去离子水洗涤，干燥，制得表面具 有管径为3(Tl00nm的TW2纳米管阵列的钛材。进一步，所述步骤b是将氟化铵用体积分数为50%的乙醇溶液溶解制成浓度为 0. 27mol/L的溶液，作为电解液；再以步骤a预处理后的钛材为阳极，钼电极为阴极，置上述 氟化铵电解液中，在1(T25V的恒电压下电解3小时，将氧化后的钛材用去离子水洗涤，干 燥，制得表面具有管径为3(Tl00nm的TW2纳米管阵列薄膜的钛材。进一步，所述步骤c是将步骤b制得的表面具有T^2纳米管阵列的钛材置碱性多 巴胺溶液中反应，制得TW2纳米管阵列表面沉积有聚多巴胺的钛材。进一步，所述步骤c是将盐酸多巴胺用浓度为lOmmol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲 液溶解制成浓度为2mg/mL的溶液，调节pH至8. 5 ；将步骤b制得的表面具有T^2纳米管阵 列的钛材浸入上述碱性多巴胺溶液中，室温下避光反应过夜，再用去离子水洗涤，干燥，制 得TW2纳米管阵列表面沉积有聚多巴胺的钛材。进一步，所述步骤d是将BMP2用PBS溶解制成浓度为80ng/mL的溶液，将步骤c 制得的TW2纳米管阵列表面沉积有聚多巴胺的钛材浸入上述BMP2溶液中，4°C反应过夜， 再用PBS洗涤，干燥，即制得生物功能化纳米钛材。本发明的有益效果在于本发明通过阳极氧化法在钛材表面构建管径为 30^100nm的TW2纳米管阵列，再通过聚多巴胺在TW2纳米管阵列表面固定上BMP2，获得 了一种生物功能化纳米钛材；该钛材具有良好的生物相容性，一方面，合适管径的TiO2纳 米管阵列可为细胞生长提供适合的拓扑结构；另一方面，BMP2作为生长因子可促进细胞分 化；通过拓扑结构与化学成分的协同作用，可以提高细胞在钛材表面的增殖与分化能力，进 而提高钛材的骨整合性。此外，该钛材的制备方法简便易行，周期短，成本低。因此，本发明 的生物功能化纳米钛材具有良好的应用前景。
图1为表面具有管径为30nm的TiO2纳米管阵列的钛材的场发射扫描电镜 (FE-SEM)图。图2为表面具有管径为60nm的TW2纳米管阵列的钛材的FE-SEM图。图3为表面具有管径为IOOnm的TiO2纳米管阵列的钛材的FE-SEM图。图4为表面具有TW2纳米管阵列的钛材表面的X射线光电子能谱(XPS)图。图5为TW2纳米管阵列表面沉积有聚多巴胺的钛材表面的XPS谱图。图6为表面具有TW2纳米管阵列和BMP2修饰的钛材表面的XPS谱图。图7为本发明的生物功能化纳米钛材表面诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)向成骨细胞分化的能力。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的优 选实施例进行详细的描述。实施例1、生物功能化纳米钛材(TW2纳米管管径为30nm)的制备 包括以下步骤
a、将钛材依次用丙酮、无水乙醇、去离子水超声清洗20分钟，37°C烘干，备用；
b、将氟化铵用体积分数为50%的乙醇溶液溶解制成浓度为0.27mol/L的溶液，作为电 解液；再以步骤a预处理后的钛材为阳极，钼电极为阴极，置上述氟化铵电解液中，在IOV的 直流电作用下电解3小时，将氧化后的钛材用去离子水浸泡洗涤3次，37°C烘干，制得表面 具有管径为30nm的TW2纳米管阵列的钛材，其FE-SEM图如图1所示；
c、将盐酸多巴胺用浓度为lOmmol/L的Tris缓冲液溶解制成浓度为aiig/mL的溶液，调 节pH至8. 5 ；将步骤b制得的表面具有TW2纳米管阵列的钛材浸入上述碱性多巴胺溶液 中，室温下避光反应过夜，再用去离子水洗涤3次，自然干燥，制得TiO2纳米管阵列表面沉 积有聚多巴胺的钛材；
d、将BMP2用PBS溶解制成浓度为80ng/mL的溶液，将步骤c制得的TW2纳米管阵列 表面沉积有聚多巴胺的钛材浸入上述BMP2溶液中，40C反应过夜，再用PBS洗涤3次，干燥， 制得表面具有T^2纳米管阵列和BMP2修饰的钛材，即本发明所述的生物功能化纳米钛材 (TiO2纳米管管径为30nm)。分别取步骤b、C、d制得的钛材，对其表面化学组成进行XPS表征，结果如图4飞和 表1所示，可见N元素含量逐渐提高，说明在TiA纳米管阵列表面成功引入了 BMP2。表1、样品表面的化学组成(按质量百分含量计)
实施例2、生物功能化纳米钛材(11 纳米管管径为60nm)的制备
包括以下步骤
a、将钛材依次用丙酮、无水乙醇、去离子水超声清洗20分钟，37°C烘干，备用；
b、将氟化铵用体积分数为50%的乙醇溶液溶解制成浓度为0.27mol/L的溶液，作为电 解液；再以步骤a预处理后的钛材为阳极，钼电极为阴极，置上述氟化铵电解液中，在20V的 直流电作用下电解3小时，将氧化后的钛材用去离子水浸泡洗涤3次，37°C烘干，制得表面 具有管径为60nm的TW2纳米管阵列的钛材，其FE-SEM图如图2所示；
c、将盐酸多巴胺用浓度为lOmmol/L的Tris缓冲液溶解制成浓度为aiig/mL的溶液，调 节pH至8. 5 ；将步骤b制得的表面具有TW2纳米管阵列的钛材浸入上述碱性多巴胺溶液 中，室温下避光反应过夜，再用去离子水洗涤3次，自然干燥，制得TiO2纳米管阵列表面沉积有聚多巴胺的钛材；
d、将BMP2用PBS溶解制成浓度为80ng/mL的溶液，将步骤c制得的TW2纳米管阵列 表面沉积有聚多巴胺的钛材浸入上述BMP2溶液中，40C反应过夜，再用PBS洗涤3次，干燥， 制得表面具有T^2纳米管阵列和BMP2修饰的钛材，即本发明所述的生物功能化纳米钛材 (TiO2纳米管管径为60nm)。实施例3、生物功能化纳米钛材(TW2纳米管管径为IOOnm)的制备 包括以下步骤
a、将钛材依次用丙酮、无水乙醇、去离子水超声清洗20分钟，37°C烘干，备用；
b、将氟化铵用体积分数为50%的乙醇溶液溶解制成浓度为0.27mol/L的溶液，作为电 解液；再以步骤a预处理后的钛材为阳极，钼电极为阴极，置上述氟化铵电解液中，在25V的 直流电作用下电解3小时，将氧化后的钛材用去离子水浸泡洗涤3次，37°C烘干，制得表面 具有管径为IOOnm的TW2纳米管阵列的钛材，其FE-SEM图如图3所示；
c、将盐酸多巴胺用浓度为lOmmol/L的Tris缓冲液溶解制成浓度为aiig/mL的溶液，调 节pH至8. 5 ；将步骤b制得的表面具有TW2纳米管阵列的钛材浸入上述碱性多巴胺溶液 中，室温下避光反应过夜，再用去离子水洗涤3次，自然干燥，制得TiO2纳米管阵列表面沉 积有聚多巴胺的钛材；
d、将BMP2用PBS溶解制成浓度为80ng/mL的溶液，将步骤c制得的TW2纳米管阵列 表面沉积有聚多巴胺的钛材浸入上述BMP2溶液中，40C反应过夜，再用PBS洗涤3次，干燥， 制得表面具有T^2纳米管阵列和BMP2修饰的钛材，即本发明所述的生物功能化纳米钛材 (TiO2纳米管管径为lOOnm)。实施例4、生物功能化纳米钛材表面诱导骨髓MSCs向成骨细胞分化的能力 采用密度梯度离心法与贴壁筛选法相结合培养大鼠骨髓MSCs。将3X IO4个MSCs接种
到直径为1. 5mm的圆形材料(分别为表面未处理的钛材、表面BMP2修饰的钛材、表面具有管 径为3(Tl00nm的TW2纳米管阵列的钛材、以及实施例广3制得的生物功能化纳米钛材)表 面，用含有体积分数为10%的新生牛血清的DMEM培养基培养，每3天更换新鲜培养基，分别 于培养7天和14天后，用质量分数为0. 25%的胰酶溶液消化，收集细胞，用质量分数为1% 的Triton-XlOO溶液裂解细胞，离心取上清，检测细胞裂解上清中碱性磷酸酶的表达量。结果如图7所示，表面BMP2修饰的钛材相比表面未处理的钛材，其表面接种的大 鼠骨髓MSCs在培养7天、14天时的碱性磷酸酶表达量明显提高(P<0. 05)，说明在钛材表面 单独引入BMP2可以促进骨髓MSCs向成骨细胞分化；表面具有管径为30nm的TiO2纳米管阵 列的钛材相比表面未处理的钛材，其表面接种的大鼠骨髓MSCs在培养7天时的碱性磷酸酶 表达量有一定增加，在培养14天时的碱性磷酸酶表达量相近，而表面具有管径为IOOnm的 TiO2纳米管阵列的钛材相比表面未处理的钛材，其表面接种的大鼠骨髓MSCs在培养7天、 14天时的碱性磷酸酶表达量均降低，说明在钛材表面单独引入合适管径的TiO2纳米管阵列 也可以在初期促进骨髓MSCs向成骨细胞分化；TW2纳米管管径为3(Tl00nm的生物功能化 纳米钛材与表面具有相应管径T^2纳米管阵列的钛材之间的碱性磷酸酶表达量差值，不管 是培养7天还是14天，均明显高于表面BMP2修饰的钛材与表面未处理的钛材之间的碱性 磷酸酶表达量差值(P<0. 05)，说明在钛材表面同时引入TW2纳米管阵列结构和BMP2，可以 协同促进大鼠骨髓MSCs向成骨细胞分化，其中又以管径为30nm的TiO2纳米管阵列为最佳。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参 照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可 以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明 的精神和范围。
权利要求
1.生物功能化纳米钛材，其特征在于钛材表面具有管径为3(Tl00nm的1102纳米管阵 列，所述TiA纳米管阵列表面还固定有骨形态发生蛋白2即BMP2。
2.根据权利要求1所述的生物功能化纳米钛材，其特征在于所述BMP2通过聚多巴胺 固定在TW2纳米管阵列表面。
3.权利要求1或2所述生物功能化纳米钛材的制备方法，其特征在于包括以下步骤a、将钛材按照常规方法进行预处理；b、采用阳极氧化法在步骤a预处理后的钛材表面制备管径为3(Tl00nm的TiO2纳米管 阵列；C、在步骤b制得的TW2纳米管阵列表面沉积聚多巴胺；d、通过接触反应使BMP2固定在步骤c制得的表面沉积有聚多巴胺的TW2纳米管阵列 表面，即制得生物功能化纳米钛材。
4.根据权利要求3所述的生物功能化纳米钛材的制备方法，其特征在于所述步骤a 是将钛材依次用丙酮、无水乙醇、去离子水超声清洗1(Γ30分钟，干燥备用。
5.根据权利要求3所述的生物功能化纳米钛材的制备方法，其特征在于所述步骤b 是以步骤a预处理后的钛材为阳极，钼电极为阴极，置氟化铵电解液中，在1(T25V的恒电压 下电解，将氧化后的钛材用去离子水洗涤，干燥，制得表面具有管径为3(Tl00nm的TW2纳 米管阵列的钛材。
6.根据权利要求5所述的生物功能化纳米钛材的制备方法，其特征在于所述步骤b 是将氟化铵用体积分数为50%的乙醇溶液溶解制成浓度为0. 27mol/L的溶液，作为电解液； 再以步骤a预处理后的钛材为阳极，钼电极为阴极，置上述氟化铵电解液中，在1(T25V的恒 电压下电解3小时，将氧化后的钛材用去离子水洗涤，干燥，制得表面具有管径为3(Tl00nm 的TW2纳米管阵列薄膜的钛材。
7.根据权利要求3所述的生物功能化纳米钛材的制备方法，其特征在于所述步骤c 是将步骤b制得的表面具有TW2纳米管阵列的钛材置碱性多巴胺溶液中反应，制得TW2纳 米管阵列表面沉积有聚多巴胺的钛材。
8.根据权利要求7所述的生物功能化纳米钛材的制备方法，其特征在于所述步骤C 是将盐酸多巴胺用浓度为lOmmol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液溶解制成浓度为aiig/mL的 溶液，调节pH至8. 5 ；将步骤b制得的表面具有TW2纳米管阵列的钛材浸入上述碱性多巴 胺溶液中，室温下避光反应过夜，再用去离子水洗涤，干燥，制得T^2纳米管阵列表面沉积 有聚多巴胺的钛材。
9.根据权利要求3所述的生物功能化纳米钛材的制备方法，其特征在于所述步骤d 是将BMP2用PBS溶解制成浓度为80ng/mL的溶液，将步骤c制得的TW2纳米管阵列表面 沉积有聚多巴胺的钛材浸入上述BMP2溶液中，40C反应过夜，再用PBS洗涤，干燥，即制得生 物功能化纳米钛材。
全文摘要
本发明属于生物医学材料领域，涉及一种生物功能化纳米钛材，钛材表面具有管径为30~100nm的TiO2纳米管阵列，TiO2纳米管阵列表面还固定有骨形态发生蛋白2(BMP2)；其制备方法是先采用阳极氧化法在钛材表面制备管径为30~100nm的TiO2纳米管阵列，再通过聚多巴胺将BMP2固定在TiO2纳米管阵列表面，即得；该生物功能化纳米钛材具有良好的生物相容性，一方面，合适管径的TiO2纳米管阵列可为细胞生长提供适合的拓扑结构，另一方面，BMP2作为生长因子可促进细胞分化，通过拓扑结构与化学成分的协同作用，可以提高细胞在钛材表面的增殖与分化能力，进而提高钛材的骨整合性。
文档编号C25D11/26GK102058904SQ201010618570
公开日2011年5月18日 申请日期2010年12月31日 优先权日2010年12月31日
发明者来敏, 蔡开勇, 陈秀勇 申请人:重庆大学