植物gmp合成酶的制作方法

专利名称：植物gmp合成酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及作为除草剂新的靶蛋白的植物GMP合成酶(鸟苷酸合成酶)的鉴定。本发明还涉及编码具有GMP合成酶(EC 6.3.5.2)活性多肽的DNA序列。本发明还涉及利用植物来源的编码具有GMP合成酶活性蛋白质的核酸产生一个测试系统，用于对具有除草性的GMP合成酶抑制剂进行鉴定，以及通过此测试系统所鉴定的植物GMP合成酶抑制剂。本发明还涉及利用编码植物GMP合成酶的核酸生产对GMP合成酶抑制剂抗性增加的植物，以及生产鸟嘌呤核苷酸含量改变的植物。另外，本发明涉及消除有害植物生长的方法，包括利用与GMP合成酶进行特异性结合的化合物处理需要被消除的植物，其中GMP合成酶是由SEQ-ID NO1所示的一段DNA序列编码，或者是由与此序列杂交的一段DNA序列编码，化合物抑制GMP合成酶的功能。
植物能够利用二氧化碳、水和无机盐合成它们的细胞组分。
这一方法只能通过生物化学反应合成有机物，必须在植物中从头合成作为核酸结构组分的核苷酸。
尤其在快速生长的植物组织中，必须通过多级代谢途径来合成作为核酸DNA和RNA结构组分的核苷酸。而且，核苷酸与实际上所有的代谢途径都有关联。核苷三磷酸，尤其ATP，驱动细胞中的能量消耗反应。腺嘌呤核苷酸还可以作为基本辅酶，如辅酶A和尼克酰胺和黄素辅酶的组分，参与许多细胞的转化。鸟嘌呤核苷酸能够指导多种细胞过程的反应，包括蛋白质翻译，微管组装，囊泡运输，信号转导和细胞分裂。另外，尤其是在茜草科和茶科的植物中，核苷酸是合成甲基黄嘌呤如咖啡因和可可碱的起始代谢物。
嘌呤核苷酸在微生物、动物和植物中同样是从磷酸核糖焦鳞酸(PRPP)开始从头合成的。IMP是在十步反应程序中合成的，在下一步反应中通过腺苷酸琥珀酸合成酶和腺苷酸琥珀酸裂解酶的作用将IMP转化为AMP。在GMP的合成中，IMP首先通过IMP脱氢酶转化成XMP，然后经GMP合成酶的氨化被转化成GMP，参见附

图1。
已经从各种生物体中分离出编码GMP合成酶[sic]的基因。
至今对植物中的嘌呤生物合成途径的区室作用没有作深入的研究，以谷氨酰胺和天冬氨酸的形式固定在豆科植物根瘤中的氮，首先经从头合成途径转变成嘌呤，这个途径位于大豆和豇豆根瘤的质体中(Boland andSchubert，Arch.Biochem.Biophys.220(1983)，179＝187；Shelp等，Arch.Biochem.Biophys.224(1983)，429-441)。然而，最近的研究表明，在豇豆根瘤的线粒体中也发现了嘌呤生物合成途径的酶活性[sic](Atkins等，植物生理学(Plant Physiogy)133(1997)，127-135；Smith等，植物分子生物学(Plant Molecular Biology 36(1998)，811-820)。
对合成途径的调节的研究至今仅在微生物和动物中进行，调节作用包括转录调控，终产物抑制和别构调节。反应第二步中的磷酸核糖焦磷酸酰胺转移酶(PRPP ATASE)既是动物，也是植物系统中的关键位点，并且它受到终产物IMP，AMP和GMP的别构调节(Reynolds等，Archives ofBiochemistng and Biophysics 229(1984)，623-631)。
因为ATP是GMP合成酶的底物，所以在鸟苷核苷酸和腺苷核苷酸的平衡合成中，GMP合成酶也起着作用。
由于植物依赖于功能核苷酸的新陈代谢，所以很明显这种代谢是新的除草剂的可能的靶目标。事实上已经对具有抑制嘌呤从头生物合成酶的作用的试剂进行了描述，举列来说有5′-phosphohydantocidin，它抑制植物嘌呤代谢中的一种酶，即腺苷酸琥珀酸合成酶(ASS)(Siehl等，PlantPhysiol，110(1996)，753-758)。
对于动物和微生物，这个代谢途径的酶的抑制剂也存在，叶酸类似物抑制除了GAR转甲酰酶之外的各种叶酸依赖性的反应，并且具有抗增殖、抗炎症及免疫抑制的作用。霉酚酸(MPA)，作为IMP脱氢酶的抑制剂，具有抗微生物、抗病毒和免疫抑制的作用(Kitchin等，Journa of the AmericanAcademy of Dermatoloy 37(1997)，445-449)。
例如，可以在转基因植物中利用反义技术，通过减少酶活力来验证一种酶作为除草剂靶目标的适宜性。如果这种方法引起植物生长减慢，就可以推断出活性被减少的酶是除草剂作用的适宜位点，这一点可以通过转基因马铃薯中的乙酸乳酸合成酶的实施例来说明(Hofgen等，Plant Physioloy107(1995)，469-477)。
本发明的目的是证明植物中的GMP合成酶是合适的除草剂靶蛋白，分离出编码GMP合成酶的完整植物cDNA，并在细菌或真核细胞中进行功能性表达，产生一个有效而简捷的GMP合成酶测试系统，用于开展抑制剂-酶结合的研究。
我们已经发现本目的可以通过分离编码植物GMP合成酶的基因，生产出GMP合成酶的反义构建体，并在细菌或真核细胞中功能性表达GMP合成酶来实现。
本发明的一方面是涉及对烟草(Nicotiana tabacum)中的编码功能性谷氨酰胺水解的GMP合成酶(EC6.3.5.2)的全长cDNA进行分离。
本发明首先涉及的一方面是如SEQ-ID NO1所示的一段DNA序列，它具有烟草的植物GMP合成酶的编码区，参见实施例1。
本发明的另一方面是如SEQ-ID NO3所示的一段DNA序列，它具有展叶剑叶藓(Physcomitrella patens)的植物GMP合成酶编码区的一部分，参见实施例2。
本发明的另一方面是从SEQ ID NO1或SED IN NO3所示序列或与这两种中的一种序列的杂交序列衍生得到的DNA序列，它们编码的蛋白具有GMP合成酶的生物活性。
对含有GMP合成酶反义构建体的Nicotiana tabacum cv.Samsun NN系中的烟草的特点进行了详细研究，这种植物显示出不同程度的生长延迟。转基因品系，以及第一和第二子代在土壤中的生长减慢，在生产减慢的植株中，可以利用RNA印迹检测到GMP-7M RNA的量比野生型减少，也可以利用蛋白质印迹实验检测到转基因品系中的GMP合成酶蛋白量比野生型减少，参见实施例7。可以发现生长延迟和GMP合成酶蛋白量的减少具有相关性，这种明显的关联首次证实GMP无疑是除草剂合适的靶蛋白。
为了能够找到植物GMP合成酶有效的抑制剂，必须提供测试系统，以进行抑制剂-酶结合的研究。为此，例如将烟草中GMP合成酶的全cDNA序列克隆到一个表达载体(pQE，Qiagen)，并在大肠杆菌中进行表达，参见而且还可以在例如其它细胞、酵母、真菌、藻类、植物细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞中表达具有如SPQ ID NO1所示DNA序列的表达序列盒，参见实施例5。
借助本发明的表达序列盒表达的GMP合成酶蛋白尤其适合于寻找GMP合成酶的特异性抑制剂。
为此，可将植物GMP合成酶应用于酶检测，在被检测试剂存在或不存在时对GMP合成酶的活力进行测定。通过比较两种条件下的活力测定值，可以得到有关被检测试剂的抑制性能的定性和定量信息，参见实施例8。
利用本发明的酶测试系统能够快速简便的测检大量化学化合物的除草性。这一方法允许从大量底物中重复性地筛选出那些具有潜在效应的底物，以便今后对这些物质进行为技术人员所熟悉的，其它更深入的检测。
本发明的另一方面是用于鉴定具有除草作用的物质的方法，此类物质抑制植物GMP合成酶活性，方法包括a)制备转基因植物，植物组织或植物细胞，它们包含一段编码具有GMP合成酶活性的酶的附加DNA序列，并且能够过量表达具有酶活性的GMP合成酶。
b)将一种物质施用于转基因的植物，植物细胞，植物组织或植物部分，以及未转化的植物，植物细胞，植物组织或植物部分；c)测定施用化学物质后转基因的和未转化的植物，植物细胞，植物组织或植物部分的生长和成活率；以及d)比较施用化学物质后转基因的和未转化的植物，植物细胞，植物组织或植物部分的生长和成活率；未转化的植物，植物细胞，植物组织或植物部分的生长和成活率受抑制，而转基因的植物，植物细胞，植物组织或植物部分的生长和成活率没有受到抑制，这说明了b)中的物质表现出除草的活性，抑制了植物GMP合成酶的活性。
本发明的另一方面是通过克隆植物GMP合成酶基因，并在适当的表达序列盒中引发过表达的方法，对具有潜在除草作用的植物GMP合成酶抑制剂进行鉴定。例如在昆虫细胞中，先破碎细胞，将细胞提取物直接应用于测试系统或将浓缩或分离出来的GMP合成酶应用于测试系统，测定在低分子量的化学化合物存在时的酶活力。
本发明的另一方面包括具有除草作用的化合物，可以通过上述的测试系统对它进行鉴定。
本发明的另一方面是清除有害植被的方法，包括用化合物处理需要被清除的植物，这种化合物特异性的与植物GMP合成酶进行结合并且抑制此酶的功能。
具有除草作用的植物GMP合成酶可以被用作脱叶剂，干燥剂，稻草杀剂，尤其是可用作野草杀剂。野草，从广义上来讲，是指生长在不被需要的地方的所有植物。根据本发明中的检测系统发现的试剂是作为完全性的杀草剂还是作为选择性的除草剂主要取决于所施用率。
具有除草作用的GMP合成酶抑制剂可以用于，例如，抗以下野草双子叶的野草类白芥属，独行菜属，猪殃殃属，繁缕属，母菊属，春黄菊属，牛膝菊属，藜属，荨麻属，千里光属，苋属，马齿苋属，苍耳属，旋花属，番薯属，琴属，田菁属，豚草属，蓟属，飞廉属，苦苣菜属，茄属，菜属，节节菜属，球梳霉属，野芝麻属，婆婆纳属，苘麻属，Emex，曼陀罗属，黄鼠狼花属，罂粟属，矢车菊属，三叶草属，毛茛属，蒲公英属。
单子叶的野草类稗属，狗尾草属，黍属，马唐属，梯牧草属，早熟禾属，羊茅属，蟋蟀草属，臂刊草属，黑麦草属，雀麦属，燕麦属，莎草属，蜀黍、高粱属，冰草属，绊根草属，雨久花属，飘拂草属，慈茹属，荸荠属，莞草属，雀稗属，鸭嘴草属，尖瓣花属，龙爪茅属，剪股颖属，春麦娘属，Apera。
本发明的另一方面包括表达序列盒，它们的序列编码一种烟草的GMP合成酶或它的同功能酶。与此相关的核酸序列可以是，如DNA或cDNA序列。
本发明的另一方面是具有DNA序列SEQ ID NO.3的表达盒，该DNA序列编码部分展叶剑藓的植物GMP合成物。
本发明的表达序列盒中还包含调节核酸序列，它们调控宿主细胞的编码序列的表达。在优化的具体实施案例中，本发明的表达序列盒包括一个启动子上游，即5′-末端的编码序列，和一个聚腺苷酰化作用信号下游，即3′-末端，以及适当情况下，还包括与位于上下游之间的GMP合成酶基因编码序列进行可操纵性地连接的其它调节元件。可操纵性地连接的含义是指启动子、编码序列、终止子，以及适当情况下，其它的调节元件，按照一定的顺序排列，以便在编码序列进行表达时，每一个调节元件能够各尽其能。
本发明的表达序列盒是通过适当的启动子与适当的GMP合成酶DNA序列和聚腺苷酰化作用的信号融合在一起得到的，采用的技术是常规的重组和克隆技术，例如参见J.Sambrook等，分子克隆实验室手册(MolecularCloningA Laboratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，NY(1989)和T.J.Silhavy，M.L.Berman and L.W.Enquist，基因融合实验(Experiments with Gene Fusions)，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1984)以及Ausubel，F.M.等，分子生物学现行方法(Current Protocols in Molecular Biology)，Greene Publishing Assoc.And Wiley-Interscience(1987)。
本发明另一方面包括功能等同DNA序列，它编码GMP合成酶并且在DNA序列的全长范围内，与SEQ-ID NO1或SEQ-ID NO3所示DNA序列的序列同源性为40至100％。
本发明优选的方面包括功能等同DNA序列，它编码GMP合成酶并且在DNA序列的全长范围内，与SEQ-ID NO1或SEQ-ID NO3所示DNA序列的序列同源性为60至100％。
本发明特别优选的方面包括功能等同DNA序列，它编码GMP合成酶并且在DNA序列的全长范围内，与SEQ-ID NO1或SEQ-ID NO3所示DNA序列的序列同源性为80至100％。
本发明中的编码GMP合成酶的功能等同DNA序列是指，尽管核苷酸序列发生了改变，但仍具有所需要功能的序列。因此功能等同序列包括了自然发生的这里所述序列的变异体，也包括人工合成的核苷酸序列，例如经过化学合成，按照植物中实际使用的特定密码子进行改造得到的功能等同序列。
功能等同序列也可以指，具体的来说，最初被分离出的编码GMP合成酶的天然或人工突变体，它仍具有所需要的功能。突变作用包括取代、加入，删除，交换或者插入一个或几个核苷酸残基。因此，举例来说，本发明也包括对这个核苷酸序列修饰后得到的那些核苷酸序列。修饰的目的可以是，如界定所包含的编码序列，或者插入更多的限制性酶切位点。
功能等同序列也可以是这样的变异体，与原始基因或基因片断相比，它们的功能被增强或被减弱。
另外，本发明的表达序列盒也可应用于转化细菌，蓝细菌，酵母，丝状真菌和藻类，以生产出充足的GMP合成酶。
本发明的另一方面是来自烟草的具有SEQ-ID NO2所示的氨基酸序列的一种蛋白质，或者这个蛋白具有GMP合成酶活性的衍生体或部分。
本发明的另一方面包括具有GMP合成酶活性的植物蛋白质，与烟草GMP合成酶的氨基酸序列具有20-100％同源性。
优选的具有GMP合成酶活性的植物蛋白质，与烟草GMP合成酶的氨基酸序列具有50-100％同源性。
更优选的具有GMP合成酶活性的植物蛋白质，与烟草GMP合成酶的氨基酸序列具有80-100％同源性。
本发明的另一方面包括具有GMP合成酶活性的植物蛋白质，与展叶剑叶藓GMP合成酶的氨基酸序列具有20-100％同源性。
优选的具有GMP合成酶活性的植物蛋白质，与展叶剑叶藓GMP合成酶的氨基酸序列具有50-100％同源性。
更优选的具有GMP合成酶活性的植物蛋白质，与展叶剑叶藓GMP合成酶的氨基酸序列同源体具有80-100％同一性。
本发明的另一个目的是在植物中过表达GMP合成酶基因，以产生可以耐受GMP合成酶抑制剂的植物。
在植物中过表达如SEQ-ID NO1所示的编码GMP合成酶的基因序列可以导致对GMP合成酶抑制剂的抗性增加。以这种方式产生的转基因植物同样是本发明的一个方面。
对转基因后被表达的GMP合成酶基因的表达功效，可以通过芽分裂组织的繁殖或发芽试验来体外测定。另外，GMP合成酶基因的性质和表达水平发生的变化，以及这一变化对GMP合成酶抑制剂的抗性效应的影响，可以从温室实验中的实验植物检测出来。
本发明另一方面包括转基因植物，它们是由本发明中具有SEQ-ID NO1序列的表达序列盒转化得到，由于SEQ-ID NO1序列的附加的表达使得这些植物能够耐受GMP合成酶抑制剂的作用，本发明还包括这种植物的转基因的细胞，组织，部分以及繁殖材料。提供的特别优选的相关转基因作物有，如大麦，小麦，黑麦，玉米，大豆，水稻，棉花。甜菜，canola，向日葵，亚麻，大麻，马铃薯，烟草，西红柿，油菜籽，紫花苜蓿，莴苣以及各种树木，坚果，葡萄，豆类。
植物中核苷酸含量发生改变可以具有很多益处，例如，将核苷酸添加到以植物为基础的婴儿食品中以获得与母乳相似的营养溶液。另外，在肠胃病人的饮食中优化核苷酸含量是明智的，适当减少植物食物中嘌呤核苷酸的含量适用于痛风病人的饮食。核苷酸还具有形成味道和强化味道的作用，因此改变核苷酸的含量对植物的品味具有影响。
本发明的另一方法因此包括这样的植株，在植株中表达如SEQ-ID NO1或SEQ-ID NO3所示的DNA序列之后，具有修饰含量的鸟嘌呤核苷酸的植株。
具有修饰含量的鸟嘌呤核苷酸的植株是依据，例如在植株中以有义或反义方向表达如SEQ-ID NO1或SEQ-ID NO3所示的附加DNA序列。鸟嘌呤核苷酸的修饰含量是指在以有义方向进行表达时可以产生鸟嘌呤核苷酸含量增加的植株，以及在以有义方向(共抑制)或反义方向进行表达时产生鸟嘌呤核苷酸含量减少的植株。
增加鸟嘌呤核苷酸含量意味着，例如，在本发明的范围内与没有进行遗传处理的至少一代植株相比，由于过表达植物GMP合成酶基因使鸟嘌呤核苷酸的生物合成增加的这种人为实用能力。
本发明的另一方面是利用植物GMP合成酶改变植株中甲基黄嘌呤的浓度。
特别优选的序列是那些能够确保定向进入质外体，质体，液泡，线粒体或内质网的序列，或者那些，由于缺少适当的操纵序列，能够确保产物保留在生产区室，即胞液中的序列(Kermode，Crit.Rev.Plant Sci.15，4(1996)，285-423)。
例如，可以将植物的表达序列盒整合到烟草转化载体上(pBinAR)(参见实施例6)。
适用于本发明表达序列盒的启动子，原则上，是任何能够调控外源基因在植物中进行表达的启动子。尤其优选植物的启动子或从植物病毒衍生的启动子，特别优选的是烟草花叶病毒CaMV 35S启动子(Frank等，细胞21(1980)，285-294)。这个启动子包含转录效应子的各种识别序列，转录效应子从整体上导致引入基因的永久表达和组成型表达(Benfey等，EMBOJ.8(1989)，2195-2202)。
本发明的表达序列盒也可以包含一个可化学诱导的启动子，它能够在一个特定的时间点调控外源GMP合成酶基因在植物中进行表达。这样的启动子例如PRP1启动子(Ward等，Plant.Mol.Biol.(1993)22，361-366)，水杨酸诱导的启动子(WO 95/19443)，苯硫酰胺诱导的启动子(EP 388186)，四环素诱导的启动子(Gatz等，Plant J.(1992)2，397-404)，脱叶酸诱导的启动子(EP 0335528)，乙醇或环己酮诱导的启动子(WO 93/21334)，在文献中都有描述而且可以应用。
而且，特别优选的启动子，是那些在进行嘌呤或其前体物生物合成的组织或植株部分能够确保表达的启动子，尤其是能够确保叶片特异性表达的启动子，如马铃薯胞液果糖二磷酸酶启动子或马铃薯ST-LSI启动子(Stockhaus等，EMBO J.，(1989)8，2445-2451)。
利用种子特异性启动子，外来蛋白可以在转基因马铃薯的种子中稳定的被表达，并且其含量占全部可溶性种子蛋白质的0.67％(Fiedler andConrad，Bio/Technology(1995)10，1090-1094)。因此本发明的表达序列盒可以包含一个种子特异性启动子(优选云扁豆蛋白启动子，USP或LEB4启动子)，LEB4信号肽，被表达的基因，以及一个内质网保持信号。
编码GMP合成酶的插入核苷酸序列可以通过合成产生，或者从天然获得，或者由合成的或天然的DNA组分混合形成。通常，生产合成核苷酸序列优选植物密码子，这类植物优选密码子可以通过在大多数所研究的植物种类中具有最高表达频率的蛋白质所对应的密码子来确定。在制备表达序列盒时，为了获得能够以正确的方向方便阅读并且配有一个正确的阅读框的一段核苷酸序列，可以利用各种DNA片断。为使DNA片断彼此相连，可以将接合体或接头接到片断框架上。
其它适用的DNA序列可以是人工构建的DNA序列，如以上实例所描述的，只要它们能够提供所需要的特性，即通过在农作物中过表达GMP合成酶基因来增加植物中鸟嘌呤核苷酸的含量。例如，可以通过对具有GMP合成酶活性并且由分子模型构建的蛋白质进行反翻译，或者通过体外筛选找到这样的人工DNA序列。特别适用的编码DNA序列，是按照宿主特异性使用的密码子反翻译出的一段多肽序列。熟悉植物遗传学方法技术人员可以很容易通过计算机分析其它的被转化植物的已知基因，找到实际使用的特定密码子。
本发明的其它适用的等同核酸序列可以是编码融合蛋白的序列，融合蛋白其中的一个组分是植物GMP合成酶多肽，或者是GMP合成酶多肽的一部分功能性等同体。融合蛋白的第二部分可以是其它具有酶活力的多肽，或是抗原多肽序列，借助它可以用来检测GMP合成酶的表达(如myc tag或his tag)。然而，它最好是一个调节蛋白序列如，信号或转移肽，能够将GMP合成酶蛋白引导至所需要的作用位点。
本发明的启动子区和终止子区最好应该，沿着转录的方向，配备一个接头或多接头，接头中包含一个或多个用于插入序列的限制性酶切位点。一般来说，接头具有1-10，多数是1-8，最好是2-6个限制性位点。通常，调节区内的接头小于100bp，常见的是小于60bp，但是至少是5bp。本发明的启动子可以是来自宿主，或与宿主同源的，也可以是外来的与宿主异源的启动子。本发明的表达序列盒沿着5′-3′转录方向包含本发明的启动子，任一指示转录终止的序列和区域组成。各种终止区可以根据需要彼此进行交换。
可以使用操纵作用来提供适当的限制性酶切位点，或者除去多余的DNA或多余的限制性酶切位点。在适于进行插入、删除、取代，包括转换和颠换的情况下，也可以使用体外的致突变，引物修复，限制性作用或连接作用。在使用如限制性作用、chewing back、或填补平末端的悬垂部分这些操纵作用时，可利用片断的互补性末端来连接片断。
优选的聚腺苷酰化作用信号是植物聚腺苷酰化作用信号，尤其是那些实质上与根癌土壤杆菌T-DNA聚腺苷酰化作用信号相一致的信号，尤其是Ti质粒p TiACH5(Gielen等，EMBO J.3(1984)835 ff)中T-DNA(章鱼肉碱合成酶)的基因3，或者它的功能等同基因。
为了利用编码GMP合成酶基因转化宿主植物，本发明的表达序列盒采取如插入的方式整合到重组载体，载体DNA包含附加的功能调节信号，例如用来复制或整合的序列。适用的载体在“植物分子生物学和生物技术方法”(CRC Press)，Chapter 6/7，pp.71-119，一文中有描述。
将外来基因转移到植物的基因组称为转化作用。利用上述的方法将用于暂时的或稳定的转化作用的植物组织和细胞进行转化，并且再生出植株。适用的方法是原生质体的转化，它可以通过聚乙二醇诱导的DNA吸收，利用基因枪的生物弹射学法，电穿孔，DNA溶液中的干胚胎诱导，显微注射，土壤杆菌介导的基因转移来进行。以上方法的描述参见B.Jenes等，基因转移技术(Techniques for Gene Transfer)in转基因植物(TransgenicPlants)，Vol.1，工程和应用(Engineering and Utilization)，edited byS.D.Kung and R.Wu，Academic Press(1993)128-143，以及Potrykus Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42(1991)205-225)。将被表达的构建体优先克隆到适于转化根癌土壤杆菌的载体，如pBin19中(Bevan等，Nucl.Acids Res.12(1984)8711)。
利用本发明表达序列盒转化的土壤杆菌，同样可以被用来去转化植物，尤其是下列植物谷类，玉米，大豆，水稻，棉花，甘蔗，canola，向日葵，亚麻，大麻，马铃薯，西红柿，油菜籽，紫花苜蓿，莴苣，以及各种树木，坚果，葡萄，豆类。转化的方法是，如将受伤的叶片或叶片的一部分浸泡在土壤杆菌的悬浮液中，然后在适当的培养基中进行培养。
嘧啶的合成部位一般是在叶片组织，所以GMP合成酶基因的叶片-特异性表达很有用处。然而，很明显嘧啶的生物合成不必被限制在叶片组织，而是以组织特异性的方式，可以在植物所有其它部位发生，如在富含脂肪的种子里。
而且外源GMP合成酶基因的组成型表达是有利的，另一方面，也需要诱导性表达。
利用上述的重组和克隆技术，本发明的表达序列盒可以被克隆到适当的载体，并使它得到复制，如克隆到大肠杆菌。适用的克隆载体包括有pBR332，pUC系列，M13mp系列，和pACYC184。特别适用的载体是在大肠杆菌和土壤杆菌中都能够进行复制的二元载体。
本发明另一方面涉及利用本发明的表达序列盒来转化植物，植物细胞，植物的组织或植物的一部分。该用途的优选目标是提高植物中的GMP合成酶的含量。
本发明可以包括，根据启动子的选择不同，特异性发生在叶片，种子或植物的其它部位进行的表达。这样的转基因植物，它们的繁殖材料以及它们植物细胞、组织或部分也是本发明研究的另一方面。
利用下面实施例对本发明进行说明，但不限于此实施例实施例所依据的遗传工程方法普通克隆方法克隆方法，举例来说包括限制性酶切，琼脂糖凝胶电泳，DNA片断的纯化，核酸转移到硝化纤维和尼龙膜，连接DNA片断，埃希氏大肠杆菌细胞的转化，细菌培养，以及重组DNA的序列分析，这些方法可以按照Sambrook等的描述进行操作(Sambrook等(1994)Cold Spring Harbor LaboratoryPressISBN 0-87969-309-6)。
重组DNA的序列分析可以利用ABI激光荧光DNA序列分析仪按照Sanger等的方法对重组DNA分子进行测序(Sanger等，(1997)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA74，5463-5467)。由聚合酶链反应所得片断要进行测序和校对，以避免在被表达的构建体中发生聚合酶错误。
除非特别声明，使用的化学药品是购自以下公司的分析纯产品Fluke(Neu-Ulm)，Merk(Darmstadt)，Roth(Karlsruhe)，Serva(Heidelberg)及Sigma(Deisenhofen)。溶液的制备使用使用的是利用Milli-Q水处理系统(Millipore，Eschborn)制备的无热原的水，在下文中称为H2O。限制性核酸内切酶，DNA-修饰酶和分子生物学试剂盒购自AGS(Heidelberg)，Amersham(Braunschweig)，Biometra(Gottingen)，Roche(Mannheim)，Genomed(Bad Oeynhausen)，New England Biolabs(Schwalbach/Taunus)，Novagen(Madison，Wisconsin，USA)，Perkin-Elmer(Weiterstadt)，Pharmacia(Freiburg)，Qiagen(Hilden)及Stratagene(Heidelberg)，除非特别说明，按照操作说明进行使用。
在下文中使用的细菌菌株(E.coli，XL-blue)购自Stratagene，E.coliAT 2465购自大肠杆菌遗传贮藏中心(Yale University，New Haven)。用于植物转化的土壤杆菌的菌株(根癌土壤杆菌，C58C1具有质粒pGV2260或pGV3850kan)已经被Deblaere等进行过描述(Nucl.Acids Res.13(1985)4777)，或者也可以使用土壤杆菌菌株LBA4404(Clontech)或其它合适的菌株。可以用于克隆的载体有pUC19(Yanish-Perron，Gene33(1985)，103-119)，pBluescript SK-(Stratagene)，pGEM-T(Promega)，pZer0(Invitrogen)，pBin19(Bevan等，Nucl.Acids Res.12(1984)8711-8720)及pBinAR(Hofgen和Willmitaer，Plant Science 66(1990)221-230)。
扩增条件如下退火温度 52℃，1分钟变性温度 92℃，1分钟延长温度 72℃，1.5分钟循环次数 30利用扩增得到的片断对位于载体ZAP Express的烟草(Nicotianatabacum(品种Samsun NN))的愈伤组织的cDNA文库进行筛选。为此，将来自cDNA文库的2.5×105λ噬菌体涂布在含有以大肠杆菌XL1-Blue为细菌菌株的琼脂平板上。按照标准的方法(Sambrook等，(1989)；Cold SpringHarbor Laboratory PressISBN 0＝87969-309-6)将噬菌体DNA转移到硝化纤维素滤膜并且固定在滤膜上。使用的杂交探针是上文描述的经过放射性标记的PCR片断，标记是利用multiprime DNA标记系统(AmershamBuchler)，在α-32P-dCTP(比活性3000Ci/mmol)存在下，根据操作说明进行。在60℃，3 X SSPE，0.1％十二烷基硫酸钠(w/v)，0.02％聚乙烯吡咯烷酮(w/v)，0.02％Ficoll 400(w/v)和50mg/ml小牛胸腺DNA中预杂交12-16小时后，进行膜的杂交(Sambrook等(1989)；Cold Spring HarborLaboratory PressISBN 0-87969-309-6)。然后将膜在2 X SSPE，0.1％十二烷基硫酸钠(w/v)中，60℃下洗涤60分钟。阳性杂交的噬菌体可通过放射自显影术成像，并且通过标准技术进行纯化和分离。
可以鉴定和纯化13种杂交信号，经过限制性内切酶酶切分析，筛选出克隆GMP-6和GMP-7M用于双链的序列测定。对测定的序列数据进行分析，表明克隆GMP-7M的长度为1973bp，其中包含一个长度为1614bp完整的阅读框，它编码一个含有538氨基酸的蛋白质，计算得到的此蛋白质的分子重量为60.1KDa(SEQ-ID NO.1)。在假设的起始密码子之前，有一个终止密码子位于同一个阅读框，由此建议GMP-7M是完整长度的cDNA。因此，GMP-7M代表了GMP合成酶的第一个完整长度的植物cDNA。GMP-6是一个部分克隆，它在5′端比GMP-7M短了217个核苷酸。GMP-7M显示出与微生物和动物中的GMP合成酶具有相似性。除了EST F14426编码的部分氨基酸序列之外，植物中没有其它的序列与数据库中的GMP合成酶具有同源性。GMP-7M与幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)中的GMP合成酶具有最大的相似性(62％)。很明显位于GMP合成酶C末端的相似性要大于N末端区域。GMP-7M N末端的氨基酸序列与其它生物体如E.coli和集胞蓝细菌属(Synechocystis sp.)(附表1)中GMP合成酶的N末端一致。GMP-7M没有被标记的信号序列(通过PSORT程序发现，Nakai，K.，Institute forMolecular and Cellular Biology，Osaka University，Japan)这一点可能表示蛋白质定位在细胞质。
表1对烟草(Nicotiana tabacum)(guaA_N.t＝GMP-7M)，鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)(guaA_est_A.t，Genbank No.F14426)，E.coli(guaA_e.c，Genbank No.146276)，集胞蓝细菌属.(guaA_syn，Genbank No.1001583)，幽门螺杆菌(guaA_h.p，Genbank No.3122166)，Homo sapiens(guaA_human，Genbank No.1708072)中的GMP合成酶进行序列比较。
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扩增条件如下退火温度 50℃，30秒变性温度 92℃，30秒延长温度 72℃，3分钟循环次数 25所得到的约为1670bp的片断经过NcoI和BamHI酶切位点进行连接，酶切位点是由寡聚核苷酸引入载体pTrc99A(Pharmacia)。将所得的构建体GMP-7Trc转化到E.coli菌株AT2465(遗传标记thi-1，guaA21，relA1，λ，spoT1)，并且分别平铺在含有和不含有100μg/ml鸟嘌呤的M9基本培养基上(Sambrook等，(1989)Cold SpringHarbor Laboratoty PressISBN0-87969-309-6)。基本培养基包含0.4％葡萄糖，0.2％酪蛋白氨基酸，100μg/ml硫胺素，100μg/ml肌苷，100μg/ml生物素，100μg/ml组氨酸，100μg/ml精氨酸，100μg/ml脱氧尿苷，100μM异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，25μg/ml氨苄青霉素。在平行试验中，将克隆载体pTrc99A转化到AT2465。事实表明只有含有位于表达载体pTrc99A上的烟草GMP-7M cDNA的转化细菌才能够在不含有鸟嘌呤核苷酸的基本培养基上进行生长(参见附表2)，这一点有力地指明GMP-7McDNA编码活性的GMP合成酶。由GMP-7M编码的酶因此代表了从植物中分离的第一个功能GMP合成酶。表2利用各种质粒转化的E.coli AT2465在37℃，2天后的生长情况
实施例4烟草GMP合成酶在E.coli中的过表达和抗体生产为了能够在E.coli中过表达，通过以GMP-7M为模板和寡聚核苷酸GMPA5′-GCAATGGATCCTCAAACACAGGCG-3′和GMPB5′-AAAAGGATCCTACTTTGGTCACC-3′进行的PCR反应引入BamHI酶切位点，并且能够在载体pET15b(Novagen)中克隆所得到的片断。在N-末端具有六个组氨酸锚定位点的GMP-7M阅读框就是以这种方式产生的。利用限制性消化对校对方向进行核对和经过序列测定去除聚合酶错误，然后将所得的构建体GMP-7E转化到E.coli BL21(DE3)(Stratagene)。通过离心收获IPTG-诱导的一天培养物，将细胞沉积物进行裂解，并且按照操作说明对细胞进一步处理，以进行镍亲和色谱分析(“Qia-Express-kit”，Qiagen)。可以以这种方式纯化GMP合成酶，达到大于95％的纯度。按照常规方法，利用此蛋白质在兔子体内产生抗血清(依照合约由Eurogentec，Herstal，Belgium执行)。
转基因GMP合成酶反义植物及其子代与野生型(WT)的对照植株相比，生长退化，次生叶片(sink leave)褪色，这些表型变化发生在早期生长阶段(参见附图3)。与野生型相比，在生长退化的植株中，可以通过RNA印迹杂交探测到GMP-7M RNA的量减少。取40μg的次生叶片(sinkleaves)的全RNA用于此项研究，按照Logemann等(Anal.Biochem.163(1987)，21)的描述从植物组织中分离全RNA。每次进行分析，先将40μg的RNA分散在含有甲醛的1.5％的琼脂糖凝胶中分级分离，再转移到尼龙膜上(Hybond，Amersham)。按照Amasino(Anal.Biochem.152(1986)，304)的描述探测特异性转录，先产生一个反义链特异性的c-DNA探针，可利用BamHI和BglII酶切质粒GMP-7M，分离出1600bp的片断得到此探针。利用寡聚核苷酸5′-GAT ACG TCG TCA AGG AAC TTG-3′进行标记反应，探针杂交按照标准方法进行，参见Hybond用户信息，Amersham。杂交信号[sic]可通过使用Kodak X-OMATAR胶片获得放射自显影显示出来。可以看出生长表型的表达和GMP-7M RNA含量的减少具有明确的相关性(附图3)。
而且在蛋白质印迹试验中可以探测到，与野生型相比，转基因品系中的GMP合成酶的量减少。试验操作包括从次生叶片(sink leaves)制备总蛋白抽提物，以标准方法在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳上进行分离，再转移到硝化纤维素膜。然后利用IgG-碱性磷酸酶共轭体和BCIP/NBT系统(Sigma)进行检测。
另外，可以通过实施例8所描述的体外试验确定，在生长退化的转基因品系中的GMP合成酶的活力减少。
表达水平和GMP合成酶活力和生长表型之间的关联说明GMP合成酶是除草剂作用的合适的靶蛋白。
或者，GMP合成酶活力也可以利用一个新的系统来测定，即偶联检测所产生的谷氨酸。这个系统的优点是较少的偶联反应步骤并且提供了较大的信号强度。(GMP-S＝GMP合成酶，GluDH＝谷氨酸脱氢酶，APAD＝3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸)为此，将反应混合物(见下)在37℃下培育60分钟，然后在95℃下培育5分钟以终止反应。通过光度测定的方法在363nm下测定APADH的增加来检测在测定混合物(见下)中谷氨酸的形成。
反应混合物100μL 750mM Tris/HCl缓冲剂pH7.8100μL 100mM MgCl25 100μL 80mM KCl100μL 20mM XMP100μL 200mM L-谷氨酰胺400μL H2O100μL蛋白质提取物10 1000μL测定混合物375μL100mM Tris-HCl缓冲剂pH8.015 75 μL500mM KCl125μL H2O75 μL3mMAPAD100μL反应混合物750μL
序列表<110>巴斯福股份公司<120>植物GMP合成酶<130>DE 19947490.7<140>0050-50777<141>1999-10-01<160>4<170>PatentIn Vers.2.0<210>1<211>1973<212>DNA<213>烟草<220><221>CDS<222>(65)..(1678)<400>1gaattcggca cgagatttct ctctatcttt cttcctccca cccaccaccc accctcccct 60agca atg gaa cct caa aca cag gcg aag aaa tca aac ctc gta cta atc 109Met Glu Pro Gln Thr Gln Ala Lys Lys Ser Asn Leu Val Leu Ile1 5 10 15cta gac tac ggt tct cag tac act cac cta atc acc cgc cga atc cga 157Leu Asp Tyr Gly Ser Gln Tyr Thr His Leu Ile Thr Arg Arg Ile Arg20 25 30agc cta tca att ttc tca ctc acc att aac ggc acc tct tcg tta gac 205Ser Leu Ser Ile Phe Ser Leu Thr Ile Asn Gly Thr Ser Ser Leu Asp35 40 45tcc ata aaa gaa ctc gac cca cgt gtc att atc ctc tcg ggt gga ccc 253Ser Ile Lys Glu Leu Asp Pro Arg Val Ile Ile Leu Ser Gly Gly Pro50 55 60cac agc gtc cac gct gac ggc gca ccg tgt ttc cca cct ggg ttc atc 301His Ser Val His Ala Asp Gly Ala Pro Cys Phe Pro Pro Gly Phe Ile65 70 75gaa tac gtc gag tca cgt ggg att cac gtg ttg ggt ata tgt tat ggg 349Glu Tyr 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权利要求
1.包含植物GMP合成酶编码区的一段DNA序列，在这段DNA序列中具有如SEQ-ID NO1或SEQ-ID NO3所示的核苷酸序列。
2.一段DNA序列，它可以与如权利要求1所述的SEQ-ID NO1或SEQ-ID NO3所示的DNA序列进行杂交，或者这些序列的一部分，或者从这些序列经插入、删除或取代作用衍生得到的衍生体，并且它编码具有GMP合成酶生物活性的蛋白质。
3.具有GMP合成酶活性的蛋白质，它包含的氨基酸序列代表SEQ-IDNO2或4所示序列中至少100个氨基酸的一部分。
4.如权利要求3所述的蛋白质，它包含的氨基酸序列是SEQ-ID NO2或4中50-300的部分序列。
5.如权利要求4所述的蛋白质，它包含的氨基酸序列是如SEQ-IDNO2或4所描述的序列。
6.利用如权利要求1或2所述的一段DNA序列引导进入原核或真核细胞，这个序列可选择性的与确保细胞中转录和翻译发生的控制元件相连接，导致可转录mRNA的表达，并引发植物GMP合成酶的合成。
7.利用如权利要求1或2所述的一段DNA序列以产生一个测试系统，用于鉴定具有除草剂作用的植物GMP合成酶抑制剂。
8.用于寻找抑制植物GMP合成酶活力的一种方法，它包括第一步利用如权利要求1或2所述的一段DNA序列制备GMP合成酶，第二步在测试物质存在的条件下测定植物GMP合成酶的酶活力。
9.如权利要求8所述的一种方法，其中植物GMP合成酶的测定是以在高量筛选方式(HTS)进行的。
10.用于鉴定具有除草作用的物质的方法，此类物质抑制植物GMP合成酶活性，方法包括a)制备转基因植物，植物组织或植物细胞，它们包含一段编码具有GMP合成酶活性的附加DNA序列，并且能够表达具有酶活性的GMP合成酶；b)将一种物质施用于转基因的植物，植物细胞，植物组织或植物部分，以及未转化的植物，植物细胞，植物组织或植物部分；c)测定施用化学物质后转基因的和未转化的植物，植物细胞，植物组织或植物部分的生长和成活率；以及d)比较施用化学物质后转基因的和未转化的植物，植物细胞，植物组织或植物部分的生长和成活率；未转化的植物，植物细胞，植物组织或植物部分的生长和成活率受抑制，而转基因的植物，植物细胞，植物组织或植物部分的生长和成活率没有受到抑制，这说明了b)中的物质表现出除草的活性，抑制了植物GMP合成酶的活性。
11.一个测试系统，它是建立在表达如权利要求1或2所述的SEQ-IDNO1或SEQ-ID NO3所示的一段DNA序列基础上，用于鉴定具有除草剂作用的植物GMP合成酶抑制剂。
12.如权利要求11所述的用于鉴定具有除草剂作用的植物GMP合成酶抑制剂的一个测试系统，其中将酶与要被检测的实验底物一起培育，适当反应时间之后，通过与未受抑制的酶的酶活力进行比较，测定此酶的酶活力。
13.一种植物GMP合成酶抑制剂。
14.利用如权利要求11或12所述的测试系统鉴定的一种植物GMP合成酶抑制剂。
15.如权利要求13或14所述的抑制剂用作除草剂。
16.一种用于清除有害植物生长的方法，包括利用一种化合物处理需要被清除的植物，此化合物能够特异性的与由如权利要求1或2所述的一段DNA序列编码的GMP合成酶结合，并且抑制GMP合成酶的功能。
全文摘要
本发明涉及编码具有GMP合成酶(EC6.3.5.2)活性多肽的DNA。本发明还涉及利用此核苷酸产生一个测试系统。
文档编号G01N33/50GK1390261SQ00813718
公开日2003年1月8日 申请日期2000年9月21日 优先权日1999年10月1日
发明者J·莱尔希尔, T·埃尔哈德特, U·苏恩瓦德, R·博尔迪特 申请人:巴斯福股份公司