专利名称：检测肿瘤细胞的存在及筛选抗肿瘤剂的方法
本申请要求Xuri LI等于2000年5月17日提请的未决的美国临时专利申请60/204,748的优先权。
哺乳动物脉管系统的两种主要组成成分是内皮细胞和平滑肌细胞。内皮细胞形成哺乳动物所有血管和淋巴管的内表面。新血管的形成可通过两种不同过程发生，血管发生(vasculogenesis)或血管生成(angiogenesis)(参见Risau，W.，自然386671-674(1997))。血管发生特征在于内皮细胞前体原位分化为成熟内皮细胞及这些细胞的相结合形成血管，如发生在早期胚胎初级血管丛的形成中。相反，血管生成，通过预先存在的脉管的生长及分支形成血管，在胚胎生长后期是重要的，且负责成体中发生的血管生长。血管生成是一种复杂生理过程，包括内皮细胞增殖，胞外基质降解，血管分支，及随后的细胞粘附。在成体中，在正常环境下血管生成被紧密控制并限制在雌性生殖系统中。然而血管生成可在组织损伤的情况下激活。另外实体肿瘤也能诱导周围组织中血管生成，因此维持肿瘤生长及促进肿瘤转移的形成(Folkman，J.，自然医学127-31，(1995))。复杂的血管生成的分子机制还远未了解。
血管生成还参与许多病理情况，其在疾病的不同后遗症中起作用或直接参与其中。一些血管生成例如包括与各种肝脏疾病相关的新血管生成，糖尿病的新血管生成后遗症，高血压的新血管生成后遗症，外伤后的新血管生成，由于头部外伤所致新血管生成，慢性肝脏感染(如慢性肝炎)中的新血管生成，由于烫伤或冻伤所致的新血管生成，与激素过量相关的功能异常，血管瘤的产生及血管成形术后的再狭窄。在关节炎中，新的毛细管侵袭关节并破坏关节软骨。在糖尿病中，视网膜内的新毛细管侵袭玻璃体，导致出血和失明(Folkman，J.和Shing，Y.，J.生物化学26710931-10934(1992))。血管生成因子在这些和其它疾病中的作用还未明确确定。
由于血管生成在如此多的生理和病理过程中的重要作用，参与控制血管生成的因子已经深入研究。许多生长因子已示出可调节血管生成；这些因子包括成纤维细胞生长因子(FGFs)，血小板衍生的生长因子(PDGF)，转化生长因子α(TGFα)，和肝细胞生长因子(HGF)。见例如Folkman等，生物化学杂志26710931-10934(1992)所述。
已提示内皮细胞特异性生长因子的特殊家族—血管内皮生长因子(VEGFs)，及其相应的受体，主要负责内皮细胞生长和分化的刺激，以及分化的细胞的一些功能。这些因子是PDGF/VEGF家族的成员，并呈现通过内皮受体酪氨酸激酶(RTKs)起作用。生长因子的PDGF/VEGF家族属于生长因子胱氨酸结超家族，该超家族还包括神经营养因子和转化生长因子β。
在PDGF/VEGF家族中已鉴别8种不同的蛋白质，有2种PDGF(A和B)，VEGF和5种与VEGF密切相关的成员。这5种与VEGF密切相关的成员是VEGF-B，见于Ludwig癌症研究所和Helsinki大学的国际专利申请PCT/US96/02957(WO 96/26736)和美国专利5840693及5607918所述；VEGF-C或VEGF2，见于Joukov等，EMBO杂志15290-298(1996)，Lee等，美国科学院院报931988-1992，和人体基因组科学有限公司的美国专利5932540和5935540所述；VEGF-D，见于国际专利申请No.PCT/US97/14696(WO 98/07832)，和Achen等，美国科学院院报95548-553(1998)所述；胎盘生长因子(P1GF)，见于Maglione等，美国科学院院报889267-9271(1991)；和VEGF3，见于人体基因组科学有限公司的国际专利申请No.PCT/US95/07283(WO 96/39421)所述。每个VEGF家族成员与VEGF有30％-45％的氨基酸序列相同性。VEGF家族成员共同具有一个VEGF同源结构域，该结构域含有形成胱氨酸—结基序的8个半胱氨酸残基。在它们的活性生理状态，所述蛋白质是在八个半胱氨酸残基通过二硫键(分子内或分子间键)形成的二聚体。VEGF家族的功能特点包括改变内皮细胞和相关细胞的促分裂原性，诱导血管通透性及血管生成和淋巴管生成性。
血管内皮生长因子(VEGF)是一种同二聚体糖蛋白，其已从若干种来源分离出。VEGF在胚胎血管发生期间的新血管形成中及在成体生活期间的血管发生中具有重要的调节作用(Carmeliet等，自然380435-439，(1996)；Ferrara等，自然380439-442，(1996)；参见Ferrara和Davis-Smyth，内分泌研究184-25，(1997))。VEGF发挥的作用的重要性已经在研究中证实，研究显示失活一个单VEGF等位基因导致胚胎死亡，这归因子脉管不能发育(Carmeliet等，自然380435-439，(1996)；Ferrara等，自然380439-442，(1996))。VEGF的分离和性质参见Ferrara等，细胞生物化学杂志47211-218，(1991)和Connolly，细胞生物化学杂志47219-223，(1991)。
另外，VEGF对单核细胞具有强趋化性，可以在内皮细胞中诱导血纤维蛋白溶酶原激活剂和血纤维蛋白溶酶原激活剂抑制剂，而且还可以诱导微血管通透性。由于后一活性，其有时也称为血管通透性因子(VPF)。VEGF对某些造血细胞也具有趋化性。近来的文献表明VEGF阻断树状细胞成熟，并从而降低对肿瘤的免疫应答的效力(许多肿瘤分泌VEGF)(Gabrilovich等，血液924150-4166，(1998)；Gabrilovich等，临床癌症研究52963-2970，(1999))。
血管内皮生长因子B(VEGF-B)是一种非糖基化的，高碱性生长因子。VEGF-B具有相似于VEGF的血管发生和其它性质，但其在组织中的分布和表达不同于VEGF。具体地，VEGF-B在心脏中强烈表达，而且在肺中只微弱表达，而VEGF正相反(Olofsson，B.等，美国科学院院报932576-2581(1996))。RT-PCR分析已经证实VEGFB mRNA存在于黑素瘤，正常皮肤和肌肉中。这提示VEGF和VEGF-B尽管在许多组织中共同表达，但它们的功能可能不同。基因定向研究示出VEGF-B缺乏会导致温和的心脏病表型，并损伤冠状动脉(Bellomo等，心血管研究86E29-35(2000))。
人VEGF-B是使用酵母共杂交相互作用诱捕筛选方法分离的，通过筛选可以与I型细胞视黄酸结合蛋白(CRABP-1)相互作用的细胞蛋白而分离。对人和小鼠VEGF-B包括核苷酸和氨基酸序列的分离和定性详见于Ludwig癌症研究所和赫尔辛基大学的PCT/US96/02957，美国专利5,840,693和5,607,918，及Olofsson等，美国科学院院报932576-2581(1996)所述。国际专利申请PCT/US97/14696(WO 98/07832)，美国专利No.5,840,693和美国专利5,607,918在此以其全文并入参考。
小鼠和人的VEGF-B基因几乎是相同的，且均跨越大约4kb的DNA。此基因由7个外显子组成，且它们的外显子—内含子组构类似于VEGF和P1GF基因(Grimmond等，基因组研究6124-131(1996)；Olofsson等，生物化学杂志27119310-19317(1996)Townson等，生物化学生物生理学研究综述220922-928(1996))。
VEGF-C是从PC-3前列腺腺瘤细胞系(CRL1435)的条件培养基中分离的，通过筛选所述培养基产生内皮细胞特异性受体酪氨酸激酶VEGFR-3(Flt4)的酪氨酸磷酸化的能力进行分离，使用转染而表达VEGFR-3的细胞。VEGF-C是用重组VEGFR-3通过亲和层析纯化的，而且从PC-3 cDNA文库中克隆到。其分离和定性详见于Joukov等，EMBO杂志15290-298，(1996)。
VEGF-D是从商购自Clontech的人乳腺cDNA文库中分离的，通过用得自称为“Soares Breast 3NbHBst”的人cDNA文库的一个表达序列标记作杂交探针进行筛选而分离到(Achen等，美国科学院院报95548-553，(1998))。其分离和定性详见于国际专利申请PCT/US97/14696(WO98/07832)所述。在PCT/US97/14696中，也阐述了VEGF-D的生物活性片段的分离。这个片段由VEGF-D的第93-201位氨基酸残基组成。
所述VEGF-D基因在成人中广泛表达，但不是遍在表达的。VEGF-D在心脏，肺和骨骼肌中强烈表达。VEGF-D在脾，卵巢，小肠和结肠中中等水平表达，在肾，胰腺，胸腺，前列腺和睾丸中低水平表达。在来自脑，胎盘，肝或周围血白细胞的RNA中检测不到VEGF-D mRNA。
P1GF是从一个胎盘cDNA文库中分离的。其分离和定性详见于Maglione等，美国科学院院报889267-9271，(1991)所述。目前其生物学功能还不十分清楚。
VEGF3是从衍生自结肠组织的一个cDNA文库中分离的。据信VEGF3与VEGF具有大约36％的相同性和大约66％相似性。分离编码VEGF3的基因的方法还不清楚，而且未揭示其生物活性的鉴定。
两个蛋白质之间的相似性是通过将一个蛋白质的氨基酸序列和保守氨基酸取代与另一个蛋白质的序列对比确定的，而相同性是不包括保守氨基酸取代而对比确定的。
如上所述，PDGF/VEGF家族成员主要通过结合受体酪氨酸激酶起作用。通常地，受体酪氨酸激酶是糖蛋白，其由能结合一种特异性生长因子的一个胞外结构域，通常是所述蛋白质的α螺旋部分的一个跨膜结构域，一个近膜结构域(在此处所述受体可例如通过蛋白质磷酸化调节)，作为所述受体的酶成分的一个酪氨酸激酶结构域，及一个羧基末端尾部(其在许多受体中参与识别和结合酪氨酸激酶底物)组成。
已经鉴别了五种内皮细胞特异性受体酪氨酸激酶，属于两种独特的亚类三种血管内皮细胞生长因子受体，VEGFR-1(Flt-1)，VEGFR-2(KDR/Flk-1)，VEGFR-3(Flt4)，和两种Tie家族受体，Tie和Tie-2(Tek)。这些受体的特异性和亲和性不同。所有这些均具有固有的酪氨酸激酶活性，这是信号转导所必需的。
已知结合VEGFs的最好的受体酪氨酸激酶是VEGFR-1，VEGFR-2和VEGFR-3。VEGFR-1和VEGFR-2与VEGF高亲和性结合，VEGFR-1还结合P1GF。VEGF-B与VEGFR-1高亲和性结合，但与VEGFR-2或-3不结合(Olofsson等，美国科学院院报9511709-11714(1998))。VEGF-C已经示出是VEGFR-3的配体，而且其还激活VEGFR-2(Joukov等，EMBO杂志15290-298(1996))。VEGF-D结合VEGFR-2和VEGFR-3(Achen等，美国科学院院报95548-553(1998))。Tek/Tie-2的配体见于Regeneron药品公司的国际专利申请PCT/US95/12935(WO 96/11269)所述。Tie的配体还未鉴别。
近来，已纯化和克隆了一种新的130-135kDa的VEGF同种型特异性受体(Soker等，细胞92735-745(1998))。发现VEGF受体通过外显子7编码的序列特异地结合VEGF165，其示出与肝素的微弱亲和性(Soker等，细胞92735-745(1998))。令人惊奇地，此受体示出与人neuropilin-1(NP-1)相同，NP-1是一种参与早期神经形态发生中的一种受体。P1GF-2也呈现与NP-1相互作用(Migdal等，生物化学杂志27322272-22278(1998))。
VEGFR-1，VEGFR-2和VEGFR-3是通过内皮细胞不同表达的。通常地，VEGFR-1和VEGFR-2均在血管内皮中表达(Oelrichs等，癌基因811-18(1992)；Kaipainen等，实验方法杂志1782077-2088(1993)；Dumont等，Dev.Dyn.20380-92(1995)；Fong等，Dev.Dyn.2071-10(1996))，VEGFR-3主要在成体组织的淋巴内皮中表达(Kaipainen等，美国科学院院报93566-3570(1995))。VEGFR-3还在肿瘤周围的血管中表达。
尽管VEGFR-1在发育期间主要在内皮细胞中表达，但在胚胎发生的早期阶段也发现其在造血前体细胞中(Fong等，自然37666-70(1995))。在成体中，单核细胞和巨噬细胞也表达此受体(Barleon等，血液873365-3343(1995))。在胚胎中，VEGFR-1由大多数血管表达(Breier等，Dev.Dyn.204228-239(1995)；Fong等，Dev.Dyn.2071-10(1996))。
自鉴别和定性VEGF以来，针对于血管发生因子的活性和新因子的阐述有许多重要发现。早期发现示出血管发生是正常发育和生理学所必需的。如胚胎发育，创伤修复，和黄体形成等过程，均包含血管发生和血管发生因子。例如在创伤修复期间，VEGF mRNA水平提高提示VEGF表达和修复过程之间的直接关系。同样，VEGF调节中的失常可以与创伤修复失调相关(Frank，S.，等生物化学杂志270512607-12613(1995))。
另一个重要发现涉及血管发生与肿瘤发生之间的关联。肿瘤生长和转移是血管发生依赖性过程(Folkman，J.和Shing，Y.，生物化学杂志26710931-10934(1992))。例如，当将肿瘤细胞导入动物时，VEGF mRNA的表达模式表明在坏死的肿瘤生长区域外周的细胞中最高水平表达。在这些区域中鉴别了许多血管。VEGF在这些区域中的表达提示低氧血症，一种氧化不足的状态，引发坏死肿瘤中VEGF表达和释放。VEGF-B的表达也与肿瘤生长直接关联(见美国专利No.5,840,693)。VEGF-B表达在肿瘤相关的巨噬细胞中尤其是正调节的，在卵巢上皮肿瘤中也是这样(Sowter等，实验室研究77607-14，(1997))。VEGF-B mRNA可以在在大多数研究的肿瘤细胞系中检测到，包括腺癌，乳腺癌，淋巴瘤，鳞状上皮细胞癌，黑素瘤，纤维肉瘤和许旺氏细胞瘤(Schwannoma)(Salven等，Am J Pathol.153103-8(1998))。
已经示出VEGF/PDGF家族成员产生不同的转录物。已经示出VEGF由于可变剪接而展示不同的转录物。人VEGF基因具有5种不同的mRNA种类(Neufeld等，FASEB杂志139-22(1999))，产生分子量和生物学性质不同的蛋白质(Carmeliet，P.，自然医学6389-395(2000))。VEGF-A165同种型在大多数组织中是主要的转录物，产生除了结合VEGFR1和VEGFR2之外，与神经纤毛蛋白-1(neuropilin-1)具有独特亲和性的一种多肽。VEGF121和VEGF189在正常组织中低水平表达。同种型特异性VEGF定向实验已经示出VEGF164和VEGF188对心血管系统出生后的生长和正常功能的维持是更重要的，而VEGF120起动和促进脉管发生(Carmeliet等，自然医学5495-502(1999))。VEGF206主要在胚胎组织中表达(Houck分子内分泌学51806-14(1991))，而VEGF145只可见于肿瘤细胞系中(Poltorak等，生物化学杂志2727151-8(1997))。另外，在病理条件下VEGF还以同种型特异性方式调节。在肺和结肠癌中，VEGF165和VEGF121是正调节的，而VEGF189无变化，提示VEGF在恶性肿瘤中的同种型特异性作用(Cheung等，人体病理学29910-4(1998))。
胎盘生长因子(P1GF)具有3种不同的同种型，其以组织和发育特异性方式表达(Maglione等，致癌基因8925-31(1993)；Cao等生物化学生物物理学研究通讯235493-8(1997))。
目前已识别通过mRNA的可变剪接产生的VEGF-B的两种同种型(Grimmond等，基因组研究6124-131(1996)；Olofsson等，生物化学杂志27119310-19317(1996)；Townson等，生物化学生物生理学研究综述220922-928(1996))。它们是167个氨基酸残基的细胞结合形式(VEGF-B167)和186个氨基酸残基的分泌形式(VEGF-B186)。这些同种型具有相同的115个氨基酸残基的N末端结构域，不包括信号序列，而C末端结构域不同。通常N末端结构域由外显子1-5编码。剩余的3个外显子的不同用途产生两种剪接同种型。通过使用外显子6中的可变剪接受体位点，导入一个101bp的插入引起读框移位，和VEGF-B167cDNA编码区的终止。因此，这两种VEGF-B同种型具有不同的C末端结构域。
VEGF-B的两种剪接同种型的不同C末端结构域影响它们的生物化学和细胞生物学性质。VEGF-B167的C末端结构域与VEGF中相应区域在结构上相关，具有一些保守的半胱氨酸残基和若干段碱性氨基酸残基序列。因此，此结构域是高度亲水的和碱性的，且因此VEGF-B167在分泌时将保持细胞结合形式，除非生产细胞是用肝素或高盐浓度处理的。结合VEGF-B167的细胞结合形式的分子可以是细胞表面或细胞外周硫酸肝素蛋白聚糖。此同种型的细胞结合形式通过其独特的碱性C末端区发生。
VEGF-B186的C末端结构域与数据库中已知氨基酸序列无明显相似性。VEGF-B186的C末端结构域的疏水性与VEGF-B167的亲水性和碱性C末端的性质相反。这可通过观测到VEGF-B186在分泌时不保持细胞结合形式而证实。近来的研究结果表明此同种型是经蛋白酶解加工的，其调节蛋白质的生物学性质(Olofsson等，美国科学院院报9511709-11714(1998))。
关于人和小鼠VEGF-B同种型的分离详见于路德维格癌症研究所和赫尔辛基大学的PCT/US96/02957，美国专利5840693和5607918及Olofsson等，美国科学院院报932576-2581(1996)所述。
VEGF-B的两种同种型也与VEGF形成异源二聚体，与参与PDGF类蛋白的分子间和分子内二硫键内的8个半胱氨酸残基的保守形式一致。另外，VEGF-B和VEGF在许多组织中的共表达提示，VEGF-B-VEGF异源二聚体是天然发生的。VEGF-B167-VEGF异源二聚体保持细胞结合形式。相反，VEGF-B186和VEGF异源二聚体在培养基中自由地从细胞中分泌。VEGF还与P1GF形成异源二聚体(DiSalvo等，生物化学杂志2707717-7723(1995))。生长因子此家族的成员之间异源二聚体复合物的生成可提供血管生成或调节分子的多样性排列的基础。
在先前关于VEGF-B表达调节的研究中，所述两个同种型未进行单独研究。在通过RT-PCR进行分别研究的情况中，未准确反映转录水平。先前的数据已经示出VEGF-B在不同肿瘤和细胞系中高水平表达(Sowter等，实验室研究77607-14，(1997)；Salven等，Am JPathol.153103-8(1998)；and Enholm等，致癌基因14247583(1997))。然而，大多数研究是基于免疫组织化学进行的，不能区分所述两个同种型。因此，VEGF-B167和VEGF-B186的表达模式和调节仍不清楚。关于VEGF-B167和VEGF-B186的表达模式和调节的研究，对进一步了解VEGF-B在生理和病理条件下所起的作用是特别重要的。
在本文所提及的所有参考文献均并入参考。
本发明一方面提供了检测怀疑患有肿瘤的动物体内肿瘤细胞存在情况的一种方法。所述方法包括从所述动物体获得一种样品；并检测来自所述样品的VEGF-B186的表达，由此检测到VEGF-B186表达则表示存在肿瘤细胞。
或者，所述方法包括从所述动物体获得一种样品；测定来自所述样品的VEGF-B186表达水平；并将得自所述样品的表达水平与由这种特定样品正常表达的VEGF-B186表达水平相对比，从而测定到VEGF-B186的表达水平提高超过正常表达水平则表示存在肿瘤细胞。
所述样品可以是血浆，血清或组织样品。
VEGF-B186可以使用免疫分析检测，例如放射免疫分析或酶联免疫吸附测定，及使用一种经可检测标记而标记的VEGF-B186的单克隆抗体。这些分析可包括使用可溶的或固定的VEGFR-1和/或特异性抗体。所述抗体可以是偶联于适当的超磁性，顺磁性，电子致密的，生态的或放射活性的或非放射活性的制剂以显影。放射性制剂/标记例如包括一种放射性原子或基团，如125I或32P。非放射性制剂/标记例如包括酶标记，如辣根过氧化物酶，或荧光标记如5-异硫氰酸荧光素(FITC)。可以直接或间接，共价或非共价进行标记。
VEGF-B186的表达水平可以通过如RNASE保护分析这样的方法测定。
应知的是，来自一种特定样品的表达水平与由该样品正常表达的VEGF-B186的表达水平的对比意味着具有正常表达水平的所述样品是与得自怀疑患有肿瘤的动物样品相同类型(例如肺组织)和相同物种(例如人)的样品。
本发明另一方面提供了一种检测动物体内肿瘤细胞存在情况的试剂盒。所述试剂盒包含一个适于接受样品的容器；和一种检测来自样品的VEGF-□□□□的表达的手段，由此检测到VEGF-B186表达则表示肿瘤的生长。
或者，所述试剂盒包含一个适于接受样品的容器；一种测定来自所述样品的VEGF-B186的表达水平的手段；和一种测定来自这个特定样品的VEGF-B186的正常表达水平的手段，由此测定到VEGF-B186表达水平高过正常表达水平则表示肿瘤生长。
所述检测手段优选是如上所述用可检测标记标记的一种针对VEGF-B186的单克隆抗体。
应理解的是，术语“来自这个特定样品的VEGF-B186的正常表达水平”，意味着所述表达水平是从与得自怀疑患有肿瘤的动物的样品相同类型(例如肺组织)和相同物种(例如人)的、但在所述特定样品中没有肿瘤生长的样品中测定的。
所述测定手段可以是任何方法如RNASE保护分析，其可以用于测定一种特定多肽的表达水平，或者其可以是一个提供如上所述来自这个“特定”样品的VEGF-B186的正常表达水平的图表或列表。
本发明再一方面是提供了一种筛选抗肿瘤剂的方法。这个方法包括将一种测试剂应用于肿瘤细胞；并通过任何适当手段检测VEGF-B186在肿瘤细胞中的表达水平的降低。
图1是用于RNASE保护分析中的小鼠VEGF-B的两个同种型的RNA探针的图示。
图2示出使用30μg总细胞RNA测定两个小鼠VEGF-B同种型的分布和表达水平的RNASE保护分析的结果。
图3提供了分别使用30μg和100μg总细胞RNA测定的来自各种组织的小鼠VEGF-B167和VEGF-B186的表达水平，以及各种组织的VEGF-B186与VEGF-B167表达水平比率的列表。
图4示出使用从不同发育阶段的胚胎和其它胚胎组织中提取的30μg总细胞RNA，测定两个小鼠VEGF-B同种型的表达水平的RNASE保护分析结果。
图5示出使用100μg总细胞RNA测定两个小鼠VEGF-B同种型的分布和表达水平的RNASE保护分析结果。
图6示出使用30μg总细胞RNA测定两个小鼠VEGF-B同种型在小鼠肿瘤细胞系中的表达水平的RNASE保护分析结果。
图7示出使用30μg总细胞RNA测定两个人VEGF-B同种型在人体肿瘤细胞系中的表达水平的RNASE保护分析结果。
图8是用于RNASE保护分析中的人VEGF同种型的RNA探针的图示。
图9示出测定两个人VEGF-B同种型和VEGF-A同种型在人良性和恶性嗜铬细胞瘤中表达水平的RNASE保护分析结果。
图10示出VEGF-B167和VEGF-B186特异性抗体与其各自的同种型的结合。
图11A-11F示出为证实在B16小鼠黑素瘤细胞中VEGF-B的蛋白质合成而进行的mVEGF-B和钙联蛋白的间接免疫荧光显微镜检结果。
使用RNASE保护分析(RPA，Ambion)对不同基因在不同组织中的表达水平进行定量。简而言之，将30μg总细胞RNA在45℃与所述核糖探针杂交，随后进行RNASE消化。所述总细胞RNA是使用硫氰酸胍/酸苯酚方法制备的，如Chomczynski和Sacchi，分析生物化学162156-9(1987)所述，并贮存于-80℃。将消化的产物在6％聚丙烯酰胺凝胶上分离，并将所述信号通过磷光计定量。如图2所示，RNASE保护分析示出当使用30μg总细胞RNA时，只有VEGF-B167同种型可检测到，这通过存在210和70bp片段而没有衍生自VEGF-B186的预期的386bp片段示出。这表明所述VEGF-B167同种型是高度表达的，而VEGF-B186同种型以非常低水平表达的。通过磷光计使用β-肌动蛋白(Ambion)作为内在对照，定量VEGF-B167的转录水平。
使用30μg总细胞RNA测定来自各种组织的VEGF-B167的表达水平的列表示于图3。在正常成年小鼠的心脏，骨骼肌和隔组织中见到最高表达水平，在大多数其它组织中见到较低水平表达。所有所述数值均是根据内在对照(β-肌动蛋白)规化的任意值。
为核实VEGF-B的表达模式是否是发育特异性的，使用从不同发育阶段的胚胎和其它胚胎组织中提取的RNA进行相同的实验。图4示出VEGF-B167同种型也是这些组织中的主要转录物。VEGF-B167是在胚胎和其它组织中表达的主要同种型，这是通过存在所述210和70bp片段及不存在所述380bp片段表明的。在这个分析中使用30μg总细胞RNA。将收集的正常小鼠成体和胚胎组织均进行速冻，并贮存在-80℃直至使用。
实施例2VEGF-B186以组织特异性方式低水平表达由于使用30μg总细胞RNA检测不到VEGF-B186表达，使用100μgRNA，使用相同探针如实施例1所述相同方式进行RPA分析，以研究VEGF-B186在成体小鼠组织中的表达。图5示出当使用100μgRNA时，在一些测试的组织中可微弱检测到衍生自VEGF-B186的一个380bp片段。将所述380bp片段通过磷光计定量，使用β-肌动蛋白作为内在对照。VEGF-B186表达结果也示于图3。VEGF-B186在心脏，骨骼肌，膈，结肠，肾，脑和肺中表达，在其它组织中检测不到。应注意VEGF-B167同种型在大多数测试组织中表达，而VEGF-B186只存在于有限的几种组织中。因此，VEGF-B186同种型在成体小鼠组织中以组织特异性方式低水平表达。这些结果表明VEGF-B的两个同种型具有不同的遗传调节作用，而且可能具有不同的生物功能。VEGF-B的两个同种型的所述遗传调节作用是组织特异性方式的，而不是发育特异性的。
为对比所述两个同种型的相对表达水平，通过对比380bp和210bp条带的密度产生VEGF-B186/VEGF-B167比值。这种对比结果示于图3。数据示出在心脏，肾和结肠中见到最高比值，为大约25％。然而，考虑到所述两个保护片段的长度不同，与掺入的放射性成比例，因此在最高表达组织中VEGF-B186的表达水平是VEGF-B167的大约14％，在其它器官中更低。
实施例3VEGF-B186在小鼠肿瘤细胞系中是正调节的为研究VEGF-B的两个同种型在肿瘤细胞系中的表达模式，将提取自不同小鼠肿瘤细胞系的总细胞RNA(均30μg)用于这项研究，所述细胞系包括纤维肉瘤(T241)，黑素瘤(B16)，Lewis肺癌(LLC)和大鼠神经胶质瘤(BT4C)。以实施例1相同方式进行RPA分析。令人惊奇地，VEGF-B186同种型在所有测试的细胞系中均高水平表达，表明VEGF-B186同种型的正调节(见图6)。使用β-肌动蛋白作为内在对照以进行定量。VEGF-B186/VEGF-B167的相对比值高于50％，比在正常组织中观测到的那些比值高许多。
实施例4VEGF-B186在人黑素瘤细胞系中高水平表达为着眼于VEGF-B的两个同种型在人体肿瘤细胞系中的表达，通过SacI消化产生一个大约450bp的人VEGF-B(U52819)cDNA片段。将这个片段克隆并用作模板使用如实施例1所述策略产生RNASE保护分析中的RNA探针。使用30μg总细胞RNA研究22个不同的人黑素瘤细胞系。使用3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作为内在对照以进行定量。图7的上组示出在大多数测试的细胞系中，VEGF-B186和VEGF-B167均高水平表达，平均186/167比值为42％(见图7的对比表)。通过组合这两个同种型并根据内在对照(GAPDH)标准化，对总VEGF-B表达水平进行定量。VEGF-B的两个同种型均存在于所有所述细胞系中，在样品3，6，10和22中表达水平较高。作为对比，使用一个大约650bp的人VEGF165同种型(X62568)的cDNA片段研究VEGF-A表达水平。将此片段克隆并用作模板以产生RNA探针。如图8所示，VEGF-A165同种型产生两个保护条带，即充分保护的VEGF-A165同种型，和来自其它同种型的外显子1-5区域。图8中方框是VEGF-A的各个外显子。如图7下组所示，VEGF-A在所有所述细胞系中均表达，具有差别很大的各种转录水平，这与VEGF-B相反，后者是相对稳定的。
VEGF-A在样品5，7，11，16和20中高水平表达，在这些样品中VEGF-B表达水平低于平均值(见图7的对比表)。VEGF-A和VEGF-B的这种相反的表达模式可以表明彼此的潜在互补作用。
实施例5VEGF-B和VEGF-A在人良性和恶性嗜铬细胞瘤中的表达在人良性和恶性嗜铬细胞瘤中研究VEGF-B和VEGF-A的同种型特异性表达，使用如实施例1和4所述相同方法。图9上组示出VEGF-B186在良性和恶性肿瘤中均以相似水平或高水平表达，平均VEGF-B186/VEGF-B167比值为大约49％(见图9的对比表)。在良性和恶性样品中，总VEGF-B表达水平相似，这可表明在恶性肿瘤发生期间VEGF-B186的先决作用。图9的下组示出VEGF-A在这两组中以相似水平表达。
实施例6VEGF-B蛋白的两个同种型均在B16黑素瘤细胞中表达为证实在肿瘤细胞中VEGF-B的蛋白质合成，对B16小鼠黑素瘤细胞进行间接免疫荧光显微镜检。将B16小鼠黑素瘤细胞种植于无菌盖玻片上的6孔平皿中，密度为100,000个细胞/孔，一天后进行间接免疫荧光显微镜检。如Andersson等，病毒学杂志714717-27(1997)所述，进行VEGF-B定位。使用抗VEGF-B167和VEGF-B186的不同C末端的同种型特异性抗体。将VEGF-B167和VEGF-B186特异性抗体稀释为20mg/ml浓度，同时使用1∶50稀释度的内质网(ER)特异性标记钙联蛋白(Santa Cruz Biotechnology)。使用异硫氰酸荧光素(FITC)缀合的抗兔IgG抗体观测所述兔Ig，可见到绿色染色。使用四甲基异硫氰酸(TRITC)-缀合的抗山羊IgG抗体观测所述山羊Ig，可见到红色染色。使用Zeiss Axiophot荧光显微镜检测免疫荧光。
如下产生VEGF-B167和VEGF-B186特异性抗体。产生分别编码VEGF-B167和VEGF-B186的C末端的外显子6B或外显子6A-B的PCR片段。针对VEGF-B167，使用有义引物5′ACGTAGATCTAGCCCCAGGATCCTC(SEQ ID NO1)和反义引物5′ACGTGAATTCTCAGCCCCGCCCTTGGCA(SEQ ID NO2)。针对VEGF-B186，使用有义引物5′ACGTAGATCTAGGGTTGCCATACCC(SEQ ID NO3)和反义引物5′ACGTGAATTCTCAGTTGACGGCGCTGGGT(SEQ ID NO4)。所述有义引物包括一个BglII限制位点，反义引物具有一个EcoRI位点以用于克隆。将所述片段克隆入载体pGEX-2T(Pharmacia)中。GST融合蛋白是根据厂商指导(Pharmacia)制备的。将纯化的蛋白质用于免疫接种兔，如Aase等，Dev Dyn.，21512-25(1999)所述。VEGF-B167抗体是抗GST融合蛋白亲和纯化的，VEGF-B186抗体是抗杆状病毒衍生的蛋白亲和纯化的。通过免疫印迹测试亲和纯化的VEGF-B抗体的特异性，使用通过杆状病毒感染的Sf9细胞产生的并通过12.5％SDS-PAGE分离的还原的VEGF-B167和VEGF-B186蛋白质进行测试，如Aase等，Dev Dyn.，21512-25(1999)所述。图10示出VEGF-B167和VEGF-B186特异性抗体只与其各自的同种型反应。
图11A-11F示出mVEGF-B和钙联蛋白双免疫荧光染色的间接免疫荧光显微镜检的结果。图11A和11D示出在B16细胞中这两种同种型的强染色。图11b和11E示出ER特异性标记钙联蛋白的染色。图11C和11F示出用钙联蛋白共同定位的VEGF-B的表达。因此，这表明VEGF-B蛋白的两个同种型均在B16黑素瘤细胞细胞中表达。
总之，考虑到VEGF-B167在正常组织中高水平表达及VEGF-B186同种型在肿瘤细胞系中的正调节，这些结果表明在肿瘤细胞系中VEGF-B167的维持作用和VEGF-B186潜在生长促进作用。
以上的描述和实施例只是例证了本发明而无限制之意。由于本领域技术人员在本发明的精神和实质内可对所揭示的实施方案加以修改，因此本发明应包括在所附权利要求及其等价物范围内的各种变化。
序列表<110>路德维格癌症研究所<120>检测肿瘤细胞的存在及筛选抗肿瘤剂的方法<130>1064/48885PC<150>US 60/204,748<151>2000-05-17<160>4<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>25<212>DNA<213>Murinae gen.sp.<400>1acgtagatct agccccagga tcctc 25<210>2<211>28<212>DNA<213>Murinae gen.sp.<400>2acgtgaattc tcagccccgc ccttggca 28<210>3<211>25<212>DNA<213>Murinae gen.sp.<400>3acgtagatct agggttgcca taccc 25<210>4<211>29<212>DNA<213>Murinae gen.sp.<400>4acgtgaattc tcagttgacg gcgctgggt 29
权利要求
1.一种检测怀疑患有肿瘤的动物体内肿瘤细胞存在情况的方法，包括以下步骤从所述动物中获得样品；检测来自所述样品的VEGF-B186的表达，其中检测到VEGF-B186表达是存在肿瘤细胞的指征。
2.一种检测怀疑患有肿瘤的动物体内肿瘤细胞存在情况的方法，包括以下步骤从所述动物中获得样品；测定所述样品中VEGF-B186的表达水平；测定来自未怀疑患有肿瘤的动物的等价样品中VEGF-B186的对照表达水平；以及将所述测定的表达水平与对照表达水平相对比，其中确定VEGF-B186表达水超过对照表达水平则表示存在肿瘤细胞。
3.一种检测怀疑患有肿瘤的动物体内肿瘤细胞存在情况的方法，包括以下步骤从所述动物中获得样品；测定所述样品中VEGF-B186的表达水平；测定所述样品中VEGF-B167的表达水平；以及将所述的VEGF-B186的表达水平与所述的VEGF-B167的表达水平相对比，其中对比表明VEGF-B186与VEGF-B167的相对比率高于或等于28％则表示存在肿瘤细胞。
4.一种检测怀疑患有肿瘤的动物体内肿瘤细胞存在情况的方法，包括以下步骤从所述动物中获得样品；测定所述样品中VEGF-B186的表达水平；测定所述样品中VEGF-B167的表达水平；以及将所述的VEGF-B186的表达水平与所述的VEGF-B167的表达水平相对比，其中对比表明VEGF-B186与VEGF-B167的相对比率高于或等于50％则表示存在肿瘤细胞。
5.一种检测动物体内肿瘤细胞存在情况的试剂盒，其包含一种适于接受样品的容器；和一种用于检测所述样品中VEGF-B186的表达的手段，由此检测到VEGF-B186表达则表示存在肿瘤细胞。
6.一种检测动物体内肿瘤细胞存在情况的试剂盒，其包含一种适于接受样品的容器；一种用于检测样品中VEGF-B186的表达的手段；和一种用于将所述VEGF-B186表达水平与在无肿瘤动物中VEGF-B186的对照水平相对比的手段，其中测定到VEGF-B186表达水平高过对照表达水平则表示存在肿瘤细胞。
7.权利要求1-6任一项的方法，其中所述动物是哺乳动物。
8.权利要求1-6任一项的方法，其中所述动物是人。
9.权利要求1-6任一项的方法，其中所述动物是啮齿动物。
10.一种筛选抗肿瘤剂的方法，包括将一种测试剂应用于肿瘤细胞；以及通过任何适当手段检测VEGF-B186在所述肿瘤细胞中的表达的降低。
全文摘要
本发明提供了通过检测VEGF－B
文档编号G01N33/50GK1441849SQ01812531
公开日2003年9月10日 申请日期2001年5月17日 优先权日2000年5月17日
发明者李旭日, 卡琳·奥瑟, 乌尔夫·埃里克松 申请人:路德维格癌症研究所