专利名称：基因工程乙肝预防、治疗疫苗中前s的制作方法
基因工程乙肝预防、治疗疫苗中前S1抗原和前S2抗原含量测定的方法。
乙型肝炎病毒(HBV)是引起人类肝脏疾病的主要病毒不仅可以引起急、慢性病毒肝炎，而且还与肝硬化和肝癌的发生发展有密切关系。乙型病毒性肝炎是一种世界性的传染性疾病。
完整的乙型肝炎病毒颗粒，即Dane氏颗粒，直径为42nm。由外膜和核衣壳组成，后者含有一个环状的部分双链DNA分子，DNA多聚酶，DNA结合蛋白及蛋白激酶等。外膜(S基因区)是由表面抗原(HBsAg)组成的病毒包膜。S基因区为乙型肝炎病毒DNA一个重要的开放读码框架。S基因区又可分成三段，从上游开始依次为前S1(pre-S1)区，前S2(pre-S2)区和S区。乙肝病毒表面抗原的主要组成部分是S基因编码的蛋白质成份叫小蛋白，前S2蛋白和S蛋白共同组成的蛋白质，分子量居中，称为中蛋白，由前S1、前S2及S基因三部分基因共同编码组成的蛋白质，是S基因中分子量最大的一种，因此称为大蛋白。
目前在国际上对乙型肝炎病毒的检测上应用的方法很多。如反向血球凝集试验(RPHA)、放射免疫分析法(RIA)测定HBsAg含量的结果只能是稀释倍数读不到具体含量。
酶联免疫吸附试验(ELISA)方法是目前检测乙型肝炎病毒抗原灵敏度最高的方法。但在检测前S1蛋白和前S2蛋白时只是定性试验。在前S1蛋白和前S2蛋白的具体定量上没有检测方法。
本发明是应用定性用的检测乙型肝炎病毒前S1、前S2的ELISA试剂盒和HBsAg的ELISA试剂盒测定基因工程乙型肝炎疫苗中的前S1抗原和前S2抗原的含量。
基因工程乙肝预防、治疗疫苗中前S1抗原和前S2抗原含量测定的方法A、用已知含量的乙肝表面抗原(HBsAg)做标准对照；B、前S1抗体、前S2抗体和S抗体用免疫学方法定量；结果分析测得结果分别与标准已知量的HBsAg相对比，计算相应的数值，此数值做为基因工程乙肝疫苗中前S1抗原和前S2抗原的相对含量数值。这种方法可代替用Lowry法测定无法区分基因工程乙肝疫苗中前S1蛋白和前S2蛋白含量的不足。
实施例1利用此方法可以测定基因工程乙肝疫苗中不同蛋白成份的鉴别及各种蛋白成份的相对定量分析。用定性的乙型肝炎病毒前S1、前S2和HBsAg的ELISA试剂盒测定基因工程乙型肝炎疫苗中的前S1抗原和前S2抗原含量的方法，是用已知含量的HBsAg作为标准对照。
实施例2取200ul稀释后的已知量的HBsAg和稀释后的待检样品分别加到酶标板上不同的反应孔内(待检样品必须经过用Lowry法测定蛋白含量，与标准已知量的HBsAg做倍比稀释到一定蛋白浓度)，然后将包被的酶标板置4℃过夜，次日从4℃取出酶标板将包被液弃掉用磷酸盐缓冲(PBS)加1％吐温20洗板每孔至少3次，加3％小牛血清白蛋白200ul/孔37℃2小时，弃掉小牛血清白蛋白，用PBS加1％吐温20洗板每孔至少洗3次，再分别加入相应抗前S1、抗前S2、抗S酶标抗体37℃1小时，倒掉酶标抗体，用PBS加1％吐温20洗板，每孔至少洗3次，弃掉洗液以后，加入酶底物液A和B混合后生也加入50ul放置37℃15分钟，加终止液每也20ul，用酶标仪OD450nm测定酶标板的各个孔样品。
实施例3根据此方法的免疫学原理也可以将酶联免疫吸附试验改变为班点杂交法。
取标准的已知HBsAg抗原按倍比稀释后点在硝酸纤维素膜上，待自然干燥；取待测的样品含前S1抗原、前S2抗原也按倍比稀释的方法稀释后分别点在另外的膜上，待样品自然干燥以后，浸泡于3％小牛血清白蛋白中37℃2小时，弃掉浸泡液体，用PBS加1％吐温20洗液洗膜3次，加相对应的抗体(点已知含量的HBsAg膜加抗HBsAg抗体，待检样品的膜分别加所要检的目的蛋白相应抗体)浸泡37℃1小时，弃掉含抗体的浸泡液，用PBS加1％吐温20洗液洗膜3次，加抗相应抗体酶标抗体浸泡37℃1小时，弃掉浸泡液用PBS加1％吐温20液洗膜3次，加相应的酶底物显色，根据班点来计算待测蛋白含量。
实施例4此方法也可以用于以后开发的丙型肝炎病毒(HCV)疫苗的不同组分的鉴别和定量分析。可以首先提取丙型肝炎病毒蛋白的各个组分，如丙型肝炎病毒的核壳体蛋白HCV的NS2区的疏水蛋白，HCV的NS3区蛋白，NS5区的蛋白。免疫动物得到相应的抗体以后做成酶标试剂。用以HCV的各种组分和鉴别及定量分析。
权利要求
1.基因工程乙肝预防、治疗疫苗中前S1抗原和前S2抗原含量测定的方法A、用已知含量的乙肝表面抗原(HBsAg)做标准对照；B、前S1抗体、前S2抗体和S抗体用免疫学方法定量；
2.根据权利要求1所述的前S1抗原和前S2抗原含量测定的方法，用定性的乙型肝炎病毒前S1、前S2和HBsAg的ELISA试剂盒测定基因工程乙型肝炎疫苗中的前S1抗原和前S2抗原含量的方法，是用已知含量的HBsAg作为标准对照。
3.根据权利要求1或2所述的前S1抗原和前S2抗原含量测定的方法，取200ul稀释后的已知量的HBsAg和稀释后的待检样品分别加到酶标板上不同的反应孔内(待检样品必须经过用Lowry法测定蛋白含量，与标准已知量的HBsAg做倍比稀释到一定蛋白浓度)，然后将包被的酶标板置4℃过夜，次日从4℃取出酶标板将包被液弃掉用磷酸盐缓冲(PBS)加1％吐温20洗板每孔至少3次，加3％小牛血清白蛋白200ul/孔37℃2小时，弃掉小牛血清白蛋白，用PBS加1％吐温20洗板每孔至少洗3次，再分别加入相应抗前S1、抗前S2、抗S酶标抗体37℃1小时，倒掉酶标抗体，用PBS加1％吐温20洗板，每孔至少洗3次，弃掉洗液以后，加入酶底物液A和B混合后生也加入50ul放置37℃15分钟，加终止液每也20ul，用酶标仪OD450nm测定酶标板的各个孔样品。
4.根据权利要求1所述的前S1抗原和前S2抗原含量测定的方法，取标准的已知HBsAg抗原按倍比稀释后点在硝酸纤维素膜上，待自然干燥，取待测的样品含前S1抗原、前S2抗原也按倍比稀释的方法稀释后分别点在另外的膜上，待样品自然干燥以后，浸泡于3％小牛血清白蛋白中37℃2小时，弃掉浸泡液体，用PBS加1％吐温20洗液洗膜5次，加相对应的抗体(点已知含量的HBsAg膜加抗HBsAg抗体，待检样品的膜分别加所要检的目的蛋白相应抗体)浸泡37℃1小时，弃掉含抗体的浸泡液，用PBS加1％吐温20洗液洗膜3次，加抗相应抗体酶标抗体浸泡37℃1小时，弃掉浸泡液用PBS加1％吐温20液洗膜3次，加相应的酶底物显色，根据班点来计算待测蛋白含量。
全文摘要
本发明创造的目的是提供一种基因工程乙肝预防、治疗疫苗中前S
文档编号G01N33/576GK1310341SQ01103989
公开日2001年8月29日 申请日期2001年2月20日 优先权日2001年2月20日
发明者刘柱, 王成余 申请人:辽宁天成生物制药研究所