专利名称：有机磷农药的识别元件及其制作方法
技术领域：
本发明涉及一种有机磷农药识别元件及其制作方法。
背景技术：
近年来，酶传感器由于具有快速、灵敏、无二次污染等优点而在环境污染物的监测方面受到越来越多的关注。酶传感器主要由识别元件和换能器组成。后者一般为pH电极，其制作技术比较成熟；而前者为固定化的敏感生物酶，在制备技术上尚无理想的方法。如果敏感生物酶不能牢固地结合在载体上而组成灵敏、稳定的识别元件，则由其构成的酶传感器就不能连续自动检测环境中的目标污染物。
目前，常见的乙酰胆碱酯酶固定方法是采用戊二醛交联法将酶固定在作为载体的纤维素薄膜上。但是，实验证实，利用这种技术所形成的固定化酶由于是被固定在纤维素膜上，难以达到稳定、牢固和均匀，通常适于一次性使用，且操作不便，重复性差。
发明内容
本发明的目的在于克服已有技术的不足，提供一种有机磷农药的识别元件及其制作方法。
本发明是一个两端为细管的管状体内注有半固体状态的固定化乙酰胆碱酯酶的结构体。
本发明的制备方法的关键工艺是利用凝胶制成固定化乙酰胆碱酯酶。这是一种半固体化的稳定性高的有机磷农药敏感材料，只要将其注入上述管状体中，就可得到本发明的识别元件。
制备方法为首先将凝胶进行预处理，以除去凝胶中所含的添加剂，再尽可能除去其中的液体，保留粉状凝胶；再偶联普鲁卡因胺配体，即在其中加入配体——普鲁卡因胺和偶联剂——乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDAC)溶液，在20℃左右振荡10h以上，以上述偶联剂将多余的配体洗掉，再用pH8.0的磷酸盐缓冲溶液冲洗，以除去剩余的偶联剂(EDAC)，得到经过预处理和偶联的凝胶；而后，进行乙酰胆碱脂酶的固定，即将一定活力的纯化的乙酰胆碱酯酶加入其中，在4℃下振荡5h以上，静置后弃去上部溶液，再用至少10mL的0.1M磷酸盐缓冲溶液(pH8.0)反复多次洗涤下部的凝胶酶，每次洗涤后都弃去上部溶液。然后用上述磷酸盐缓冲溶液定容到一定体积，即制成以凝胶为载体的半固体状态的固定化乙酰胆碱酯酶，最后，向一个两端有细管、底部平放一个筛绢圆片的管柱内，准确加入上述制得的活力为1-5U的固定化乙酰胆碱酯酶即制成。
以本方法固定的半固体状态的生物酶能方便注入管状体内而制成灵敏度高、均匀稳定的识别元件，其线性好，工作寿命长，是检测水体中特别是海水中的微量有机磷农药的必备器件。
图1为识别元件的基本结构示意图其中，1、管状体2、固定化酶3、阻酶层4、细管具体实施方式
如图1，本发明是一个两端为细管4的管状体1内注有半固体状态的固定化乙酰胆碱酯酶2的结构体。其中作为敏感材料的固定化酶2是以凝胶为载体的乙酰胆碱酯酶，呈半固体状态。此乙酰胆碱酯酶适于采用鱼类、苍蝇、电鳗、昆虫等动物体内提取纯化的乙酰胆碱酯酶。其加入量(以酶活力表示)可视待测水样中有机磷农药的浓度高低而不同。进一步考虑到防止酶的流失，还可以在管状体1下部设置一种防止固定化酶2流失的阻酶层3。阻酶层3宜选用300-400目的筛绢或玻璃纤维。管状体1两端的细管4的作用只是便于外接软管。如果不需外接，自然应当省去或只保留其中一端的细管。
本发明使用方便。只需根据所测样品的有机磷农药浓度，准确吸取含固定化酶的溶液加入玻璃短管或塑料管内即可，所制成的识别元件对水体中微量的甲基对硫磷和马拉硫磷有灵敏的线性响应；而且其工作寿命长，在传感器中可以连续使用的时间为传统戊二醛交联法的三倍以上；对温度的适应性强，在16-30℃之间，该固定化酶的活力没有显著变化；保质期长。在4℃保存，活性至少2个月没有明显下降。
作为实施例，以测定海水中微量有机磷农药的识别元件制备为例。其步骤如下(1)凝胶预处理将1g的CH Sepharose 4B凝胶的冻干粉与10mL浓度1mM的盐酸(HCl)混合，保持30min使凝胶膨胀；用至少10mL浓度为1mM的HCl溶液分数次洗涤溶胀凝胶，以除去溶胀凝胶中所含的添加剂。再用吸水纸尽可能除去液体，保留粉状凝胶；(2)偶联普鲁卡因胺配体向上述粉状凝胶中加入8.2mg普鲁卡因胺和1.5mL浓度0.01M的偶联剂——乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDAC)溶液，在20℃下振荡24h；用10mL浓度为0.01M的偶联剂(EDAC)溶液将多余的配体洗掉；再用20mL 0.1M的磷酸盐缓冲溶液(pH8.0)冲洗，以除去剩余的偶联剂(EDAC)溶液。
(3)乙酰胆碱酯酶(AChE)的固定将待固定的乙酰胆碱酯酶(AChE)溶液用比色法预先测定酶活力。吸取5个活力单位(U)的AChE溶液，加入上述经过预处理和偶联的凝胶中，在4℃下振荡6h；静置15min，弃去上部溶液，用0.1M磷酸盐缓冲溶液(pH8.0)10mL反复多次洗涤下部的凝胶酶，每次洗涤后都弃去上部溶液。然后，用上述磷酸盐缓冲溶液定容到5.00mL，即制成以CH Sepharose 4B凝胶为载体的半固体状态的固定化酶。
(4)管柱装酶取一个两端有细管的管柱，在其底部平整放入一个直径与管柱内径匹配的300目的筛绢圆片，从上部细管向管柱内准确加入活力为1U的固定化乙酰胆碱酯酶。
此识别元件可以与pH电极组合为酶传感器，用于指示水体特别是海水中有机磷农药的污染程度。
权利要求
1.一种有机磷农药识别元件，其特征在于它是一个两端为细管(4)的管状体(1)内注有半固体状态的固定化乙酰胆碱酯酶(2)的结构体。
2.如权利要求1所述的有机磷农药识别元件，其特征是在管状体(1)下部设置一种防止固定化酶(2)流失的阻酶层(3)。
3.如权利要求1或2所述的有机磷农药识别元件，其特征是作为敏感材料的固定化酶(2)是以凝胶为载体的呈半固体状态的乙酰胆碱酯酶，。
4.如权利要求2所述的有机磷农药识别元件，其特征是阻酶层(3)宜选用300-400目的筛绢或玻璃纤维。
5.一种有机磷农药识别元件的制作方法，首先将凝胶进行预处理，以除去凝胶中所含的添加剂，再尽可能除去其中的液体，保留粉状凝胶；再偶联普鲁卡因胺配体，即在其中加入配体——普鲁卡因胺和偶联剂——乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺盐酸盐溶液，在20℃左右振荡10h以上，以上述偶联剂将多余的配体洗掉，再用pH8.0的磷酸盐缓冲溶液冲洗，以除去剩余的偶联剂，得到经过预处理和偶联的凝胶；而后，进行乙酰胆碱脂酶的固定，即将一定活力的纯化的乙酰胆碱酯酶加入其中，在4℃下振荡5h以上，静置后弃去上部溶液，再用至少10mL的0.1M磷酸盐缓冲溶液(pH8.0)反复多次洗涤下部的凝胶酶，每次洗涤后都弃去上部溶液。然后用上述磷酸盐缓冲溶液定容到一定体积，即制成以凝胶为载体的半固体状态的固定化乙酰胆碱酯酶，最后，向一个两端有细管、底部平放一个筛绢圆片的管柱内，准确加入上述制得的活力为1-5U的固定化乙酰胆碱酯酶即制成。
6.有机磷农药识别元件的制作步骤如下(1)凝胶预处理将1g的CH Sepharose 4B凝胶的冻干粉与10mL浓度1mM的盐酸混合，保持30min使凝胶膨胀；用至少10mL浓度为1mM的HCl溶液分数次洗涤溶胀凝胶，以除去溶胀凝胶中所含的添加剂。再用吸水纸尽可能除去液体，保留粉状凝胶；(2)偶联普鲁卡因胺配体向上述粉状凝胶中加入8.2mg普鲁卡因胺和1.5mL浓度0.01M的偶联剂——乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺盐酸盐溶液，在20℃下振荡24h；用10mL浓度为0.01M的偶联剂(EDAC)溶液将多余的配体洗掉；再用20mL 0.1M的磷酸盐缓冲溶液(pH8.0)冲洗，以除去剩余的偶联剂(EDAC)溶液。(3)乙酰胆碱酯酶的固定将待固定的乙酰胆碱酯酶溶液用比色法预先测定酶活力。吸取5个活力单位的AChE溶液，加入上述经过预处理和偶联的凝胶中，在4℃下振荡6h；静置15min，弃去上部溶液，用0.1M磷酸盐缓冲溶液(pH8.0)10mL反复多次洗涤下部的凝胶酶，每次洗涤后都弃去上部溶液。然后，用上述磷酸盐缓冲溶液定容到5.00mL，即制成以CH Sepharose 4B凝胶为载体的半固体状态的固定化酶。(4)管柱装酶取一个两端有细管的管柱，在其底部平整放入一个直径与管柱内径匹配的300目的筛绢圆片，从上部细管向管柱内准确加入活力为1U的固定化乙酰胆碱酯酶。
全文摘要
有机磷农药识别元件及其制作方法，本发明是一个两端为细管的管状体内注有半固体状态的固定化乙酰胆碱酯酶的结构体。还可以在管状体下部设置一种防止固定化酶流失的阻酶层。上述固定化酶是以凝胶为载体的乙酰胆碱酯酶，呈半固体状态。其制备方法首先将凝胶预处理；然后偶联普鲁卡因胺配体；再将乙酰胆碱酯酶进行固定；最后，向一个两端有细管、底部平放一个筛绢圆片的管柱内，准确加入上述制得的活力为1~5U的固定化乙酰胆碱酯酶即制成。以本方法固定的半固体状态的生物酶能方便注入管状体内而制成灵敏度高、均匀稳定的识别元件、线性好、工作寿命长，是检测水体中特别是海水中的微量有机磷农药的必备器件。
文档编号G01N27/327GK1514238SQ03139140
公开日2004年7月21日 申请日期2003年8月18日 优先权日2003年8月18日
发明者孟范平, 唐学玺, 朱小山, 何东海, 马冬, 杨正先 申请人:中国海洋大学