G蛋白(rgs4)结构以及使用所述结构鉴定激动剂和拮抗剂的方法

专利名称：G蛋白(rgs4)结构以及使用所述结构鉴定激动剂和拮抗剂的方法
背景技术：
各种各样的生物化学过程、尤其是涉及蛋白质-蛋白质相互作用的生物化学过程被认为是由蛋白质靶中的诱导构象变化介导的。于是，蛋白质中所产生的结构改变可用来解释生物系统中其功能(例如酶活性)或其对另一蛋白质亲和性的改变。已经提出在真核细胞中在与某些信号转导途径相关步骤的级联中发生构象变化。这类信号转导途径的遍在组分是与细胞表面受体偶联的异源三聚体鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(G蛋白)(有关综述参见参考文献1-4和72)。G蛋白转发由包括光子、气味和多种激素和神经递质在内的各种刺激产生的信号。G蛋白活性的缺陷可引起各种各样的疾病。G蛋白以α、β和γ亚基的异源三聚复合体形态存在。α-亚基(Gα)与其中β-亚基与γ-亚基紧密结合的二聚体(Gβγ)弱结合。Gα也与七螺旋跨膜受体的胞内羧基末端尾缔合。G蛋白传递来自1000多种、具有不同Gα亚型的受体的信号，从而调节各种不同的下游信号途径。鸟嘌呤核苷酸结合和GTP酶在Gα结构域中起作用，以调节G蛋白活性。
G蛋白信号过程通常由激动剂与细胞表面受体的结合起始，导致G蛋白中的诱导构象变化。G蛋白的结构改变影响Gα的鸟嘌呤核苷酸亲和性，使其优先结合GTP和Mg2+，而不是优先结合GDP。已经用Giα1在GTP酶循环的不同阶段的多种X射线结构来鉴定诱导结构变化的区域(5-8)。具体地说，Gα鸟嘌呤核苷酸结合部位由三个不同的“转换”区构成转换I的残基V179-V185，转换II的残基Q204-H213和转换III的残基A235-N237，它们在GTP水解时都经历构象变化。结合Gβγ二聚体的Gα表面含有转换I区和转换II区。在活性Gα-GTP-Mg2+复合体中，转换I中的构象变化与结合Mg2+相关，而转换II区和转换III区由于这两个转换区之间的离子相互作用变得非常有序。由于Gα-GTP-Mg2+复合体的形成，因此这三个“转换”区结构的修饰促进Gα与Gβγ解离。于是，所释放的亚基可与各种各样的靶蛋白相互作用，诱发所需应答。当所述过程由于与Gα结合的GTP的水解而逆转时导致所述信号终止。Gα与Gβγ的重新缔合导致G蛋白失活。因此，G蛋白信号的持续时间直接取决于Gα蛋白的GTP酶活性。
G蛋白信号的调节剂(RGS)通过与活性Gα-GTP-Mg2+复合体结合并诱导GTP水解速率增加50倍而影响G蛋白信号级联的强度和持续时间(有关综述参见参考文献9-13)。相反，RGS蛋白对无活性Gα-GDP复合体几乎没有亲和性或没有亲和性。因而，RGS蛋白通过提高G蛋白的失活和信号终止的速率而作为诱导的G蛋白信号的弱化子起作用。RGS蛋白可以表现出另外的生物学功能，例如据报道RGS4通过效应子阻断GTP-Gα的活化(83)。其中包括RGS4、GAIP(人Gα相互作用蛋白)、RGS1、RGS10和RGS16的RGS家族，包括20多个已知成员，其中对Gα亚型的特异性已得到证实并且看来与微小序列差异有关(8，14)。然而，RGS家族包含显著的结构多样性，所有RGS蛋白的特征为可以被不同长度的连接区分开的约130个氨基酸的保守结构域。最近，已报道RGS家族包括命名为A-F、具有独特结构特征的至少6个不同的亚家族(Zheng，B.等(1999))(86)。RGS4表现出RGS亚家族A的结构特征。亚家族特异性结构特征可能与亚家族特异性功能有关，例如RGS蛋白中的Gα结合特异性、RGS蛋白的膜缔合或除GAP活性以外RGS蛋白表现出的功能方面的差异。据认为RGS4通过稳定所述转换有效弱化诱导的G蛋白。
RGS蛋白在包括人类细胞在内的真核细胞中广泛表达(13)。每种人类器官的组织中存在至少一种RGS蛋白，许多组织表达多种RGS蛋白。另外，RGS家族成员在人脑中特异性表达，其中RGS4也许是分布最为广泛的且高度表达的RGS亚型(15，16)。RGS表达已与诱发的癫痫发作相关联，这表明RGS表达的调节是大脑信号转导途径中的适应性应答，从而代偿G蛋白偶联受体功能的脱敏和致敏(16)。除调节对神经递质的应答外，RGS活性也与各种各样的包括以下的细胞功能相关细胞增殖、细胞分化、膜运输和胚胎发育(9，10，12，17)。
与Giα1结合的RGS4的X射线结构[8]、定点诱变[18-20]和生物化学研究[17，21]提示，RGS4优先与Gα-GTP-Mg2+复合体结合且稳定所述转换区的过渡态结构，从而促进GTP水解。由于RGS4与Giα1结合的功能结果是通过Giα1诱导GTP水解，合理的预期是在与RGS4形成复合体时构象变化主要发生在Giα1中。然而，在RGS4-Giα1复合体中Giα1的X射线晶体结构与在Giα1-AIΦ4中Giα1的X射线晶体结构的差异显示仅为0.6 rms，这在所提出的GTP水解的过渡态范围内。这种比较表明在Giα1中没有显著的构象变化。另一方面，RGS4-Giα1复合体X射线结构的分析表明，RGS4与Giα1结合，诱导Giα1转换区能动性(mobility)降低。在这些区域中，RGS4的N82(采用

图1中的编号)与Giα1的转换区I和II之间以及Giα1的T182与RGS4上的Gα结合口袋之间发生关键性的相互作用。已鉴定RGS4残基N82对于促进内在Giα1 GTP酶活性是关键的，推定是通过稳定所述转换区和底物结合(19，20)。在Gα-GTP-Mg2+复合体和Gα-GDP复合体之间观测到所述转换区中的相似变化(2)，提示RGS4中的构象变化可能归因于G蛋白信号的调节。
de Alba，E.等(1999)(87)报道了用NMR技术测定的人GAIP的溶液结构。结构计算使用在两种不同液晶介质中定向蛋白质的偶极耦合。将GAIP溶液结构与大鼠RGS4-Giα1X射线结构进行比较(8)。所述参考文献提出，GAIP-L187参与Gα-RGS结合，并且在RGS蛋白的折叠和稳定性方面也可能是重要的。也提出GAIP-S156在GAIP稳定性方面起作用。GAIP-S156已被鉴定为RGS亚家族A[GAIP，Ret-RGS1，RGS21]的亚家族特异性残基(86)和Wang等(89)。在包括RGS4的RGS亚家族B中，对应于GAIP S156的核心氨基酸是RGS N82(依照图1中的编号)和N128(依照Tesmer等的编号(8))。据报道GAIP的核心区与RGS4的核心仅有60％序列同一性。这两种结构之间观测到的任何差异至少部分是由于氨基酸序列的差异所致。
因此，最好是提供游离RGS4的结构信息，以便更好地理解G蛋白信号的调节机制。更具体地讲，这种结构信息使得可以在RGS4的溶液结构和RGS4-Gα复合体的X射线结构之间进行直接比较，以确定在与Gα结合时在RGS蛋白中发生哪些构象变化。可以用所述结构信息和比较来鉴定通定与RGS蛋白或其具有Gα的复合体相互作用影响G蛋白信号的因子(化学种类或生化种类(chemical or biochemicalspecies))。所述结构信息可能在游离RGS和RGS/Gα复合体活性的激动剂和拮抗剂的鉴定和合理设计方面具有特殊的用途。
发明概述本发明提供通过NMR(核磁共振)波谱法测定的游离(即未复合的)RGS亚家族B蛋白、尤其是游离RGS4的三维溶液结构。具体地说，本发明提供RGS亚家族B蛋白Gα结合部位的三维溶液结构。RGS亚家族BGα结合部位以包含RGS4蛋白残基D117、S118和R121的RGS4Giα1结合部位的三维结构为例。本发明也提供游离RGS亚类Bα6-α7区(该区在RGS与Gα结合时显示显著的构象变化)的三维结构。在RGS蛋白α6-α7区结合，可以实现G蛋白信号中RGS蛋白的功能。此外，本发明鉴定并且提供RGS蛋白中变构结合部位的三维结构。在该变构部位结合可以影响G蛋白信号的调节。RGS蛋白中的变构结合部位以位于游离RGS4α1和α2螺旋区和这两个螺旋区之间的紧密转角中的RGS4的变构结合部位为例。更具体地讲，RGS4中的变构结合部位包含残基V10、W13、L17、120、H23、E24、C25和T132。
通过NMR波谱法获得、在表2中给出的相对原子结构坐标，提供了游离RGS4在溶液中的三维结构，包括Gα结合部位、游离RGS4的C末端α6-α7区和游离RGS4的变构结合部位的三维结构。也提供了游离RGS4的15N、13C、13CO和1H NMR指认(assignment)(表1)，进而可用来确定其二维结构和三维结构。这些指认也可用于鉴定或检测与RGS结合并且可以影响RGS功能或RGS-Gα功能的化学和生化种类的方法中，尤其可用来鉴定或检测与RGS亚类B结合、以影响其功能或RGS亚家族B-Gα功能的种类。
本发明还提供游离RGS亚家族B蛋白的全部或部分三维结构的表示或模型，包括体现游离RGS4蛋白的三维结构的相对原子结构坐标数据集。本发明也提供体现在RGS亚家族B蛋白中Gα结合部位的三维结构的相对原子结构坐标数据集。本发明还提供体现RGS亚家族蛋白α6-α7区的相对原子结构坐标数据集。另外，本发明提供体现RGS亚家族B蛋白中变构结合部位的相对原子结构坐标数据集。采用本文中提供的数据集构建或产生的RGS亚家族B中游离RGS亚家族B、其Gα结合部位、其α6-α7区或变构结合部位的所述数据集和任何结构表示或模型，可以用来鉴定、选择或合理设计影响RGS功能或活性或者RGS/Gα复合体活性或功能的例如化学或生化种类的各种因子。此外，也可用Gα结合部位的所述数据集、结构表示或模型来鉴定、选择或合理设计通过与Gα结合影响Gα功能的种类。本发明提供的数据集和结构表示和模型尤其可用来鉴定RGS功能或RGS/Gα复合体功能或活性的激动剂或拮抗剂。
本文中提供的数据集、包括体现Gα结合部位、α6-α7区和变构结合部位的数据子集是通过NMR分析确定的。然而，可以使用任何已知方法提供所述结构数据。在一个实施方案中，所述数据集体现游离RGS4在溶液中的结构结构。在某些实施方案中，所述数据集包含游离RGS4结构的一个或多个部分。尤其感兴趣的是在G蛋白信号的RSG调节中起作用的RSG4结构中的那些部分，或者更准确地说是影响RGS与Gα的结合或影响RGS-Gα复合体的生物功能或活性的RSG4结构中的那些部分。另外，感兴趣的是候选RSG激动剂和拮抗剂所结合且影响其生物功能的RSG4结构中的那些部分。
任何可利用的方法可以用来从本文中公开的NMR导出数据或从游离RGS4的独立结构分析获得的数据构建结构表示或模型。这样的模型或表示可以用诸如以下的软件包从可利用的分析数据点而产生或构建HKL、CHARMM、MOSFILM、XDS、CCP4、SHARP、PHASES、HEAVY、XPLOR、TNT、NMRCOMPASS、NMRPIPE、DIANA、NMRDRAW、FELIX、VNMR、MADIGRAS、QUANTA、BUSTER、SOLVE、O、FRODO、XPLOR、RASMOL和CHAIN，所有这些软件包都是众所周知的并且是本领域技术人员可得到的。结构表示或模型可以运用包括诸如以下的可利用系统从这些数据来产生SiliconGraphics、Evans and Sutherland、SUN、Hewlett Packard、AppleMacintosh、DEC、IBM和Compaq系统。所述结构表示或模型可以以本领域已知的任何二维或三维形式来展示或产生，以供显示、分析、建模或以其它形式表示所述结构。所述结构表示可以以任何已知的图形、数字或模拟形式传输、传送或存储。可以将本文中提供的用RGS数据产生的结构表示或模型与其它化学和生化种类(例如候选拮抗剂或激动剂)的结构表示包括RGS-复合体的X射线数据综合考虑，以便分析RGS、尤其是RGS亚家族B蛋白和Gα和所述种类之间的潜在相互作用。如本文所述，也可以将本文中提供的数据与RGS-复合体、尤其是RGS亚类B蛋白-复合体和尤其是被认为是生物功能复合体或被认为对生物功能复合体建模的那些复合体的结构信息(包括X射线数据)综合考虑。
本发明涉及任何形式(例如数字形式、列表形式、图形形式或图像形式或者体现为任何表示或模型或或体现为计算机存储介质)的游离RGS4、RGS4的Gα结合部位、RGS4中的α6-α7区(其构象在RGS4与Gα结合时改变)和变构结合部位的结构数据，以及所述数据(无论何种形式)在以下方面的应用用来产生游离RGS、尤其是RGS亚家族B蛋白、更尤其是RGS4的结构表示或模型，或者RGS、RGS亚家族B蛋白和RGS4与任何其它化学或生化种类相互作用的结构表示或模型，包括RGS与G蛋白亚基相互作用以及RGS与RGS功能的潜在激动剂或拮抗剂相互作用的结构表示或模型。
本发明也提供包括本发明结构表示或模型以及用来构建、处理和/或显示本发明模型的硬件的计算机系统。本文中提供的RGS4或其部分的溶液结构坐标可以存储在合适的介质中或其上，供装入任何计算机程序或系统或与其一起使用，用以产生RGS蛋白、RGS亚类B蛋白或RGS4的结构表示或模型，或者用以分析RGS与其它化学或生化种类的相互作用。
所述结构坐标可以以机器可读形式存储在机器可读存储介质上，例如计算机硬盘驱动器、磁盘、DAT磁带等，以供显示为三维形状或用于涉及结构坐标或所述结构坐标所限定的三维结构的计算机辅助操纵或基于所述结构坐标或所述三维结构的计算的其它用途。作为实例，确定本发明RGS4三维或本文中公开的RGS4一部分的三维结构的数据，可以存储在机器可读存储介质中，通常可以使用能够从所述存储介质读出所述数据并且用多种用以从这种数据创建所述表示的指令编程的计算机，来显示出关联结构坐标的三维图形表示。
因此，本发明提供在存储器上已编程且带有RGS4或RGS亚家族B蛋白或其部分的坐标(作为实例，例如RSG4 Gα结合部位、RGS4α6-α7区或RGS4α1-α2区中的变构结合部位的坐标)、以及能够在与机器例如计算机连接的显示器上将所述坐标转换成结构坐标的三维图形表示的程序的所述机器。具有容纳这种数据的存储器的机器有助于合理设计或选择RGS、Gα或RGS-Gα复合体活性的抑制剂或激活剂，包括评价具体化学或生化种类与RGS、尤其是RGS亚类B蛋白有效缔合的能力，以及有助于对由于与RGS4或其它RGS蛋白有显著结构或序列同源性而相关的化合物、蛋白质、复合体等建模。
另外，本发明还涉及测定未知结构的化合物例如蛋白质或肽或其它化学或生化种类(包括RGS蛋白或其部分、或者更准确地讲是RGS4以外的RGS亚家族B蛋白或其部分)的三维溶液结构的方法，所述方法包括下述步骤首先获得未知结构的蛋白质或肽的溶液，然后从所述溶液产生NMR数据。然后可以采用标准技术，例如2D、3D和4D同位素过滤、修正(editing)和三重(triple resonance)共振NMR技术、计算机同源性建模以及采用适用于NMR数据的分子置换技术的修改技术，将所述蛋白质或肽的NMR数据与本文公开的RGS4(或其部分，例如Gα结合部位)的已知三维结构进行比较，并且使未知结构的蛋白质或肽的三维结构符合已知的RGS4结构。或者，运用RGS4的已知三维结构和与RGS4进行序列比对，可以通过基于任何或所有氨基酸序列同一性、二级结构元件或三级折叠的RGS4和所述蛋白质或肽之间的初步序列比对，然后通过计算机建模产生所述分子的三维结构，可以产生未知结构、但因与RGS4有序列相似性而相关的蛋白质或肽的三维模型。
也提供了鉴定为RGS活性、RGS与Gα结合、Gα与RGS结合或RGS/Gα复合体活性、尤其是RGS亚家族B蛋白的激动剂或拮抗剂的种类的方法。所述方法包括下述步骤使用根据RGS4-核心蛋白编码氨基酸的相对结构坐标确定的游离RGS亚家族B蛋白或其部分(例如RGS4核心蛋白)的三维结构，设计或选择潜在激动剂或拮抗剂，且合成或用其它方法获得所述潜在激动剂或拮抗剂。所述潜在激动剂或拮抗剂可以通过筛选合适的数据库来选择，可以通过分析RGS4 Gα结合部位、RGS4的α6-α7区或RGS4的变构结合部位的立体构型和电荷势能并结合合适的软件程序从头进行设计，或者可以使用RGS4、RGS亚家族B或其它RGS蛋白的已知激动剂或拮抗剂的特征来设计，以便产生“杂种”激动剂或拮抗剂。本发明的方法最好用来设计或选择RGS亚家族B蛋白或RGS亚类B-Gα复合体活性、尤其是RGS4或RGS4-Giα1复合体活性的抑制剂。在一个具体的实施方案中，通过研究候选种类与RGS4(或其部分)的三维模型或者另一RGS亚家族B蛋白(或其模型)的三维模型的相互作用，并且选择根据其与RGS蛋白或RGS蛋白一部分相互作用而预测作为激动剂或拮抗剂的种类，对所述潜在激动剂或拮抗剂进行鉴定、选择或设计。采用本文中公开的方法或本领域已知的各种方法可以容易地测试潜在拮抗剂和激动剂，以证实其拮抗剂或激动剂功能。也提供按照这类方法鉴定的种类。
其它具体的实施方案提供(1)一种抑制RGS4活性、RGS4与Giα1结合、Giα1与RGS4结合或RGS4/Giα1复合体活性的物质的鉴定方法，所述方法包括测定候选物和全部或部分游离RGS4结构的模型之间的相互作用，或(2)一种模拟或促进RGS4活性、RGS4与Giα1结合、Giα1与RGS4结合或RGS4/Gα复合体活性的物质的鉴定方法，所述方法包括测定候选物和全部或部分游离RGS4结构模型之间的相互作用，上两种方法均通过分析游离RGS4的立体构型和电荷势能并且将这些特性与候选物的特性进行比较。也提供按照这类方法鉴定的物质。
其它实施方案提供一种通过合理药物设计鉴定RGS活性、RGS与Gα结合、Gα与RGS结合或RGS/Gα复合体活性的拮抗剂或激动剂的方法，所述方法包括(a)基于游离RGS4的结构坐标，设计将会与RGS Gα结合部位中的一个或多个氨基酸形成可逆或不可逆复合物的潜在拮抗剂或激动剂；(b)合成或用其它方法获得所述拮抗剂或激动剂；和(c)测定所述潜在拮抗剂或激动剂是否抑制或促进RGS的活性或结合或者RGS-Gα复合体的活性。在其它优选实施方案中，设计所述拮抗剂或激动剂，使其与RGS4-Giα1结合部位中的一个或多个氨基酸的一个或多个原子相互作用。更具体地讲，设计所述拮抗剂或激动剂，使其与选自RGS4的D117、S118或R121的氨基酸、与Gα结合部位缔合的其它氨基酸和与通过所测定结构揭示的其它氨基酸相互作用。再更具体地讲，设计所述拮抗剂或激动剂，使其与选自RGS4的S39、E41、N42、L113、D117、S118、R121或N82的氨基酸相互作用。也提供按照这类方法鉴定的物质。所述激动剂或拮抗剂可以与RGS蛋白形成共价键或非共价键。该方法尤其适用于鉴定RGS亚家族B蛋白的拮抗剂或激动剂。
其它具体的实施方案提供一种通过合理药物设计鉴定RGS活性或RGS/Gα复合体活性的拮抗剂或激动剂的方法，所述方法包括(a)基于游离RGS的结构坐标，设计一种将与RGSα6-α7区中的一个或多个氨基酸形成可逆或不可逆复合物的潜在拮抗剂或激动剂；(b)合成所述拮抗剂或激动剂；和(c)测定所述潜在拮抗剂或激动剂是否抑制或促进RGS或RGS/Gα复合体的活性。在优选的实施方案中，设计所述拮抗剂或激动剂使其防止或促进与Gα结合时在这些区中的构象变化。该方法尤其适用于鉴定RGS亚家族B蛋白活性或RGS亚家族B/Gα复合体活性的拮抗剂或激动剂。
其它具体的实施方案提供一种通过合理药物设计鉴定RGS活性或RGS/Gα复合体活性的拮抗剂或激动剂的方法，所述方法包括(a)基于游离RGS4的结构坐标，设计一种将会与RGS4变构结合部位中的一个或多个氨基酸形成可逆或不可逆复合物的潜在拮抗剂或激动剂；(b)合成所述拮抗剂或激动剂；和(c)测定所述潜在拮抗剂或激动剂是否抑制或促进RGS或RGS/Gα复合体的活性。在优选的实施方案中，设计所述拮抗剂或激动剂使其与RGS4α1-α2区中的变构结合部位相互作用。在其它优选的实施方案中，设计所述拮抗剂或激动剂使其与RGS4α1和a2区的变构结合部位中的一个或多个氨基酸的一个或多个原子、尤其是与RGS4的氨基酸V10、W13、L17、L20、H23、E24、C25或T132的一个或多个原子相互作用。也提供按照这类方法鉴定的物质。该方法尤其适用于鉴定RGS亚类B蛋白活性或RGS亚类B/Gα复合体活性的拮抗剂或激动剂。
RGS、RGS-Gα复合体的候选激动剂和拮抗剂可以从任何来源获得的天然或非天然来源的任何类型的小分子、二聚体、多聚体、寡聚体或聚合物中选择，可以从天然来源分离，或者化学或生物合成。候选拮抗剂和激动剂可以包括核酸、肽、多肽、蛋白质和各种小有机分子。
运用可利用的软件平台，包括QUANTA、RASMOL、O、CHAIN、FRODO、INSIGHT、DOCK、MCSS/HOOK、CHARMM、LEAPFROG、CAVEAT(UC Berkley)、CAVEAT(MSI)、MODELLER、CATALYST和ISIS，可以研究所述候选种类与RGS三维结构和/或该结构部分的相互作用。
本发明也提供鉴定RGS4中的变构结合部位存在并且测定其位置的方法。所述方法包括下述步骤使溶液中的游离RGS4-核心与作为化学种类文库成员的试验化合物接触，所述化学种类文库包括各种各样的结构特征或者已知其抑制RGS功能；在所述文库的试验化合物存在下，测定RGS4-核心的1H、15N和/或13C NMR谱，以检测试验化合物与RGS4-核心结合所诱导的RGS4-核心的化学位移中的任何微扰，并且测定所述试验化合物的结合是否影响RGS活性。例如通过评价所述试验化合物对RGS诱导的Gα GTP酶活性的影响，可以完成这一点。受试验化合物结合影响的RGS4-核心的氨基酸残基被定为该试验化合物的结合部位。如果发现试验化合物影响RGS4-核心的活性并且所述试验化合物在RGS4-核心中结合的位置不是Gα结合部位，则所述试验化合物结合的位置就是变构结合部位。采用这种方法已经鉴定出RGS4-核心的α1-α2区中这样的一个变构结合部位。
然后在本文所述方法中可以使用通过这种方法鉴定的任何变构结合部位的三维结构，来鉴定、选择和设计RGS活性、尤其是RGS亚类B活性的候选激动剂和拮抗剂。用以评价RGS变构部位存在的试验化合物可以是显示各种各样结构特征的文库成员(例如呈现各种取代基(例如OH、-CO-、-NHCO-等)的脂环、杂环、芳族环、脂族、脂环化合物或芳香化合物)。也可以在对于已知表现出影响RGS活性(例如增强或减低RGS4诱导的Gα GTP酶速率)的化合物，试验化合物也可以用多种筛选进行选择。可以通过评价含有种类繁多的试验化合物的混合物对RGS活性的影响进行初步筛选。在用试验化合物的混合物观测到影响的情况下，可以对单个化合物独立地进行再次测试，以确定哪种(些)试验化合物影响RGS活性。
在一个具体的实施方案中，本发明提供这样一种方法在所述方法中使用游离RGS4-核心的三维结构鉴定能够与RGS蛋白结合的化学或生化种类或它们的片段。一旦鉴定出能够与RGS结合的种类或其片段，则(采用众所周知的计算机建模技术)将其装配成单个分子，以提供潜在拮抗剂或激动剂的结构。所装配的分子可以含有另外的种类或片段(例如主链)，以便使能够与RGS结合的种类或片段以所需方向取向。该方法尤其适用于RGS亚家族B蛋白。
本发明还提供RGS4蛋白突变体的鉴定方法，其中突变蛋白的活性与RGS4不同。在该方法中，使用游离RGS4的三维结构鉴定参与G蛋白信号调节的氨基酸。然后对所鉴定的一个或多个氨基酸残基进行修饰，以产生突变型RGS4。预期在该方法中鉴定的突变体表现出G蛋白信号调节功能改变。
本发明的其它目的根据下文的详细描述将会更加显而易见的。
附图简述图1说明RGS4的二级结构。该图提供涉及NH、Hα和Hβ质子的序贯和中等范围NOE、酰胺交换和3JHNα合常数数据以及观测到的RGS4的13Cα和13Cβ二级化学位移和从该数据推导出的二级结构的总结。谱线的宽度反映NOE的强度。在与D2O交换后仍存的酰胺质子用实心圆表示。空心框代表由于共振重叠遮蔽而不能明确指认的潜在序贯指认NOE。与Hα(i)-NH(i+1)NOE相同线上的灰框代表残基i的Hα质子和i+1脯氨酸的CδH质子之间的序贯NOE，并且为反式脯氨酸的特征。显示了7个α螺旋区(α1-α7)。
图2A和图2B均是带状图，(A)来自RGS4-Giα1复合体的RGS4的X射线结构，(B)游离RGS4残基V5-P134的NMR结构。对在RGS4-Giα1X射线结构和游离RGS4 NMR结构之间显示显著结构变化的残基进行编号。残基K116-Y119相当于参与与Giα1相互作用的关键残基，显示了游离形式和复合形式的RGS之间结构改变的位置。显示了二级结构和螺旋堆积(helical packing)中表现出变化的C末端区和N末端区。RGS4-Giα1X射线结构是Tesmer等所述的结构(8)。也显示了二级结构和螺旋堆积中承受变化的C末端区和N末端区。标示了RGS4结构所观测到的螺旋区。
发明详述RGS蛋白是G蛋白信号的调节剂，它们通过与活性Gα-GTP-Mg2复合体结合，从而提高加GTP水解速率，影响G蛋白信号级联的强度和持续时间。RGS蛋白通过提高G蛋白的失活和信号终止的速率而作为诱导G蛋白信号的弱化子起作用。在各种各样的真核生物包括人类中已鉴定出RGS蛋白。RGS蛋白是高度多样的多功能蛋白质，特征为存在大约130个氨基酸残基(有时鉴定为具有120个氨基酸)的核心区，所述核心区可以被不同长度的接头区分开(79，80，9)，并且该核心区在迄今已鉴定出的所有RGS蛋白中是保守的。已鉴定出的所有RGS蛋白都可与Giα类的G蛋白α亚基的成员结合。RGS蛋白家族其中包括RGS4、GAIP(人Gα-相互作用蛋白)、RGS1、RGS10、RGS11、RGS12、RGS13、RGS14和RGS16(也称为RGSr)、Axin、Conductin、p115-RhoGEF、PD2-RhoGEF和LSC(86)，包含20多个已知成员，其中对Gα亚型的特异性已得到证实并且看来与微小序列差异有关(8，14)。据认为RGS4稳定GTP水解的过渡态(17，57，21)。RGS的保守区提供与Gα结合，因此可以用来鉴定作为G蛋白信号弱化子影响(作为激动剂或拮抗剂)RGS与Gα结合和RGS活性的种类。本发明的RGS蛋白通过与G蛋白Gα亚基结合，在G蛋白调节中起作用。RGS蛋白可以但不一定表现出其它生物学功能。参考文献89和91提供了有关RGS蛋白表现出另外的生物学功能的综述。
本文所用的术语“RGS蛋白”，包括本文所用的具体RGS蛋白和RGS蛋白亚家族在内，包括从任何天然来源分离的或用其它方法(例如通过克隆化基因的表达)从中获得的天然RGS蛋白(和天然RGS核心蛋白)、可以含有RGS序列部分和非RGS序列(例如具有六组氨酸脯氨酸标志(hexahis pro-tag)的RGS核心序列)的重组RGS蛋白、含有与天然RGS蛋白不同的保守氨基酸序列或其中缺失RGS活性的非功能性序列的变异RGS蛋白、其中一个或多个氨基酸通过从突变RGS编码序列表达而被修饰的突变RGS蛋白。突变体其中包括与天然RGS蛋白(或RGS-核心)或变异RGS(或变异RGS-核心)相比具有一个或多个定点突变的突变体、具有一个或多个缺失的突变体和具有一个或多个插入的突变体。术语突变型RGS具体是指在所述RGS核心区具有所述突变、插入或缺失的那些蛋白质。预期变异型RGS蛋白的G蛋白调节的生物学功能基本上与其所来源的天然RGS蛋白相同。突变型RGS蛋白包括其生物学功能基本上与从其衍生的天然或变异RGS蛋白相同或由所述天然或变异RGS蛋白修饰的那些RGS蛋白。变异、衍生、重组和突变型RGS蛋白不一定代表彼此无关的蛋白亚组。
如本文所述，RGS核心区涉及G蛋白调节中的RGS功能，本文所用的术语RGS蛋白包括其中不存在非功能区的RGS蛋白，例如天然、重组、变异或突变型RGS蛋白的RGS核心区。已发现天然RGS的RGS核心区保留所有天然RGS的活性(8)。RGS4核心区的长度约为130个氨基酸。(在参考文献中也可能指长度约为120个氨基酸的RGS的保守区或核心区)来自其它RGS蛋白的RGS核心的长度可能与RGS4不同。本发明的RGS蛋白可以通过体外或体内表达RGS编码序列、通过从天然来源分离或本领域已知的任何其它方式获得。
根据对61种哺乳动物和无脊椎动物RGS蛋白的种系发生分析，已知的RGS蛋白可分为6个或7个亚家族(86)。哺乳动物RGS蛋白由如下命名为A-F的至少6个亚家族构成A(GAIP，Ret-RGS1，RGS21)；B(RGS1，RGS2，RGS3，RGS4，RGS5，RGS8，RGS13和RGS16[也称为RGS-r]；C(RGS6，RGS7，RGS9和RGS11)；D(RGS12，RGS14)；E(Axin和Conductin)；和F(P115-RhoGEF，PD2-RhoGEF和Lsc)。两种其它RGS蛋白TGS10和D-AKAP2在结构上与亚家族A-F不同，可能代表一个不同的亚家族。亚家族B、C和D全都具有特征性残基Asn(在RGS4中，依照本文编号为N82或依照Tesmer等编号[8]为N128)，该残基至少在RGS亚家族B蛋白中与Gα结合有关。亚家族A的RGS蛋白在RGS核心中的该位置被丝氨酸取代(GAIP中的S156)。另外，据报道RGS蛋白B亚家族具有另一个特征性残基丝氨酸(在RGS4中，依照本文编号位于位置57，而依照Tesmer等编号[8]为S103)。RGS4代表RGS蛋白B亚家族，并且在结构上更类似于B亚家族的其它成员且被认为具有更类似于B亚家族的其它成员的生物活性和功能，所述B亚家族的其它成员包括RGS1、RGS2、RGS3、RGS5、RGS8、RGS13和RGS16。例如GAIP代表RGS蛋白的A亚家族，并且在结构上更类似于A亚家族的其它成员且被认为具有更类似于A亚家族的其它成员的生物活性和功能，所述A亚家族的其它成员包括Ret-RGS1和RGSZ1。因此，术语RGS亚家族B是指RGS1、RGS2、RGS3、RGS4、RGS5、RGS8、RGS13、RGS16和其它尚未表征的、表现出具B亚家族特征性结构特征的RGS蛋白并且根据Zheng，B.等(1999)(参见上文)所述的种系发生分析而分类为B亚家族的RGS蛋白。同样，术语RGS亚家族A是指GAIP、Ret-RGS1和RGS21以及尚未表征的、表现出A亚家族结构特征和通过所述种系发生分析而分类为RGS亚家族A蛋白的其它RGS蛋白。RGS亚家族C-F的定义以此类推。
术语RGS4是指以大鼠RGS4(Tesmer等(1997)，参见上文)为例说明的RGS4及其同系物，其中包括人RGS4和小鼠RGS4。人、大鼠和小鼠RGS4的RGS核心区相互有2-4个氨基酸不同(代表在130个氨基酸核心中约97％或更高的序列同一性)。GAIP同系物在RGS核心区中可以表现出低至约85％序列同一性。因此，RGS4同系物可以表现出与大鼠RGS4低至约85％的RGS4核心序列同一性。
采用由具有N端甲硫氨酸和C端六组氨酸尾的RGS4保守区组成的RGS4-核心蛋白(尤其是来源于大鼠)，进行此中的RGS蛋白NMR研究和结构测定。假定有保守氨基酸改变的可能性并且在±表2中列举的主链原子相对结构坐标的均方根差范围内，即不超过1.5(或更优选不超过1.0，或最优选不超过0.5)，根据对RGS4-核心蛋白测定的三维溶液结构，对任何真核生物来源的其它RGS4蛋白包括人RGS4的三维溶液结构建模。此外，因为不同RGS蛋白中该结构域相当保守，所以再次认为发生保守氨基酸改变并且在±所述结构主链原子相对结构坐标的均方根差范围内，即不超过1.5(或更优选不超过1.0，或最优选不超过0.5)，根据此中提供的RGS4-核心的三维结构，对所有来源的其它RGS蛋白中的保守区结构建模。
“结构坐标”是对应于与一种分子或分子复合物中的其它原子的原子空间关系的笛卡儿(Cartesian)坐标。结构坐标可以采用本文中所述或本领域已知的NMR或者采用本领域已知的X射线晶体学来获得。或者，结构坐标可以采用分子置换分析或同源性建模来获得。各种软件程序可供用于一组结构坐标的图形表示，以获得分子或分子复合物的三维表示。本发明的结构坐标可以根据表2中提供的原始组通过诸如逆运算或整数加法或减法的数学变换加以修正。因此，认识到本发明的结构坐标是相对的，并且决不具体局限于表2中的实际x、y、z坐标。表2中的结构坐标±与其中的氨基酸(或其保守取代)的保守主链原子不超过1.5(或更优选不超过1.0，或最优选不超过0.5)的均方根差，限定或体现游离RGS4(即不与另一分子复合)的三维溶液结构。RGS4核心保守区含有一个Gα结合部位和一个变构结合部位。可以将多个氨基酸序列插入在RGS核心区的各个螺旋区之间，而不显著改变RGS蛋白的生物学功能。低等真核生物的RGS蛋白含有这样的插入片段。
“均方根差”是平均偏差平方的算术平均数的平方根，是一种表示此中所述结构坐标偏差或变分的方式。
本文所用的“RGS活性”、“RGS的活性”和其它类似的术语是指RGS结合活性Gα-GTP-Mg2复合体并且诱导GTP水解速率改变的能力。单个RGS蛋白的任何其它生物学功能或活性此中将会进行具体限定。参考文献89和91综述了某些RGS蛋白的另外的生物学功能，所述文献通过引用结合到本文中。可以用测量Gα-GTP-Mg2复合体中在RGS(或其部分)存在和不存在时GTP水解速率的任何测定来测量这样的活性。如本文实施例所述，一种优选的测定方法测量Gα-[γ-32p]-GTP-Mg2水解产生的沉淀的放射性标记磷酸。
表2列举了通过NMR波谱法获得的游离RSG4的约束最小化平均结构的原子结构坐标。表2中的前2栏列出原子序数，第3栏采用标准命名法标识原子类型，第4栏和第5栏列举了氨基酸及其在序列的编号。表中的第6栏、第7栏和第8栏是相对坐标值(以三维坐标表示)。
对技术人员而言显而易见的是，在本发明包括的RGS4和其它RSG蛋白中氨基酸残基的编号可能与此中所述的不同。此中所用的RGS4核心蛋白含有一个具一个N端Met和C端的一个六残基组氨酸标志的RGS核心结构域。在图1中，所用的RGS4核心蛋白的氨基酸序列的编号始于N端Met。为了与全长RGS4序列(例如依照Tesmer等(1997)编号(8))进行比较，将46加到此中所用的编号中。
另外，对技术人员而言显而易见的是，本发明包括的RGS蛋白及其部分可以含有某些保守氨基酸取代，其产生的三维结构与由本文提供的结构坐标±与其中保守氨基酸主链原子(或其保守取代)不超过1.5的均方根差所限定的三维结构相同。通过目测相关氨基酸序列或通过运用市售同源性软件程序，可容易地鉴定其它RGS蛋白或肽中与RGS4中的那些氨基酸相对应的氨基酸和其它RGS蛋白或肽中的保守取代。“保守取代”是或者由于具有相似极性、空间排列或者由于属于与被取代残基相同类别(例如疏水性、酸性或碱性)、在功能上等同于被取代氨基酸残基的那些氨基酸取代，包括在用所述结构鉴定和设计RGS拮抗剂或激动剂方面以及对于分子置换分析和/或进行同源性建模而言对RGS的三维结构具有无关紧要的效应的取代。
本发明的结构坐标允许应用各种分子设计和分析技术，以便(i)求出相关RGS蛋白、肽或其复合物，尤其是RGS亚家族B蛋白、肽或其复合物的三维结构和(ii)选择、设计以及合成或用其它方法获得能够与RGS缔合、结合或相互作用、潜在用作RGS、Gα或RGS-Gα复合体的拮抗剂或激动剂的化学和生化种类。
分子置换分析是一种在X射线晶体分析法中使用的众所周知的技术，该技术利用一种分子的X射线结构作为起点，来对未知晶体结构的分子建模。该技术基于这样的原理具有相似结构、取向和位置的两个分子，其X射线衍射相似。一种相应于分子置换法的方法适用于采用NMR技术对未知的溶液结构建模。两种相似结构的NMR谱和对NMR数据所进行的分析，结构上保守的分子的区域基本上相同，其中NMR分析由获得NMR共振指认和结构约束指定构成，可以包含氢键、距离、二面角、耦合常数、化学位移和偶极耦合常数约束。累积未知结构种类的溶液的合适NMR谱，并且将其与已知结构种类的NMR谱进行比较。在所述两种结构的NMR谱中所观察到的差异就是这两种结构之间的差异(和相似性)，并且在所述结构约束中鉴定出相应的差别。未知结构的结构测定方法则基于根据已知结构修正NMR约束，使其与所观测到的波谱差异一致。该方法适用于采用此中提供的RGS4的结构信息测定任何RGS蛋白或肽的三维溶液结构。所述方法最适于测定预期与RGS4具有显著结构相似性的RGS蛋白的结构。例如，本发明尤其提供大鼠RGS4-核心区的三维溶液结构。可以用上述置换法测定在130RGS核心中与大鼠RGS4核心有2个氨基酸不同的人RGS4-核心(位于位置22N(大鼠)＞S(人)，和132T(大鼠)＞V(人)，参考图1中给出的大鼠序列)的三维结构。
因此，在本发明的一个非限制性的实施方案中，RGS4的NMR共振指认为预期在结构上与RGS4相似的其它RGS家族蛋白(或其部分)的共振指认提供起始点，所述其它RGS家族蛋白例如来自不同生物的RGS4同系物，或更通常是RGS亚家族B蛋白。化学位移微扰可以采用一维或二维波谱(例如15N/1H、13C/1H谱)或采用本领域熟知的其它方法来检测，并且在RGS4和另一RGS蛋白之间进行比较。这样，可以将受影响残基与表2中的关联残基所提供的RGS4三维结构相关联。这有效鉴定出其它RGS蛋白或肽中相对于所述RGS4蛋白有结构改变的区域。然后，可以获得对应于所述其它RGS蛋白或其部分的序贯主链和侧链氨基酸指认两者的1H、15N、13C和13CO NMR共振指认，采用标准2D、3D和4D三重共振NMR技术和NMR指认法，使用RGS4结构、共振指认和结构约束为参比物，可以产生所述蛋白或其部分的三维结构。可以其它RGS蛋白或肽与RGS4三维模型进行各种计算机拟合分析，以便产生其它RGS蛋白或肽的原始三维模型，并且所产生的三维模型可以采用标准实验约束和能量最低化技术加以精修，以便确定与RGS4三维结构相联系的其它RGS的位置和取向。本发明还提供，本发明的结构坐标可以与标准同源性建模技术一起使用，以便测定RGS蛋白或其部分的未知三维结构。正如本领域知道的，同源性建模包括采用一种或多种相关蛋白质分子、分子复合物或其部分(即活性部位)的结构坐标构建未知结构的模型。通过将三维结构待解的蛋白质的共同部分或同源部分与已知三维结构的分子中的同源结构元件的三维结构拟合，准确地说是采用表2中提供的关联(即同源)结构坐标，可以进行同源性建模。可以用各种各样的已知方法，例如采用氨基酸序列同一性、同源二级结构元件和/或同源三级折叠子类，测定同源性。Tesmer等(1997)(8)以及Druey和Kehrl(1997)(88)提供RSG蛋白序列的多重序列比对的实例。同源性建模可以包括用待解的相关结构的氨基酸(或其它组分)置换氨基酸(或其它组分)来重建部分或全部三维结构。所采用的并且适用于NMR结构数据(如上所述)的分子置换分析和同源性建模是本领域众所周知的技术，所述技术易于应用于或适用于测定RGS家族的其它蛋白(和其部分，例如Gα结合部位和/或变构结合部位)的三维结构。这些方法尤其可用来基于RGS4三维溶液结构测定所述蛋白质保守区内的RGS溶液结构。这些方法适用于RGS蛋白家族目前已知的成员以及适用于尚未鉴定为RGS蛋白的蛋白质、尤其是RGS亚家族B的成员，特别是那些在RGS-核心区表现出高于60％或更高、优选85％或更高序列同一性的显著序列同一性的蛋白质。可以以与将表2的结构坐标用于鉴定、选择或设计作为RGS，Gα或RGS Gα复合体的拮抗剂或激动剂的化学种类的相似方式，使用基于此中提供的结构坐标和NMR指认、采用分子置换分析和同源性建模和任选采用本领域多种熟知技术精修测定的RGS蛋白或肽的NMR指认、结构坐标和三维结构。RGS4结构的描述几种RGS4蛋白的一级氨基酸序列是已知的。附有六组氨酸脯氨酸尾的RGS4-核心的氨基酸序列(来自大鼠)示于图1(作为SEQ ID No.1)。游离RGS4的常规二级结构元件根据序贯和链间NOE的定量分析、NH交换率、3JHNα合常数和13Cα和13Cβ二级化学位移来鉴定(47，48)。序贯和平均(medium)NOE从15N-修正的NOESY和13C-修正的NOESY波谱的定量分析获得。3JHNα耦合常数从HNHA实验中与NH对角线的Hα交叉峰的相对强度获得(18)。慢交换NH质子通过将RGS4样品从H2O交换为D2O后两小时记录HSQC波谱来鉴定。这些数据连同所推导的二级结构元件概述于图1中。
RGS4的总体结构由对应于残基7-12(α1)、17-36(α2)、40-53(α3)、61-71(α4)、86-95(α5)、105-125(α6)和128-132(α7)的7个螺旋区构成。RGS4拓扑结构可简单描述为所述蛋白质由具有上-下-上-下(up-down-up-down)排列的两个假4-螺旋束组成，其中螺旋区6是这两个束的一部分。在第二个螺旋区中存在RGS4结构与众不同的特征。在所述螺旋中有一个残基(H23)～90°弯曲，其将该螺旋区有效分成两个独立的螺旋(如在RGS4 X射线结构中所述(5))。根据对二级结构数据进行NMR分析(图1)，这一个残基弯曲不太明显，在所述数据中它似乎是一个连续螺旋延伸。所述弯曲仅在结构精修过程中变得明显。在残基L20、I21和残基G26、L27、A29和F30之间发生可归因于在H23处弯曲的某些可观测到的NOE。在H23处的弯曲有效使这些疏水性侧链可以适当堆积(packing)。
在整个所述RGS4结构中发生另外的弯曲或转角。螺旋区α1和α2通过残基S16连接，该残基采用伸展构象使得这两个螺旋基本上是平行的。这非常类似于连接螺旋区α3和α4以及螺旋区α5和α6的转角。相反，螺旋区α2和α3通过具有正向φ扭转角的Y38连接，提示为β型转角。Y38的构象导致在螺旋区α2和α3之间的角约为45°，这也代表在这两个假4-螺旋束之间的一个过渡点。在螺旋区α4和α5之间出现结构中最长的环。该环区基于有序参数高(S2＞0.6)而非常有序。该环的低能动性是由于与螺旋区α3和α6相互作用所致。在最长螺旋区α6和最短螺旋区α7之间所观测到的弯曲提示，在该螺旋区段有一个扭曲，以达到在螺旋区α1和α7之间最适堆积相互作用。在RGS4总体拓扑结构上这些局部构象的最终结果是产生一种伸长结构，其中两个假4-螺旋束几乎是垂直的。这两个假4-螺旋束之间的接触面其本质上主要是疏水性的(L17，I21，L27，F30，L34，W46，I47，I110，F111，L113，M114)，与在所述蛋白质表面具有带电残基的蛋白质核心中疏水性残基通常堆积一致。
如先前所述，RGS4的主要生物学功能是结合Giα1并刺激其内在GTP酶活性。在RGS4结构中参与RGS4与Giα1相互作用的关键残基对应于形成来自Giα1的T182结合口袋的RGS4残基S39、E41、N42、L113、D117、S118和R121。同样，来自RGS4的N82结合在与Giα的残基Q204、S206和E207(8)相互作用的Giα1活性位点中。RGS4突变研究工作支持这些残基在RGS4与Giα1的结合和活性方面的功能重要性，而N82鉴定为在促进GTP水解方面是关键的(18-20)。RGS4残基S39、E41和N42位于螺旋区α3的N末端，而L113、D117、S118和R121正好相反地位于螺旋区α6的C末端。N82大约位于螺旋区α4和α5之间的结构环区的中心，这相当于位于RGS4上的T182结合口袋之上。
RGS4结构的另一特征是观测到残基M1-S4和P134-H166完全无序排列且是动态柔性的。表2中未包括这些原子的结构坐标。这通过可观测的NOE的尖锐谱线宽度和最小数加以证实。这些残基的柔性特性通过显示有序参数低(S2＜0.6)的15NT1、T2和NOE测量结果得到进一步支持。RGS4结构测定基于由约1960种近似质子间距离约束、39个主链氢键的78种距离约束、由151φ、154ψ、97χ1和29χ2扭转角约束组成的431种扭转角约束、132种3JNHα约束以及136种Cα和134种Cβ化学位移约束组成的2871种实验NMR约束，计算最后30种模拟退火结构。获得具有β-亚甲基质子的125个残基中的58个、5个Val残基中的3个的甲基和12个Leu残基中的9个的甲基的立体定向指认。另外，8个Phe残基中的7个和5个Tyr残基中的4个被很好地精修，使得有可能将NOE约束指认给唯一一对CδH和CεH质子以及指定χ2扭转角约束。游离RGS4 NMR结构与GS4Giα1结合结构的比较图2A和图2B均是带状图，(A)与Giα1复合的RGS4的X射线结构(8)，而(B)通过NMR方法测定的RGS4的溶液结构。指出了在这两种结构之间引起显著结构改变的残基。在Giα1不存在时测定RGS4的溶液结构的一个意外的结果是观测到相对于所述复合体中RGS4的游离RGS4构象中的显著变化(5)。这两种结构之间差别的根本原因是二级结构元件的微扰。与RGS4-Giα1X射线结构一致，游离RGS4的NMR结构是由两个假4-螺旋束组成的α螺旋蛋白。NMR数据显示，游离RGS4由7个螺旋区组成，该数据中的大部分与RGS4-Giα1X射线结构一致。这两种二级结构之间的显著差异发生在C端螺旋区α6和α7内。在RGS4-Giα1X射线结构中，观测到残基V5-T132(即它们是有序的)，而残基104-106和119-129是螺旋的。这与游离RGS4 NMR结构相反，在NMR结构中残基5-133、105-125(α6)和128-132(α7)是螺旋的。在含有残基104-133的该区中的螺旋结构内有一个显著位移。
在游离RGS4 NMR结构和RGS4-Giα1X射线结构之间所观测到的结构改变是螺旋区α6和α7之间的扭折向C末端移动的结果。该扭折的运动导致在游离RGS4 NMR结构中α6加长9个残基，而α7缩短6个残基。另外，游离RGS4的α7在RGS4-Giα1X射线结构中作为结构区所观测的残基之外延长3个残基。
在二级结构中所观测到的变化，尽管仅涉及几个C末端残基，但是影响深远，因为它导致在RGS4总体折叠方面的显著改变。从残基5-134的RGS4-Giα1X射线结构和游离RGS4NMR结构之间有1.94主链rms差异来看，这是很明显的。在二级结构发生改变的主要作用是N端和C端螺旋堆积的改组，从游离RGS4 NMR结构和结合RGS4X射线结构之间每个残基主链原子rms差异来看，这是很明显的。因此，二级结构解释的准确性对于正确分析游离RGS4结构是重要的。NMR二级结构的可靠性为在图1中概述的外延数据所证明。残基105-125和128-132显示与α螺旋定义一致连续扩展的NMR数据，残基125-128的该信息陡变(abrupt break)。此外，大量的质子间距离(145)和扭转角(39)违背以及由结合RGS4X射线结构显示出的NOE和扭转角约束能量相应的数值非常高，指示游离RGS4 NMR结构和结合RGS4X射线结构之间-末端和C末端区有显著差异。运用NOE、耦合常数、NH交换率和二级碳化学位移的NMR数据和大量的约束违背与所述结合结构的自相一致性，证明所提供的RGS4 NMR结构的准确性。然后，本发明的游离RGS4结构与RGS4-Giα1复合体结构的比较，应该提供与Giα1结合时在RGS4上发生的构象变化的准确描述。
RGS4构象变化与活性的相关性RGS4参与对GTP-Gα具有适度亲和性、但不与GDP-Gα结合的Giα1-GTP酶循环的调节。认为对于所观测到的游离RGS4的构象变化与调节其对Giα1的亲和性以便于保持GTP酶循环有关。RGS4构象变化的这一作用为RGS4Gα结合部位是Giα1诱导结构微扰的位置的事实所证实。在结合RGS4X射线结构中观测到的螺旋区α6和α7之间的显著扭折发生在残基D117和S118上。计算Giα1T182结合口袋附近的游离RGS4 NMR结构和RGS4-Giα1X射线结构两者的RGS4分子表面。这两种RGS4分子表面的比较，显示Giα1T182结合口袋在游离RGS4NMR结构中是更大更可及的。另外，在RGS4-Giα1X射线结构中，似乎有一种由来自残基D117、S118和R121的RGS4侧链组成的、围绕Giα1T182结合口袋的分子表面“壁”。这些残基形成重要的氢键网络，这对于RGS4与Giα1的结合是关键的，其中D117与R121和Giα1T182的主链氮形成氢键。这些残基的重要特性得到诱变的进一步支持。D117和R121的丙氨酸突变减弱了RGS4活性和与Giα1的结合。由于残基D117和S118的螺旋扭折在游离RGS4 NMR结构中不太显著，并且在螺旋中而不是在残基125-128之间发生破坏，因此，D117、S118和R121的侧链远超出氢键距离。根据RGS4 NMR结构证实，在Giα1不存在时侧链与Giα1T182侧链相互作用的网络没有预先形成。
观测到RGS4在Giα1存在时经历显著的结构改变，其中这种变化的关键点发生在RGS4-Giα1界面中的关键残基上，产生对Giα1GTP酶活性的RGS4活化过程的不同解释。这一信息提示由结合步骤和锁定步骤组成的两步过程。因为Giα1T182结合口袋在游离RGS4 NMR结构中显然是更可及的，结合步骤看来通过T182契合到该口袋而驱动。所述锁定步骤则由于RGS4结构中诱导的构象变化而引起，其中在残基D117和S118之间螺旋中的显著扭折使这些残基与R121和Giα1T182紧密接触，形成在RGS4-Giα1X射线结构中所观测到的氢键网络。结合口袋中的T182诱导氢键网络的形成和所产生的RGS4构象变化，与RGS4-Giα1X射线结构所提示的预先形成的结合部位相反。RGS4从Giα1中释放则需要从假定在GTP水解期间发生的RGS4结合口袋中除去Giα1T182。该机制符合在GDP-Giα1(2)和RGS4-Giα1X射线结构之间所观察到的T182附近的局部微扰，其中这种局部移动似乎足以从RGS4结合部位除去T182并且破坏氢键网络，导致所述复合体的解离。RGS4-Giα1和GDP-AlF4-Giα1X射线结构(4)之间的T182Giα1区的比较表明，这两种结构在Giα1的该区中基本上相同。由于GDP-AlF4-Giα1结构对应于活性形式的GDP-AlF4-Giα1以及RGS4优先结合的构象，因此在这两种结构之间的相似性也与所提出的RGS4活性机制一致。
与Giα1复合的RGS4连同其它Gα构象异构体的X射线结构提示，RGS4在激发GαGTP酶活性中的作用通过稳定GTP水解过渡态来实现。这里所报道的游离RGS4的NMR结构扩大了该机制，说明在Giα1存在下RGS4诱导的构象可能与其促进结合转换的GTP-Giα1特异性有关，该结合转换对于维持GTP酶循环是关键的。在RGS4中的所述结构改变提供在各种Gα构象异构体之间所观察的结合选择性的精巧机制，尽管在这些结构中有密切的相似性。
RGS4中变构结合部位的检测基于暗示抑制RGS4与Gα结合的GαGTP酶功能的抑制检测，在大规模筛选中鉴定出RGS4-Gα相互作用的若干小分子抑制剂。这些化合物之一(为方便起见命名为化合物1)显示100％结合抑制。通过1H-15NHSQC化学位移微扰实验，进一步研究了化合物1的活性性质及其抑制RGS4与Gα结合的能力。总共检测了5种化合物，其中3种在筛选中已显示抑制RGS4结合，而2种对照在筛选中显示无活性。收集富15N RGS4样品的2D1H-15N HSQC波谱，并且用3种试验化合物中的1种和2种对照滴定一系列富15NRGS4样品。游离RGS4样品和用潜在抑制剂滴定的每种样品的HSQC波谱比较，使得可以鉴定在试验和对照化合物存在下RGS4的任何化学位移变化。在这样的分析中，观测到共振位置形状或强度的变化，指示有微扰。用所使用的NMR仪器可以可靠地检测峰位中的半谱线宽度的位移。仅在化合物1存在下所获取的RGS4 NMR谱中有所观测到的任何化学位移微扰，表明化合物1直接与RGS4结合。采用游离RGS4的化学位移指认(表1)，鉴定出化合物1在RGS4中的结合部位。RGS4氨基酸残基V10、W13、117、I20、H23、E24、C25和T125在化合物1存在下显示化学位移微扰。
所观测到的化学位移微扰不是由于将化合物1加入到RGS4溶液引起的pH变化产生的。(在pH范围5.5-6.5内获取的游离RGS4的1H-15NHSQC谱表明，以上列举的氨基酸残基都对该范围内的pH变化不敏感)。化合物1的结合部位相当于RGS4α1-α2区中的残基(其中α1-α2区包括这两种螺旋之间的紧密转角)。在RGS4的三维结构中，所述结合区位于与Gα结合部位相反的表面。与Gα结合部位相关的氨基酸残基在化合物1存在下没有显示任何化学位移微扰。这表明RGS4 Gα结合部位的结构在化合物1存在时没有变化。发现化合物1显著降低预期的Gα的GTP酶活性，将其与化合物1的结合部位远离Gα结合部位的事实综合起来考虑，表明化合物1是RGS4的一种变构抑制剂，并且在RGS4的α1-α2区中有一个变构结合部位。
认为化合物1结合在变构结合部位稳定游离形式的RGS4，并且有效锁定游离形式的RGS4蛋白。化合物1防止在GαT182结合口袋周围形成氢键网络。
此中提供的溶液结构信息，包括RGS4-核心、RGS4Gα结合部位、α6-α7区和RGS4α1-α2区中变构结合部位的二级和三级结构全都可以用于本文所述方法和本领域众所周知的方法中，以鉴定、选择或设计进而影响各种真核细胞和生物的G蛋白信号功能的RGS4活性的候选激动剂和拮抗剂。
提供以下实施例进一步说明本发明，而不是用来限制本发明。
实施例本文中使用以下缩写G蛋白，异源三聚体鸟嘌呤核苷酸结合蛋白；RGS4，G蛋白信号的调节剂；Giα1，异源三聚体G蛋白的Gα亚基，Giα1-AIF4-，与Mg2+、GDP和AlF4-复合的在GTP水解过渡态中稳定的异源三聚体G蛋白的Gα亚基，DTT，DL-1，4-二硫苏糖醇；GTP，鸟苷三磷酸；GDP，鸟苷二磷酸；NMR，核磁共振；2D，二维；3D，三维；HSQC，异核单级量子相干波谱法；HMQC，异核多级量子相干波谱法；TPPI，时间-比例相增量；NOE，核欧沃豪斯效应(nuclear Overhauser effect)；NOESY，核欧沃豪斯增强波谱法(nuclear Overhauser enhancedspectroscopy)；COSY，相关波谱法；HNHA，酰胺质子与氮与CαH质子相关性(amide proton to nitrogen to CαH proton correlation)；HNHB，酰胺质子与氮与CβH质子相关性(amide proton to nitrogen to CβHproton correlation)；CT-HCACO，恒定时间CαH质子与α-碳与羰基相关(constant time CαH proton to α-carbon to carbonyl correlation)；HACAHB，CαH质子与α-碳与CβH质子相关性(CαHproton to α-carbonto C βH proton correlation)。实施例1NMR峰的指认和二级结构测定采用原核表达载体pQE50(Qiagin，Valencia，CA)，使RGS4的RGS核心结构域在大肠杆菌(Esherichia coli)(J109)中表达。用PCR扩增RGS核心(在此为RGS4残基51-206)，并将C端六组氨酸-脯氨酸标志添加到RGS核心，将连接产物在pQE50的BamH1和Sall位点之间，得到质粒pRGS4。让含有pRGS4的大肠杆菌(BL21(DE3))在补充100μg/mL氨苄青霉素的LB肉汤中生长。将过夜培养物以1∶20稀释，让其于37℃剧烈振荡下生长至A600为0.6-0.8。加入异丙基β-D-半乳糖苷(1PTG)至终浓度为1mM，将培养物于37℃振荡3小时。通过于4℃离心(7000xg)15分钟收获细胞，用PBS洗涤，贮存于-70℃。
通过让BL21(DE3)大肠杆菌在含有2.0g/L[13C6，98％+]D-葡萄糖和1.0g/L[15N，98％+]氯化铵分别作为唯一碳源和氮源的已知成分培养基中生长，获得均匀(＞95％)15N-和13C-标记的重组RGS4-核心(含有具有N端甲硫氨酸和C端六组氨酸-脯氨酸标志的RGS4的166个氨基酸核心结构域)。另外，所述已知成分培养基还含有M9盐、微量元素、维生素和100μg/L氨苄青霉素。诱导和生长条件如上所述。重组RGS4-核心蛋白采用亲和色谱在10mL Ni2+柱子上纯化，然后采用离子交换色谱在Resource S上于pH5.5纯化至同质。使用前将蛋白质在合适缓冲液中脱盐。为证实蛋白质身份进行N端氨基酸测序，通过MALDI-TO质谱分析法(Perceptive Biosystems)证实RGS4-核心的均匀标记。
NMR样品含有1mM在含50mMK2PO4、2mM NaN3和50mM氘化DTT、在或者90％ H2O/10％D2O或者100％ D2O、pH6.0的缓冲液中的RGS4人工纯化核心蛋白。
所有谱都采用梯度增强的三重共振1H/13C/15N探针，在BruckerAMX-2600分光计上于30-35℃记录结果。对于在H2O中记录的波谱，水抑制用WATERGATE序列和水-flip back(water-flip back)脉冲来实现(23，24)。在间接检测维中的正交检测用States TPPI超复数相位增量(hypercomplex phase increment)记录(25)。用合适再聚焦延时提供0，0或-90，180相位修正，收集波谱。波谱运用NMRPipe软件包(28)处理、用PIPP(29)、NMR Pipe、在Sun UltralO Workstation的峰分类程序(peaksorting program)中分析。适当时，数据处理包括溶剂过滤(solventfilter)、对数据二次方填零(zero-padding data to a power of two)、线性预测回间接获得数据的前一个数据点(linear predicting back one data pointof indirectly acquired data)以获得零相位校正、对间接获得维的其它点线性预测以增加分辨率。对于恒定时间实验只使用借助镜像技术的线性预测(38)。在所有情况下用斜正弦钟变迹函数(skewed sine-bellapodization function)处理数据，在所有维中使用一次零填充。
1H、15N、13CO和13C共振的指认基于以下实验CBCA(CO)NH(62)、CBCANH(63)、C(CO)NH(64)、HC(CO)NH(64)、HBHA(CO)NH(65)、HNCO(66)、HCACO(29)、HNHA(26)、HNCA(67)、HCCH-COSY(68)和HCCH-TOCSY(69)(有关综述参见Bax等1994以及Clore和Gronenborm，1994)。RGS4共振指认基本上采用先前描述的半自动化方案(37，70，71)。RGS4-核心指认的准确性通过15N-修正的NOESY-HMQC波谱的序贯NOE进一步证实。因为RGS4结构只有α-螺旋，所以序贯NHι-NHι+1NOE在完成RGS4主链指认方面极其有用。RGS4-核心的1H、15N、13C和13CO指认概述于表1中。
表1中的主链1H、15N、13CO和13C指认对于RGS4-核心基本上是完全的。如上所述，天然核心序列附加6个组氨酸。最后5个组氨酸是所述蛋白质中仅有的未指定的残基。获得RGS4-核心完全指认的能力暗示一种堆积良好的有序结构。侧链指认也几乎是完全的；大多数丢失的信息是位于具有潜在溶剂暴露的长侧链的残基中。
RGS4-核心的二级结构(概述于图1中)基于涉及得自15N-修正的NOESY-HMQC和13C-修正的NOESY-HMQC波谱的NH、Hα和Hβ质子的特征性NOE数据、得自HNHA的3JHNα耦合常数、慢交换NH质子和13Cα和13Cβ二级化学位移(有关综述参见(56)和(78))。已测定RGS4-核心溶液NMR由对应于以下残基的7个螺旋区组成残基7-12(α1)；17-36(α2)；40-53(α3)；61-71(α4)；86-95(α5)；105-125(α6)和128-132(α7)。RGS4-核心总体折叠基本上由两个4-螺旋束组成，两个螺旋束都具有长螺旋区α6部分。在C端意外地观测到在溶液中的RGS4核心二级结构与RGS4-Giα1复合体的X射线结构有明显差异。所述X射线结构表明，在观测残基V5-T132时，残基104-116和119-129是螺旋的。溶液NMR结构表明，残基105-125和128-132是螺旋的，而根据所观测到的尖锐谱线宽度，残基P134-H166看来是极易活动的。所述X射线晶体结构和游离RGS4-核心的X射线晶体结构之间二级结构的差异提示在与Gα结合时RGS4中有构象变化。实施例2RGS4-核心的三维结构测定如实施例1所述方法制备、纯化和均匀标记RGS4-核心。如实施例1中指定方法制备NMR样品，并累积波谱数据。
RGS4结构基于以下系列的波谱HNHA(26)、HNHB(27)、3D远程(long-range)13C-13C相关性(28)、耦合CT-HCACO(29，30)、HACAHB-COSY(31)、3D15N-修正的(32，33)和13C-修正的NOESY(35，37)实验。15N-修正的NOESY和13C-修正的NOESY实验分别以100msec和120msec和混合时间(mixing times)来收集。
波谱运用NMRPipe软件包(36)处理，并且用PIPP(37)在SunUltralO Workstation上分析。适当时，数据处理包括溶剂过滤、对数据二次方进行零填充、线性预测回间接获得数据的前一个数据点以获得零相位修正、对间接获得维的其它点线性预测以增加分辨率。对于恒定时间实验只使用借助镜像技术的线性预测(38)。在所有情况下用斜正弦钟变迹函数处理数据，在所有维中使用一次零填充。
质子间距离约束将从3D13C-修正的NOESY和3D15N-修正的NOESY实验指定的NOE分成强、中、弱和极弱，分别相当于质子间距离约为1.8-2.7(对于涉及NH质子的NOE，为1.8-2.9)、1.8-3.3(对于涉及NH质子的NOE，为1.8-3.5)、1.8-5.0和3.0-6.0(39，40)。对涉及甲基质子和不能指认立体定向的亚甲基质子的距离的距离上限适当加以修正，以供中心平均(41)。
扭转角约束和立体定向指认β-亚甲基立体定向指认和χ1扭转角约束主要得自根据HACAHB-COSY实验(31)的3Jαβ耦合常数和根据HNHB实验(27)的3JNβ耦合常数的大小的定量估计。所述指定的进一步支持得自涉及NH、CαH和CβH质子的残基内NOE的近似距离约束(42)。
φ和ψ扭转角约束从以下获得在HNHA实验中根据与NH对角线的Hα交叉峰的相对强度测量的3JNHα耦合常数(26)，采用TALOS程序进行的化学位移分析(43)和与涉及NH、CαH和CβH质子的残基内NOE和序贯NOE的距离约束的一致性。用从偶合3D CT-HCACO波谱获得的3JCαHα耦合常数，确定具有正向φ主链扭转角的非甘氨酸残基的存在(30)。大于130Hz的1JC αHα耦合常数的存在，使得最小φ约束可以为-2°至-178°。
根据从在3D远程13C-13CNMR相关波谱中Cα和Cβ交叉峰相对强度获得的3JCαCδ耦合常数(44)、连同残基内NOE的相对强度(45)，确定Ile和Leuχ2扭转角约束和亮氨酸甲基的立体定向指认。如Zuiderweg等(1985)所述，基于残基内NH-CγH和CαH-CγH NOE的相对强度，确定缬氨酸甲基的立体定向指认(46)。对于所述φ、ψ和χ扭转角约束所用的最小范围分别是±30°、±50°和±20°(47)。
结构计算采用Nilges等(1988)的混合距离几何学-动力学模拟退火法(hybriddistance geometry dynamical simulated annealing method)(48)，并稍加修改(49)，运用程序XPLOR(50)，使其适用于加入3JNHα耦合常数的假位势(51)、二级13Cα/13Cβ化学位移约束(52)和构象数据库位势(53，54)，计算所述结构。在约束最小化和模拟退火期间最小化的靶函数仅包括共价几何结构的二次谐波项、3JNHa耦合常数和二级13Cα/13Cβ化学位移约束、实验距离的矩形势阱二次位势和扭转角约束和非键合接触的四次范德华项。所有肽键约束成平面和反式。在靶函数中没有氢键、静电或6-12个林纳德-琼斯(Lennard-Jones)经验势能项。RGS4-核心上T-182结合部位的分析在所提出的(Gα的)T182结合部位区域中NMR结构总的概貌是最感兴趣的内容之一。为了获得在游离RGS4NMR结构和RGS4-Giαi复合体的X射线结构之间可及性方面差异的更好的定量测量，计算两种结构的MOLCAD(TRIPOST市售产品)表面，测量每种结构的表面积。
将RGS4-Giαi复合体(AGR1)X射线结构读入SYBYL(Tripos)，删除链E(RGS4)以外的所有亚结构。另外，删除所有水。添加极性氢，采用Kollman United Atom力场优化。然后加入所有剩余的氢。然后用MOLCAD产生认为参与T182(Gα-结合部位)结合的所有残基的表面。这些RGS4-核心残基包括I21、I27、F30、F33、L34、E37、S39、N42、I43、W46、I110、L113、M114、D117、S118、R121。基于MOLCAD表面计算所述表面积。也用MOLCAD计算游离RGS4 NMR结构相同残基的表面积。计算游离RGS4NMR结构的表面积为404.56 2。计算所述晶体结构的表面积为321.882。表面积之差为82.672，即是这两种结构之间表面积有大约20％变化。在GαT182的甲基和羟基上产生的MOLCAD表面的表面积为57.722。实施例3RGS4-核心中变构结合部位的鉴定抑制RGS与Gα结合的微珠沉淀测定用体外转录的cRNA制备物(Promega，Cat.No.P1290)编程的兔网织红细胞裂解物体外翻译反应(Promega，Madison，WI Cat.NO.14960)合成放射性标记的[35S]-Gαil。将亲和纯化的GST-RGS4核心(100ng，约25nM终浓度)与17.5μL 100μL结合缓冲液(1XPBS，1mM MgCl2，1mM DTT，1％ BSA)中的谷胱甘肽-Sepharose 4B微珠(AmershamPharmacia，Piscataway，NJ，Cat.NO.17-0756-01)浆液一起在96孔微量试管测定板中保温。向各孔加入约300μM试验化合物(约0.1mg/mL终浓度，或者为混合物或者为单个化合物)，于4℃保温30分钟。将约50,000-100,000cpm(？)35S]-Gαi1的100μL测定缓冲液(1XPBS，1mMMgCl2，10μM GDP，1mM DTT，30μMAlCl3，1％ BSA，500μM NaF)加入到反应物中，于4℃保温30分钟。所得测定样品的终浓度约1-3nM活化Gαi1。将反应板以1000xg离心3分钟，吸出上清液。微珠通过重悬浮于200μL结合缓冲液然后离心而被洗涤2次。通过将结合[35S]-Gαi1重悬浮于100μL 1％ SDS而将其从微珠沉淀中洗出。洗出液在4mL闪烁液中计数或经过凝胶电泳。采用其中多种试验化合物在单个孔中混合(例如对于3000初次测定，10种化合物/孔可测试30,000种试验化合物)的压缩文库，在所述测定中可以评价随机小分子。通过以相同方式重新筛选，证实显示沉淀放射性的降低超过50％的试验化合物的混合物。将在两种测定中测试阳性的混合孔(Combi-wells)(此处10种试验化合物/孔)去卷积(deconvoluted)，用相同微珠沉淀测定单独测试单个化合物。对证明沉淀放射性有必不可少降低(约50％或更高)的化合物进一步测试，以证实在沉淀放射性的降低依赖于RGS4-Gα相互作用，而不是由于所述试验化合物的假活性所致。在这些情况下，通过凝胶电泳分析所述测定的沉淀，以证实沉淀中RGS4的存在。
1H-15NHSQC化学位移微扰RGS4NMR样品在样品缓冲液(50mM KPO4，2mM NaN3和50mM氘化DTT的90％ H2O/10％ D2O，pH6.0)中含有0.3mM RGS4-核心蛋白。将试验化合物以10倍摩尔过量加入到样品中。在pH滴定范围5.5-6.5内，收集游离RGS4和试验化合物存在下RGS4的2D1H-15NHSQC波谱。间接检测的15N维内谱宽为30.00ppm，载体位置在119.1ppm。在所必需的维内谱宽为13.44ppm，载体位于水频率之处(4.73ppm)。在所述两维中所获取的点数在F1(15N)中在复数情况下为256，在F2(1H)中在实数情况下为1024。
所有波谱采用梯度增强的三重共振1H13C/15N探针，在BruckerAMX-2600分光计上于35℃记录结果。水抑制在间接检测维中用WATERGATE序列和水-flip back脉冲(23，24)达到。在间接检测维中的正交检测用States-TPPI超复数相位增量(25)记录。用合适再聚焦延迟收集波谱以供进行0，0相位校正，运用NMRPipe软件包(36)处理、用PIPP(29)在Sun Ultra 10 Workstation上分析。数据处理包括溶剂过滤、斜正弦钟变迹函数和所有维中的一次零填充。
GTP酶功能测定.使用G蛋白α亚基的单转换GTP酶测定。在该测定中，[γ-32P]-GTP的GTP酶诱导的水解导致放射标记以32Pi沉淀。从计数的沉淀标记中分离出未水解的[γ-32P]-GTP，然后对沉淀的标记计数。沉淀的标记32Pi与水解的[γ-32P]-GTP量成正比，与Gα GTP酶的活性也成正比。
通过将Gα(2μM)与[γ-32P]-GTP(2μM)一起在反应缓冲液(总体积30μL)、10mM Hepes(pH8.0)、5mM EDTA，2mMDTT，0.05％ C12E10(Lubrol，ICN Biomedicals，Inc.，Aurora，OH)、10μg/mL BSA)中于30℃保温30分钟，制备纯化的[γ-32P]-GTP结合的Gα。采用凝胶过滤柱(Centri-Sep，Princeton Separations，Princeton，NJ)，按照生产商的说明，除去未结合的[γ-32P]-GTP。收集含有[γ-32P]-GTP结合Gα的洗出物，于4℃以2000rpm离心2分钟后回收所述蛋白质(通常至多约80-90％)。
所有测定步骤都在4℃下进行。将以上获得纯化的[γ-32P]GTP结合Gα加入到500μL反应缓冲液(同上)，分成8个50μL样品(1个零时对照(没有开始)和7个测定时间点)。通过将10μL 1M MgCl2和10μL10mM GTP加入到所述7个测定样品中使反应开始。分别在10秒、20秒、30秒、40秒、60秒、90秒和120秒后，将750μL终止缓冲液(50mM NaPO4(pH3.0)，5％活性炭)加入到其中一种测定样品中。然后将对照和样品以100,000rpm离心10分钟，以沉淀活性炭，取出500μL上清液，测定存在的放射性标记。GTP酶活性以从[γ-32P]GTP释放的游离[32P]-磷酸量表示。磷酸释放(fmol)＝放射性(零时对照-时间测定)(计数)/[γ-32P]GTP的比活。
如上所述测定Gαi在RGS4-GST融合蛋白存在下的GTP酶活性，其中在100nM RGS4-GST蛋白存在和不存在时通过加入MgCl2，起始100nM Gαi的GTP水解。以32Pi释放量(以fmol计)计算指定时间点的GTP水解。在10nM或100nM RGS4-GST蛋白存在或不存在时，如上所述测定RGS4-GST蛋白对GTP-Gαi水解的剂量依赖效应。
评价试验化合物对RGS4核心结构域活性的修饰效应。采用标准分子技术，作为GST-RGS4核心融合物产生RGS4核心蛋白。简而言之，采用PCR产生编码所述蛋白质的氨基酸51(val)至C末端氨基酸206(ala)的cDNA片段，获得RGS4的核心区。所述5′正向扩增引物含有一个内嵌BamHI限制性位点，后接在大鼠RGS4 Val残基之前的编码柔性接头Gly-Ser-Gly-Ser的核苷酸。3′反向扩增引物含有一个终止密码子，后接一个内嵌BamHI位点。所述扩增引物与作为模板的pWE2RGS4(Shuey等，1998(84))一起使用，以产生大约625个碱基对的PCR产物。将该PCR产物经BamHI消化、纯化并连接在pGEX-2T(Ammersham Pharmacia，Piscataway NJ)的BamHI位点，产生pGST-RGS4c重组质粒。将质粒转染到细菌细胞中，通过标准技术制备DNA，并且通过序列分析加以证实。采用pGEX-2T载体，按照生产商关于表达的建议，产生和纯化GST-RGS4c融合蛋白。
为了测定试验化合物对RGS4核心结构域活性的影响，将RGS4-GST融合蛋白(1.6μM)与试验化合物(或试验化合物的混合物)(各30μM-40μM)或DMSO一起于30℃保温1小时。此后，在用试验化合物(100nM)处理的RGS4-GST存在或不存在时测量Gαi(100nM)的GTP酶活性。每种测定重复至少三次。RGS4-GST用30μM化合物1处理，抑制RGS的GTP酶活性达30％；与DMSO对照相比，用300μM化合物1处理的RGS4-GST抑制GTP酶活性。
本领域技术人员将会认识到，除本文具体公开的试剂、方法、程序和技术之外的试剂、方法、程序和技术是本领域已知的，并且可以容易地使用或适用于实施本发明，以获得本发明的结果。所有这样的本领域已知的功能等同试剂、方法、程序和技术计划包括在本发明中。本文中所引用的所有参考文献通过引用全部结合到本文中，其程度与本文中的公开内容一致。
表1RGS4的15N、13C、13CO和1H共振指认(pH6.0和30℃)a残基N CO Cα Cβ 其它M1 -(-)176.1 55.9(4.30) 29.4(2.10，3.00)Cγ33.9(2.38)；Cδ21.7(0.36)R2123.0(8.40) 177.2 56.7(4.290 33.0(1.84，1.77)Cγ24.8(1.45)；Cδ29.2(1.71)；Cδ42.2(3.00)G3110.4(8.40) 173.7 45.3(4.00)S4115.7(8.23) 174.0 58.1(4.96) 64.3(3.90)V5121.6(8.20) 174.9 61.2(4.38) 33.6(1.99) Cγ21.7(0.98)；21.9(0.89)S622.3(8.56) 175.1 57.5(4.31) 65.3(4.33，4.02)Q7121.5(8.95) 178.2 58.5(3.80) 28.3(2.02) Cγ34.3(2.39)E8118.9(8.48) 178.8 59.7(3.85) 29.1(2.01，1.94)Cγ36.6(2.29)E9120.5(7.43) 177.0 58.9(3.77) 29.4(2.04，1.72)Cγ36.4(2.23)V10 116.8(7.16) 180.8 65.0(3.89) 31.4(1.54) Cγ22.1(0.34)；22.6(0.34)K11 122.0(7.86) 179.6 59.9(3.92) 32.1(1.82) Cγ25.4(1.52，1.37)；Cγ29.4(1.62)；K12 120.0(7.39) 180.4 59.1(4.09) 31.7(2.12，1.93)Cγ25.4(1.52，1.45)；Cδ 29.2(1.68)；W13 120.7(7.84) 176.7 57.2(4.63) 29.8(3.46) Cδ1 126.4(6.67)；Nε1 129.3(9.69)；Cζ2 113.9(6.25)；Cη2 124.0(6.81)；Cζ3 121.3(7.18)A14 117.5(7.48) 176.9 52.3(4.36) 18.6(1.52)E15 117.5(7.80) 177.1 57.6(4.29) 30.9(2.16) Cγ36.6(2.48，2.25)S16 111.6(7.02) 173.6 57.5(4.50) 65.0(4.22，3.93)L17 125.4(8.36) 177.5 57.1(3.17) 39.5(0.97) Cγ26.2(0.65)；Cδ25.9(-0.48)；23.9(-0.08)E18 117.2(8.68) 177.7 60.1(3.63) 29.3(1.98，1.91)Cγ36.5(2.19)N19 116.0(7.53) 176.9 55.3(4.37) 38.4(3.20，2.78)L20 119.5(7.01) 176.4 58.2(3.50) 41.8(1.79，1.63)Cγ24.7(0.52)；Cδ26.9(-0.03)；24.9(0.33)I21 105.6(7.37) 175.1 63.3(3.65) 37.1(1.61) Cγm19.2(0.33)；Cγ(0.70，0.81)；Cδ12.3(-0.62)N22 115.7(7.10) 173.8 53.9(4.76) 39.5(2.88)H23 121.6(7.32) 176.0 56.4(4.71) 33.9(3.31，2.98)Cδ2138.6(8.15)E24 128.2(9.04) 179.5 60.6(4.07) 29.8(2.09) Cγ36.1(2.44，2.34)C25 121.4(10.57) 176.9 61.8(4.46) 27.3(3.37)G26 114.1(7.36) - 46.6(2.86，2.45)L27 122.8(8.66) 178.3 58.2(3.76) 41.4(1.72.1.65) Cγ27.1(1.60)；Cδ25.6(1.05)；23.5(1.04)A28 118.3(7.29) 180.8 55.3(4.06) 18.4(1.60)A29 122.8(7.85) 178.9 55.3(4.51) 18.2(1.84)表1(续)F30120.0(8.51) 177.8 59.1(3.94) 39.5(2.62，2.38) Cδ-(6.34)K31118.9(9.02) 177.5 60.6(3.59) 32.4(1.94，1.74) Cγ26.0(1.70，1.44)；Cδ-(1.63)；Cε-(2.96)A32121.6(7.82) 180.3 55.3(3.9817.8(1.61)F33121.5(7.82) 177.8 59.9(4.39) 39.2(3.18，2.00) Cδ-(6.78)；Cε-(7.18)L34122.0(8.57) 180.0 57.6(3.34) 40.2(0.88)Cγ26.2(1.01)；Cδ21.8(0.57)；26.3(0.19)K35120.9(8.60) 180.1 59.6(3.90) 32.1(1.79)Cγ24.9(1.54，139)；Cε-(2.93)S36116.7(7.43) 174.1 61.1(4.09) 63.1(4.04，2.38)E37118.0(6.86) 175.3 55.3(4.28) 29.9(1.98，1.45) Cγ35.9(1.66)Y38118.8(7.60) 175.8 58.7(4.37) 35.5(3.27，3.09) Cγ133.4(7.04)；Cε118.2(6.84)S39113.0(8.05) 175.5 57.0(5.04) 64.5(3.83，3.71)E40122.2(9.07) 175.9 58.2(3.86) 30.2(1.96，1.75) Cγ36.9(2.20)E41122.3(10.22) 177.2 60.9(4.25) 27.7(2.13，1.98) Cγ35.6(2.37)N42116.4(7.67) 176.9 56.7(4.52) 38.8(2.68)I43117.6(6.99) 176.2 58.9(4.52) 38.3(1.58)Cγm20.7(1.05)；Cδ14.6(0.92)D44126.2(8.38) 179.6 57.6(4.59) 39.1(2.85)F45123.8(8.40) 176.5 60.2(4.37) 39.0(2.98，2.50) Cδ-(6.67)W46122.3(7.98) 177.7 64.9(4.39) 29.9(3.78，3.21) Nε113O.7(10.68)；Cζ2115.1(7.25)；Cη2125.8(7.01)；Cζ3122.9(7.01)；Cε3119.9(7.35)I47118.2(9.04) 178.4 65.1(3.37) 38.6(2.02)Cγm17.0(0.95)；Cγ29.4(2.24，1.46)；Cδ14.3(1.07)S48117.4(7.91) 176.6 62.8(4.22)-(3.89，3.67)C49120.4(7.53) 179.6 64.0(3.90)-(3.61)E50120.1(7.39) 179.1 58.8(3.58)29.0(1.65) Cγ35.2(-)E51118.3(7.93) 180.0 59.0(3.84)29.7(2.21，1.95) Cγ36.3(2.15)Y52123.0(8.11) 175.6 61.2(3.95)38.7(3.30，2.95) Cδ-(7.03)；Cε118.5(7.15)K53112.6(7.43) 177.1 58.2(3.89)32.2(1.86，1.76) Cγ-(1.54，1.39)K54117.5(7.18) 176.9 56.1(4.17)33.1(1.98，1.71) Cγ25.4(-)；Cδ29.4(1.60)；Cε42.2(-)I55123.1(739)176.8 64.0(3.58)37.2(1.74) Cγm19.4(0.75)；Cγ23.3(0.35)K56126.5(8.39) 176.7 56.3(4.34)33.6(1.95，1.72) Cγ24.6(1.40)；Cδ28.7(1.64)；Cε42.1(3.00)S57116.2(7.35)- 54.6(4.98)64.0(3.79)P58 -(-) 178.8 65.0(4.19)32.1(2.45，2.06) Cγ27.5(2.17，2.06)；Cδ51.4(4.11，3.98)S59112.3(8.15) 175.5 60.5(4.32)62.7(3.90)K60119.7(7.77) 177.6 56.3(4.36)33.2(2.03，1.89) Cγ25.7(-)；Cδ29.0(-)；Cε42.4(-)L61120.4(7.49) 178.5 58.7(4.12)41.3(1.82，1.71) Cγ26.8(1.67)；Cδ25.9(0.74)；23.2(0.35)S62112.7(8.67) - 64.0(4.38)60.8(4.08)P63 -(-)180.0 66.0(4.39)30.8(2.42，1.95)K64118.0(7.08) 178.0 57.9(4.36)31.9(2.26)A65122.5(9.23) 179.9 55.5(4.19)17.7(1.76)K66116.9(8.40) 178.4 60.2(3.99)32.4(1.93) Cγ25.8(1.43)；Cδ29.2(1.68)；Cε42.1(3.00)K67119.5(7.52) 179.6 59.9(4.14)32.7(2.09) Cγ25.2(1.66，1.52)I68120.9(8.24) 178.4 65.9(3.87)38.3(2.08)) Cγm18.3(0.93)；Cδ-0.30Y69120.8(9.15) 178.6 62.4(3.99)39.5(3.52，3.26) Cδ133.4(7.07)；Cε117.9(6.78)N70117.5(8.77) 176.0 55.7(4.42)38.4(2.99，2.78) Nγ112.0(7.59，6.97)E71118.4(7.88) 176.4 58.8(4.00)30.6(1.76，1.37) Cγ35.9(1.80，1.09)
表1(续)F72110.4(7.76) 175.1 58.5(4.95) 43.4(2.77)Cδ133.6(7.75)；Cε133.1(7.19)；Cζ-(6.89)I73116.5(7.59) 175.3 61.3(4.05) 38.0(1.59)Cγ27.2(1.43，1.03)；Cγm18.5(0.79)；Cδ12.0(0.76)S74113.4(7.43) 174.6 57.7(3.89) 64.1(3.44)V75120.6(8.20) 177.1 64.4(3.99) 31.392.18)Cγ20.3(1.02)；21.1(1.02)Q76118.6(8.10) 175.4 55.7(4.29) 28.2(2.23，1.87) Cγ34.6(2.30)A77124.1(7.54) 178.7 52.8(4.11) 18.8(1.10)T78114.8(7.99) 175.6 64.0(4.05) 68.8(4.11)Cγ22.6(1.27)K79123.8(7.89) 173.4 54.6(4.47) 33.1(1.76，139) Cγ25.2(1.27)；Cδ29.7(1.64，1.51)；Cε42.0(2.84)E80117.8(7.16) 176.2 56.6(3.97) 30.0(1.82)Cγ34.5(2.69，2.19)V81119.3(8.22) 176.3 59.5(4.56) 33.4(2.01)Cγ22.5(0.89)；17.5(0.34)N82122.5(9.09) 173.7 53.2(4.64) 37.5(2.89，2.63)L83122.7(7.43) 176.1 53.1(4.52) 46.3(1.49，1.34) Cγ26.4(-)；Cδ24.3(0.94)-(0.73)D84120.3(8.27) 176.3 53.2(4.66) 41.7(3.03，2.79)S85116.6(8.93) 176.7 62.5(4.00) -(4.01)C86121.4(8.36) 177.9 62.4(4.30) 26.1(3.07)T87120.2(8.35) 178.5 67.0(4.06) 67.0(4.06)Cγ22.7(1.22)R88125.5(8.55) 178.2 61.6(3.73) 29.9(1.98，1.91) Cγ-(1.51，1.67)；Cδ43.3(3.10)E89121.1(849)179.5 59.6(4.21) 29.2(2.17，2.08) Cγ36.2(2.39)E90121.2(8.44) 178.5 59.5(4.01) 29.4(2.17)Cγ35.6(2.40)T91115.1(8.10) 175.8 67.8(3.91) 68.4(4.42)Cγ22.3(1.43)S92116.6(8.32) 176.6 62.4(3.90) 62.7(4.09，3.99)R93122.3(7.84) 179.6 59.3(4.05) 29.9(1.95，1.91) Cγ27.9(1.82，1.60)；Cδ43.5(3.23)N94121.6(8.10) 176.7 54.9(4.33) 38.6(3.18)M95115.7(7.40) 176.9 55.1(4.07) 31.3(1.83，1.77) Cγ31.7(2.29，1.94)；Cε15.3(1.67)L96119.8(7.29) 178.4 57.7(4.02) 41.5(1.80，1.55) Cγ27.0(1.80)；Cδ23.0(0.85)；24.8(0.95)E97116.6(7.20) - 53.8(4.52) 30.1(1.92，185) Cγ36.1(2.10)P98 -(-) 176.9 64.4(4.34) 32.1(2.26，1.93) Cγ27.9(2.08)；Cδ49.9(3.59)T99113.7(8.43) 179.1 59.6(4.79) 72.5(4.60)Cγ21.1(1.30)I100 123.2(9.19) 176.1 63.2(4.22) 39.6(1.97)Cγm19.1(1.04)；Cγ28.5(1.47，1.39)；Cδ14.8(0.90)T101 109.8(7.61) 176.2 61.5(4.57) 69.3(4.63)Cγ21.7(1.20)C102 122.7(7.48) 174.5 62.6(3.85) 28.9 (3.15，2.31)F103 112.8(8.78) 175.2 57.8(4.95) 40.7(3.71，2.57) Cδ-(6.76)D104 122.0(7.72) 179.1 58.9(4.28) 39.8(2.82，2.59)E105 119.9(8.75) 175.0 59.4(4.16) 28.6(2.44，2.12) Cγ35.9(2.42)A106 122.9(8.66) 178.8 55.4(4.03) 18.6(1.65)Q107 118.7(9.58) 178.3 60.3(3.90) 27.9(-) Cγ35.2(-)K108 120.1(8.11) 179.3 59.6(4.21) 32.4(2.18，2.02) Cγ25.2(1.46)；Cδ29.8(1.69)；Cε42.2(3.00)K109 118.8(8.08) 180.4 59.0(4.27) 31.8(2.22，2.04) Cγ24.9(1.44)；Cδ29.1(1.71，1.81)；Cε42.0(3.00)I110 121.3(8.30) 177.9 61.5(4.22) 36.0(2.44)Cγ29.0(2.06，1.43)；Cγm 19.6(1.38)；Cδ10.0(0.76)F111 124.5(9.22) 176.8 63.2(3.80) 39.2(3.51.3.21) Cδ131.9(6.87)；Cε-(7.04)
表1(续)N112 117.2(8.51) 177.5 56.3(4.50) 38.6(3.08，2.90)L113 121.5(7.95) 180.3 58.3(4.21) 42.3(1.99) Cγ27.1(1.83)；Cδ24.9(1.06)M114 118.6(8.22) 177.0 60.0(4.28) 35.0(1.82，1.68) Cγ32.0(2.38，2.26)；Cε15.9(1.73)E115 120.2(8.46) 177.3 60.4(3.49) 29.6(1.58) Cγ37.3(2.07)K116 113.5(7.57) 176.9 57.5(4.26) 33.1(1.98) Cγ24.7(1.59)；Cδ29.5(1.72)；Cε42.3(3.04)D117 116.6(7.62) 176.6 55.8(5.08) 42.8(2.92，2.84)S118 117.2(8.45) 176.2 63.0(4.52) 63.6(4.33，4.02)Y119 121.8(8.95) 175.5 6O.4(4.27) 39.2(2.81，2.00) Cδ-(6.72)；Cε117.2(6.58)R120 114.4(7.11) 179.8 58.3(3.52) 28.7(1.961.80) Cγ27.0(1.87，1.64)Cδ42.9(3.16，3.10)R121 117.5(7.63) 179.4 59.6(3.9730.3(2.07) Cδ43.1(-)F122 124.0(8.57) 178.4 60.0(3.32) 38.3(2.89，2.76) Cδ-(6.77)L123 117.7(7.05) 176.3 56.3(3.27) 41.4(1.11，1.06) Cγ25.6(1.31)；Cδ25.2(0.32)；19.6(-0.09)K124 114.3(6.72) 175.5 54.8(4.42) 33.0(2.09，1.63) Cγ24.8(1.46)；Cδ28.9(1.70)；Cε42.2(2.97)S125 118.2(7.83) 175.6 57.9(4.79) 67.1(4.52)R126 121.1(9.39) 176.5 58.2(3.92) 28.4(1.81) Cγ25.5(1.60，1.43)；Cδ42.5(3.05，2.97)F127 115.5(7.47) 176.06 60.7(4.21) 39.5(3.42，3.27) Cδ-(7.18)Y128 114.2(6.68) 177.2 59.3(4.40) 39.8(2.39) Cδ133.0(7.17)；Cε117.6(6.91)L129 116.8(8.34) 180.4 57.6(3.71) 41.7(1.41，1.37) Cγ26.8(1.76)；Cδ25.6(0.74)；22.4(0.89)D130 119.0(8.61) 177.8 56.8(4.38) 39.8(2.63)L131 117.5(7.46) 177.8 55.7(4.18) 42.1(1.83，1.43) Cγ22.9(1.27)；Cδ22.4(0.94)；22.6(0.33)T132 108.3(7.24) 173.9 61.6(4.26) 70.1(4.09) Cγ21.6(0.73)N133 119.8(7.60) 173.0 51.3(4.95) 38.8(2.78，2.62)P134 -(-) 177.4 63.7(4.43) 32.1(2.27，1.96) Cγ27.2(1.97)；Cδ50.6(3.67，3.50)S135 115.5(8.32) 174.9 58.8(4.44) 63.7(4.42，3.88)S136 117.6(8.22) 174.7 58.5(4.47) 63.8(3.90，3.13)C137 120.7(8.27) 175.1 58.7(4.55) 28.1(2.95)G138 111.5(8.43) 173.8 45.4(3.96) -(-)A139 124.0(8.10) 178.0 52.6(4.30) 19.4(1.43)E140 120.0(8.48) 176.8 57.0(4.22) 30.0(2.01) Cγ36.2(2.28)K141 122.1(8.23) 176.7 56.5(4.27) 32.9(1.80) Cγ24.9(1.44)；Cδ29.0(1.71)；Cε42.2(3.00)Q142 121.1(8.27) 173.1 55.0(4.16) 33.1(2.21) Cγ30.9(2.64)K143 120.7(8.27) 176.3 56.7(4.42) 30.8(1.92，1.86) Cγ24.7(-)；Cδ27.1(1.71)；Cε43.5(3.25)G144 111.1(8.57) 176.1 45.4(3.97) -(-)A145 124.0(8.15) 177.9 52.7(4.30) 19.5(1.43)K146 120.9(8.35) 179.9 56.3(4.35) 33.1(1.81，1.45) Cγ24.8(1.46)；Cδ29.1(1.71，1.84)；Cε42.2(3.01)S147 1173(8.39) 174.8 58.2(3.94) 64.1(4.50，3.90)S148 118.3(8.39) 174.5 58.5(4.47) 63.9(3.90)A149 125.7(8.30) 177.5 52.8(4.29) 19.3(1.38)D150 119.3(8.18) 176.5 54.4(4.61) 41.2(2.70)C151 119.8(8.28) 175.1 58.8(4.58) 27.9(2.98)T152 116.4(8.28) 174.7 62.5(4.33) 69.7(4.27) Cγ21.7(1.24)S153 118.0(8.20) 174.2 58.4(4.47) 63.8(3.93，3.87)L154 124.3(8.18) 177.0 55.2(4.37) 42.4(1.61) Cγ27.0(1.61)；Cδ23.5(0.86)；24.9(0.90)V155 122.4(8.01) 174.4 59.9(4.39) 32.6(2.06) Cγ21.0(0.94)；20.4(0.94)
表1(续)P156 -(-) 177.0 63.3(4.39)32.2(2.30，1.90) Cγ27.5(2.03，1.94)；Cδ51.1(3.86，3.69)Q157 120.9(8.49) 176.1 56.1(4.29)29.5(2.06，2.00) Cγ33.9(2.41)C158 120.2(8.31) 174.1 58.2(4.45)28.2(2.88)A159 1263(8.32) 177.3 52.6(4.25)19.3(1.30)H160 117.9(8.24) 55.5(4.62) 29.8(3.15，3.06)Cδ119.5(7.13)表S1脚注a在每栏中，首先列出15N和13C位移，然后在括号中给出相应的1H位移。相对于3-(三甲基甲硅烷基)丙-d4酸报告1H和13C化学位移，相对于外部液体NH3报告15N位移。
表2游离RGS4的约束最小化NMR坐标第41-69页此中的结构坐标登录于Brookhaven蛋白质数据库(Brookhaven ProteinDatabase)。
(Brookhaven National Laboratory)登录号(Deposit No.)＿＿
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130 135 140Ala Lys Ser Ser Ala Asp Cys Thr Ser Leu Val Pro Gln Cys Ala His145 150 155 160His His His His His His Pro16权利要求
1.一种RGS蛋白或其部分的三维溶液结构的表示，所述表示运用RGS4-核心蛋白的结构坐标产生。
2.权利要求1的表示，所述表示是一种RGS亚家族B蛋白的表示。
3.权利要求1的表示，所述表示是一种RGS4的表示。
4.权利要求1的表示，所述表示是大鼠RGS4的表示。
5.权利要求1的表示，所述表示是一种RGS蛋白Gα结合部位的表示。
6.权利要求1的表示，所述表示是一种RGS蛋白α6-α7区的表示。
7.权利要求1的表示，所述表示是一种RGS蛋白α1-α2区中的变构结合部位的表示。
8.权利要求1的表示，所述表示包含RGS蛋白的完整核心区。
9.权利要求1的表示，所述表示运用通过NMR波谱法测定的RGS4-核心蛋白的结构坐标来产生。
10.一种鉴定、选择或设计作为RGS活性、RGS结合或RGS-Gα复合体活性的激动剂或拮抗剂的化学或生化种类的方法，所述方法包括下述步骤(a)研究一种或多种化学或生化试验种类与RGS4蛋白或其部分的三维溶液结构的相互作用；且(b)选择根据其与RGS4的三维结构相互作用预测作为RGS蛋白的激动剂或拮抗剂的化学或生化试验种类，从而鉴定、选择或设计所述激动剂或拮抗剂。
11.权利要求10的方法，其中所述激动剂或拮抗剂基于其与游离RGS4蛋白的Gα结合部位预测的相互作用来鉴定、选择或设计。
12.权利要求10的方法，其中所述激动剂或拮抗剂基于其与游离RGS蛋白的变构结合部位预测的相互作用来鉴定、选择或设计。
13.权利要求12的方法，其中所述变构结合部位位于游离RGS4蛋白的α1-α2区中。
14.权利要求10的方法，其中所述激动剂或拮抗剂基于其与游离RGS4蛋白的α6-α7区预测的相互作用来鉴定、选择或设计。
15.权利要求10的方法，其中所述试验种类选自小有机分子。
16.权利要求10的方法，所述方法还包括下述步骤(a)获得所述所选试验种类，且(b)测定所述试验种类，以测量其作为RGS活性、RGS结合或RGS-Gα复合体活性的激动剂或拮抗剂的活性。
17.一种激动剂或拮抗剂，所述激动剂或拮抗剂通过权利要求10的方法鉴定、选择或设计。
18.一种鉴定抑制RGS活性、RGS结合或RGS-Gα复合体活性的物质的方法，所述方法包括运用RGS4的三维溶液结构表示测定候选种类和游离RGS结构之间相互作用的步骤。
19.一种鉴定模拟或促进RGS活性、RGS结合或RGS-Gα复合体活性的物质的方法，所述方法包括测定候选种类和游离RGS4的三维结构表示之间相互作用的步骤。
20.一种通过合理药物设计鉴定RGS活性、RGS结合或RGS4/Gα复合体活性的拮抗剂或激动剂的方法，所述方法包括下述步骤(a)基于游离RGS4的NMR结构坐标，设计将会与RGS4 Gα结合部位中的一个或多个氨基酸形成可逆或不可逆键的潜在拮抗剂或激动剂；(b)合成或用其它方法获得所述拮抗剂或激动剂；且(c)测定所述潜在拮抗剂或激动剂是否抑制或促进RGS或RGS4/Gα复合体的活性。
21.权利要求20的方法，其中设计所述拮抗剂或激动剂，使其与所述RGS4 Gα结合部位中的所述一个或多个氨基酸的一个或多个原子相互作用，并且其中所述一个或多个氨基酸选自D117、S118或R121。
22.权利要求20的方法，其中所述氨基酸选自S39、E41、N42、L113、D117、S118、R121或N82。
23.一种通过合理药物设计鉴定RGS活性、RGS结合或RGS4/Gα复合体活性的拮抗剂或激动剂的方法，所述方法包括下述步骤(a)基于游离RGS4的NMR结构坐标，设计将会与RGS α1-α2区的变构结合部位中的一个或多个氨基酸形成可逆或不可逆键的潜在拮抗剂或激动剂；(b)合成或用其它方法获得所述拮抗剂或激动剂；且(c)测定所述潜在拮抗剂或激动剂是否抑制或促进RGS或RGS4/Gα复合体的活性。
24.权利要求23的方法，其中设计所述拮抗剂或激动剂，使其与所述变构结合部位中的所述一个或多个氨基酸的一个或多个原子相互作用，并且其中所述一个或多个原子选自RGS残基V10、W13、L17、120、H23、E24、C25和T132。
25.一种通过权利要求23的方法鉴定的激动剂或拮抗剂。
26.一种通过合理药物设计鉴定RGS活性、RGS结合或RGS4/Gα复合体活性的拮抗剂或激动剂的方法，所述方法包括下述步骤(a)设计将会与RGS4α6-α7区中的一个或多个氨基酸形成可逆或不可逆键的潜在拮抗剂或激动剂；(b)合成或用其它方法获得所述拮抗剂或激动剂；且(c)测定所述潜在拮抗剂或激动剂是否抑制或促进RGS或RGS4-Gα复合体的活性。
27.权利要求26的方法，其中所述拮抗剂或激动剂活性采用酶测定来评价。
28.一种通过合理药物设计鉴定RGS活性、RGS结合或RGS-Gα复合体活性的潜在拮抗剂或激动剂的方法，所述方法包括下述步骤(a)提供游离RGS的三维结构；(b)使用步骤(a)中的三维结构，设计或选择一种潜在拮抗剂或激动剂；且(c)合成或用其它方法获得所述潜在拮抗剂或激动剂。
29.权利要求28的方法，所述方法还包括测试所述潜在拮抗剂或激动剂作为RGS活性、RGS结合或RGS-Gα复合体活性的拮抗剂或激动剂的生物活性的步骤。
30.权利要求28的方法，其中所述步骤(a)中的三维结构是由依照表2的RGS4-核心蛋白的相对结构坐标±与RGS4-核心氨基酸的保守主链原子不超过1.5的均方根差所限定的游离RGS4的三维结构。
31.一种通过权利要求28的方法鉴定的激动剂或拮抗剂。
32.权利要求28的方法，其中所述步骤(a)中的三维结构是除RGS4以外的RGS蛋白的三维结构，并且其中运用依照表2的RGS4-核心蛋白的相对结构坐标±与RGS4-核心氨基酸的保守主链原子不超过1.5的均方根差，通过分子置换分析或同源性建模技术，获得所述除RGS4以外的RGS蛋白的三维结构。
33.权利要求32的方法，其中所述除RGS4以外的RGS蛋白是一种RGS亚家族B蛋白。
34.权利要求28的方法，其中使用所述三维结构设计或选择所述潜在抑制剂的步骤包括下述步骤(a)鉴定能够与RGS4蛋白结合的化学或生化种类或其片段；且(b)将所述经鉴定的化学实体或片段装配成单个分子，以提供一种潜在抑制剂的结构。
35.权利要求34的方法，其中步骤(a)中所述能够与游离RGS-核心的Gα结合部位结合的化学或生化种类或其片段是一种蛋白质。
36.权利要求34的方法，其中鉴定步骤(a)中所述能够与游离RGS核心蛋白的α1-α2区中的变构结合部位结合的化学或生化种类或其片段。
37.权利要求34的方法，其中鉴定步骤(a)中所述能够与游离RGS核心蛋白的α6-α7区结合的化学或生化种类或其片段。
38.权利要求34的方法，所述方法还包括测试步骤(b)中设计或选择的潜在抑制剂作为RGS蛋白的拮抗剂或激动剂的步骤。
39.一种通过权利要求34的方法鉴定的激动剂或拮抗剂。
40.一种鉴定RGS4突变体的方法，其中所述衍生物的生物活性与RGS4的生物活性不同，所述方法包括下述步骤(a)根据游离RGS4的三维结构鉴定RGS4蛋白中参与所述蛋白质调节G蛋白信号的功能的氨基酸残基；(b)修饰步骤(a)中鉴定的所述RGS4氨基酸残基中的一个或多个，以产生所述RGS4的衍生物。
41.权利要求40的方法，其中RGS4的所述氨基酸残基通过RGS4编码序列的定点诱变而被修饰，此后从所述经诱变的RGS4编码序列表达所述衍生RGS4蛋白。
42.权利要求40的方法，其中所述经修饰的氨基酸位于RGS4的Gα结合部位中。
43.权利要求40的方法，其中所述经修饰的氨基酸位于RGS4的变构结合部位中。
44.权利要求40的方法，其中所述经修饰的氨基酸位于RGS4的α6-α7区中。
45.一种鉴定RGS蛋白的潜在激动剂和拮抗剂的方法，所述方法包括下述步骤(a)通过检测在与RGS4潜在结合的化学和生化种类存在和不存在下RGS4核心蛋白的NMR谱中的NMR共振微扰，鉴定RGS结合部位；(a)使用步骤(b)中鉴定的游离RGS4结合部位的三维结构，选择或设计预测在所述结合部位结合的化学或生化种类；(a)测试所述预测在所述结合部位结合、作为RGS活性或RGS-Gα复合体活性的拮抗剂或激动剂的化学或生化种类。
全文摘要
本发明提供采用NMR技术测定的游离RGS4溶液结构。所述结构包括Gα结合部位和变构结合部位。可以用所提供的结构信息鉴定、选择或设计RGS4活性的激动剂和拮抗剂。本发明包括可用于所述方法中、基于所提供的结构坐标的游离RGS4结构的二维和三维模型和表示。
文档编号G01N33/48GK1440421SQ01812479
公开日2003年9月3日 申请日期2001年5月9日 优先权日2000年5月11日
发明者R·鲍尔斯, F·莫伊, P·K·钱达, M·I·科克特, P·琼斯, K·马森, S·赛穆斯, K·H·杨, D·许伊 申请人:惠氏公司