使用非线性光学技术检测涉及构象变化的相互作用的方法

专利名称：使用非线性光学技术检测涉及构象变化的相互作用的方法
技术领域：
本发明涉及使用表面选择性非线性光学技术检测生物成分之间相互作用的方法。本发明的一个方面涉及检测导致构象变化的探针和靶之间的结合。
2.背景技术结合的检测在现代分子生物学和医学中，检测和定量生物分子之间的相互作用，例如结合，具有重要意义。结合到分子上的配体和药物是现代生物学、医学和药物开发的重要主题。生物成分之间的结合反应通常导致构象或偶极矩(或诱导的偶极矩)的变化。构象变化(分子或分子亚基的方向或位置的变化)是很多系统的重要信号特征。通过直接测定构象变化或偶极矩变化而检测信号转导物(例如膜受体)活化的技术，在基础研究和发现药物中具有重要价值。例如可以使用本发明的方法进行高通量药物筛选，筛选一个受体可能的激动剂或拮抗剂，所述方法用于检测激动剂或拮抗剂是否诱导预示受体结合和激活的构象变化。因为构象变化是受体活化的直接指示物，所以是筛选药物的极好的方式；目前的技术通常依赖于间接测定活化作用，例如伴随钙离子浓度变化的荧光强度的变化，而离子浓度的变化又是由受体活化引起的。目前这种直接测定活化作用的技术，例如离子通道蛋白的膜片钳技术，不适用于高通量放大试验，并且需要熟练的技术人员操作，因此导致了使用者较高的成本。
基于荧光的或基于表面细胞质基因组的检测技术过去用于检测结合的相互作用，其成功率和效率有变化。使用荧光产生的问题包括很多(非标记)生物样品中天然荧光背景的存在以及光漂白。很难用荧光检测伴随靶结合的方向变化，因为该技术对标记方向不十分灵敏。荧光偏振，它不是一种相干的技术，对荧光持续期间的旋转运动敏感，使得很难将特定的偏振方向中检测到的微小变化归因于构象变化(不是由于旋转运动)。从存在于很多生物样品中的大量荧光背景中分离探针方向的微小变化也很困难。而且，使用荧光从预示受体活化的信号中分离预示结合的信号通常并非是不重要的；例如，使用荧光偏振检测荧光标记的靶结合给定受体的能力-但是靶与表面，例如细胞表面的结合也会非特异性的发生，因此靶非特异性地与感兴趣的受体结合仍然给出预示所述结合的信号；直接检测构象变化作为受体活化的指示物是一种更直接的测定活化作用的方式。可以观察构象变化导致标记的微环境变化引起的波长变化，但不是所有的构象变化都导致微环境变化，并且很难将由于微环境导致的相对变化归因于实际发生的构象变化程度。现有技术中使用荧光检测蛋白构象变化的例子如下Mannuzzu et al.(1996)Science 271，213-216描述了以荧光标记通道蛋白直接物理检测钾通道的构象重排。Gether etal.，″Fluorescent labeling of purified(β2 adrenergicreceptor，″J.Biol.Chem.270，28628-28275(1995)描述了以荧光标记的可溶性纯化β2肾上腺素能受体检测配体特异性构象变化。Turcatti et al.，″Probing the Structure and Function of theTachykinin Neurokinin-Receptor through Biosyntheticincorporation of flourescent amino acids at specific sites，″J.Biol.Chem.271，19991-19998，(1996)描述了将非天然荧光氨基酸掺入受体以监测配体结合。Liu et al.，″Site-Directedfluorescent labeling of P-glycoprotein on cysteine residuesin the nucleotide binding domains，″Biochemistry 35，11865-11873，(1996)描述了以荧光标记的可溶性纯化P-糖蛋白检测配体结合。
荧光也被用于检测靶与离子通道受体的结合，这种结合产生细胞跨膜电势的变化。跨膜电势的变化(例如去极化)导致膜上荧光或非线性活性标记的强度、持续时间、波长等的变化。除了检测本身的各种问题——涉及光漂白，假象和背景噪音，这些方法仅仅提供了一种探针-靶结合的间接检测方法。例如，有可能给定的靶与离子通道探针结合，并且离子通道被激活，但是没有导致跨膜电势的变化，这或者是由于自然原因或者因为在正常产生跨膜电势变化的机制的细胞中出现了问题。因此，当结合反应导致探针方向或构象变化的情况时，希望以一种直接的光学方式检测探针-靶的这种结合反应。
分子标志分子标志也可用于检测结合相互作用。现有技术中已知的分子标志探针(MB)是发夹环，即包含嵌入形成发夹茎的互补序列的探针序列的单链寡核苷酸。存在互补核酸时，分子的环部形成双链DNA。荧光团共价连接于寡核苷酸的一端，非荧光猝灭剂共价连接于另一端。一般，标志两端的每一端有5-8个碱基彼此互补。茎使两个部分彼此保持紧密靠近，使荧光团的荧光通过能量转移而猝灭。当标志与靶结合，探针-靶的双倍体的刚度迫使茎伸直，使荧光团和猝灭剂分离以及荧光恢复。这样当存在非杂交探针时也可以检测探针-靶杂交体。
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A.Khatchatouriants，A.Lewis，Z.Rothman，L.Loew and M.Treinin，“GFP is a SelectiveNon-Linear Optical Sensor of Electrophysiological Processes in C.elegans，”Biophys.J.(inpress，2000)现有技术中，非线性活性染料固定在膜上并且用于细胞表面成像。然而这些染料以或“上”或“下”的方向嵌入膜中，因此由于相消性干扰减少了总的非线性信号。非线性光学活性染料也已用于测定这些染料穿过脂质体中脂双层的动力学(A.Srivastava和KBEisenthal，″Kinetics of molecular transport across a liposomebilayer，″Chem.Phys.Lett.292(3)345-351(1998))。
本发明具有优于基于荧光检测的优点，例如背景降低，光漂白减少，简化光学检测，无需耗费精力和时间的洗涤步骤。这些优点是由于非线性光学技术的低背景，是由于这种方法是一个散射过程而不是吸收过程。
因此，本发明的目的是当结合反应导致探针，靶或者探针和靶的方向或构象变化的情况时，提供一种直接的光学方法检测探针-靶的结合反应。
3.发明概述本发明公开了一种筛选一种或多种与测试分子(本文中称为靶)结合的候选结合配偶体(本文中称为探针)的方法。该方法包括以一种或多种基频的一种或多种光束照射样品，所述样品包含暴露于一种或多种候选结合配偶体的测试分子，测定样品发射的非线性光束的一种或多种物理性质。测定的一种或多种物理性质的数值相对于不将所述测试分子暴露于所述一种或多种候选结合配偶体时测定的一种或多种物理性质的数值的变化，预示所述一种或多种候选结合配偶体与所述测试分子结合。
本发明公开了一种筛选一种或多种能够调节测试分子与其结合配偶体之间相互作用的候选调节分子的方法。该方法包括以一种或多种基频的一种或多种光束照射样品所述样品包含暴露于(i)所述结合配偶体，和(ii)所述一种或多种候选调节分子的测试分子，测定所述样品发射的非线性光束的一种或多种物理性质。测定的所述一种或多种物理性质的数值相对于不暴露于所述一种或多种候选调节分子时测定的所述一种或多种物理性质的数值的变化，预示所述一种或多种候选调节分子调节所述测试分子与所述结合配偶体之间的相互作用。
本发明提供了一种检测测试分子与结合配偶体结合后所述测试分子的构象变化的方法，包括将所述测试分子与一种或多种候选结合配偶体接触，该测试分子或一种或多种候选结合配偶体分别用非线性活性部分标记，该非线活性部分对测试分子或一种或多种候选结合配偶体是非天然的。该方法包括以一种或多种基频的一种或多种光束照射所述接触测试分子，测定样品发射的非线性光束的一种或多种物理性质。测定的所述一种或多种物理性质的数值相对于没有所述一种或多种候选结合配偶体时测定的所述一种或多种物理性质的数值的变化，预示至少一种所述一种或多种候选结合配偶体与所述测试分子结合，且所述结合诱导所述候选结合配偶体，所述测试分子，或所述候选结合配偶体和所述测试分子的构象变化。
本发明提供了一种检测测试分子和一种或多种结合配偶体之间结合相互作用的程度或范围的方法，包括将所述测试分子与一种或多种候选结合配偶体接触，该测试分子或一种或多种候选结合配偶体分别用非线性活性部分标记，该非线性活性部分对测试分子或一种或多种候选结合配偶体是非天然的。该方法包括以一种或多种基频的一种或多种光束照射所述接触测试分子，测定样品发射的非线性光束的一种或多种物理性质。测定的所述一种或多种物理性质的数值相对于没有所述一种或多种候选结合配偶体时测定的所述一种或多种物理性质的数值的变化，预示至少一种所述一种或多种候选结合配偶体与所述测试分子结合，预示所述结合诱导构象变化的程度或范围。
在一个具体实施方案中，本发明涉及一种以表面选择性非线性光学技术检测生物成分之间相互作用的方法。本发明的一个方面涉及检测导致构象变化的探针和靶之间结合的方法。本发明公开了一种通过其诱导的结合靶的构象变化筛选一种或多种探针的方法。本发明还公开了一种筛选探针-靶结合相互作用调节剂的方法，以及通过结合诱导的构象变化确定结合程度或范围的方法。
4.附图简述

图1是一个装置的实施方案，在该装置中产生和收集第二谐波光的模式是通过从带有表面附着探针的基材进行反射。
图2是一个装置的实施方案，在该装置中产生和收集第二谐波光的模式是以棱镜进行全内反射。棱镜通过一个指标匹配材料与带有表面附着探针的基材偶联。
图3是一个装置的实施方案，在该装置中产生和收集第二谐波光的模式是以波导管通过波导管内虚线所示的多次反射进行全内反射。
图4A-D是一个流动池的实施方案，该流动池用于将生物成分和其它流体送递和移动到包含附着探针的基材。
图5A-C是三个装置的实施方案，在这些装置中产生和收集第二谐波光的模式是通过样品透射。在图5A中，第二谐波光束与基谐波在一条直线上。在图5B中，第二谐波是从与基谐波成直角的方向收集的(“直角收集”)。在图5C中，第二谐波光是通过累计球和光纤收集的。
图6是一个转换的实施方案，使用一系列光学组件，将基谐波光的平行光束转换成适于扫描基材的线形。
图7A-B是一个阵列模式的实施方案，图7A显示的是构成阵列模式的基材表面(包含附着探针)实施方案(成分1-35)。图7B显示的是基材阵列的一个成分，其中每一个成分是一个有壁的孔，此孔带有表面附着探针，能容纳一些流体，并能将孔中内含物与临近孔或基材的其它部分物理分离。
图8是用于将寡核苷酸或多聚核苷酸样品连接到基质表面的表面化学的实施方案。
图9A-B是含有多个孔的基质的实施方案。图9A显示的是包含多个孔(1-16)的基质，每个孔都含有如图9B所示的表面附着探针。
图10是一个在反射涂层上面使用氨基硅烷表面附着层的装置基质的实施方案。氨基硅烷层下面的反射涂层能改善对非线性光的收集。氨基硅烷层适用于将生物分子或其它探针与基质偶联。
图11A-B是一个装置的实施方案，在该装置中产生和收集第二谐波光的模式是通过光纤。图11A显示的是使用一束光纤，图11B显示的是将小珠偶联到纤维末端以便附着探针。
图12A-C是三个装置的实施方案，在这些装置中产生和收集第二谐波光的模式是通过样品透射。图12A显示的是基谐波和第二谐波光束以同一条直线透过样品。图12B显示的是基谐波和第二谐波光束在基质上表面(含有附着探针的上表面)发生折射，在这个表面产生第二谐波光。图12C与图12B的装置类似，只是下表面(含有附着探针的下表面)产生第二谐波光。
图13A-B是两个装置的实施方案，在这些装置中通过在界面上的全内反射产生第二谐波光。产生第二谐波光的位置点用圆圈示出。在图13A中，使用Dove棱镜将光导向能产生第二谐波光的表面(棱镜的下表面，也可以是通过指标匹配材料与棱镜偶联的另一表面)。在图13B中，使用波导管结构产生多个第二谐波光产生位点。
图14A-C是三个装置的实施方案，其中使用光纤产生第二谐波光(纤维末端有附着探针)。图14A的装置中，在同一条纤维中产生和收集第二谐波光。图14B显示的是在纤维末端使用含有表面附着探针的小珠。图14C的装置中，在光纤的末端(含有附着探针)产生第二谐波光，用光纤外部的镜子或透镜收集第二谐波光。
图15A-B是两个装置的实施方案，该装置中使用光学共振器以积累基谐波的能量。
图16A-C是三个装置的实施方案，在这些装置中产生和收集第二谐波光的模式是通过界面上的光反射。
图17是施加了电场的样品室实施方案，样品室(5)是敞口的，从侧面图示且充满含有探针和靶的溶液(10)。基谐波光束从右边(15)进入样品室，穿过1-3mm间隔区(25)隔离的透明电极(20)。电极与电源(30)相连。当施加电压时，靶和探针部分定向，由此产生非线性光(例如，第二谐波光)。
图18是检测悬浮细胞中探针-靶相互作用的装置。使来源于在800nm运行的TiSapphire femtosecond laser(1000)的基谐波光源穿过滤光器(RG-645，CVI Laser)，该滤光器阻断400nm光(第二谐波)。然后用平凸透镜1200(焦距100mm，Melles Griot)将基谐波聚焦于含有生物细胞悬液的样品固定器1300。在与基谐波平行的方向上，用80mm直径的平凸准直透镜(1400)(焦距120mm，Melles Griot)收集第二谐波光，透镜1400放置的位置是使其焦点与透镜1200的焦点重合。让光通过滤色器(BG-39，CVI Laser)以阻断基谐波光，并将第二谐波光传送到第二个平凸透镜1600(焦距120mm，MellesGriot)，该透镜使光聚焦通过其单色器的狭缝并聚焦到其光栅(1700)上。光电倍增管附着在单色器上并检测第二谐波光。光电倍增管发出的信号传递到光子计数电子仪器(SR400，Stanford ResearchSystems)，接着传送到计算机1900储存和分析数据。
图19A-C是本发明的各种实施方案。图19A中，嵌入膜表面的受体暴露于与其有亲和性的配体或粒子。结合相互作用发生后，配体或粒子就结合到膜受体上。图19B中，细胞附着(或“铺”)在表面或基质上形成大致的单层细胞层(例如，约100％汇合细胞)；细胞也可以堆叠在基质或表面形成多层细胞层。在19B的两种情况中，入射的基谐波光可以透射穿过基质或表面，可以沿与表面平行的方向穿过多层或单层细胞层，可以与细胞层短暂偶联，或上述情形的一些组合。图19C显示的是构象变化过程。膜表面(例如宿主细胞)受体用非线性活性标签标记，该受体平均起来相对于表平面有一个方向，具体的说，该受体与表平面有θ角的超极化率(hyperpolarizability)；配体对受体结合及随后的活化使标签的方向转为β角。角度的微小变化能够引起被检测的非线性光的物理性质的相当大改变(例如，光强度)。
图20A-B是经修饰形成非线性活性类似物的分子标志。图20A中，单链核苷酸与非线性活性染料(灰阴影线)和增强剂(空心圆)偶联。当分子标志类似物与互补靶杂交时，染料和增强剂由于构象变化而分离，产生可测量的染料的非线性反应的变化。变化量可以通过探针-靶的杂交数量来定量。图20B显示的是一个带有附着染料和增强剂(Au粒子)的具体的寡核苷酸序列的例子(SEQ ID NO5)。也显示了用于测试与该探针杂交程度的各种靶序列(分别是SEQ ID NO1-4)。
5.发明详述本发明使用非线性光学技术检测涉及构象变化的探针-靶相互作用。非线性光学技术的例子包括但不限于第二谐波产生，和频产生，差频产生，第三谐波产生和超雷利散射(HRS)。本发明可以以任何非线性光学技术来应用，但是很多实施方案描述了使用二级技术(例如第二谐波产生和超雷利散射)。下列文献(及其中的参考文献)描述了非线性光学领域Nonlinear Optics，R.W.Boyd，1991，Academic Press.
The Elements of Nonlinear Optics，P.N.Butcher and D.Cotter，Cambridge University Press，1991.
非线性光学技术非线性光是在一种或多种基频将光束非线性转换得到的任意光(本文也称为基谐波光束)。非线性光学技术能够转换一种或多种入射光束(称为基谐波光束)的物理性质，例如频率，强度等。样品发出的非线性光束是较高次频光束，例如第二或第三谐波等，或是以和频或差频发出的光束。例如，在第二谐波产生(SHG)时，基谐波光束的两个光子实际上被样品散射，从而产生第二谐波的一个光子。在本文中非线性光学技术也称为表面选择性非线性光学技术。
第二谐波产生(SHG)和其它表面选择性非线性光学技术与样品中非线性活性物质的方向直接相关，因为基谐波和非线性光束之间有确定的相位关系，宏观的样品中非线性光束的波阵面(在相干长度范围之内)是同相的。非线性活性物质的方向上的任何变化能通过测定样品发出的非线性光束的一种或多种物理性质而检测。非线性光学技术的相干性产生了许多优点，有利于表面或高通量研究，在这些研究中，检测例如单个表面或微阵列表面。样品发出的非线性光束的相干性也使得可以区别样品发出的多条非线性光束。本发明的可替代实施方案中，实验如下进行，使用一种或多种频率的多个基谐波光束，与样品成一种或多种偏振方向入射，导致发出至少两种非线性光。使用非线性光基于表面选择性进行检测的装置，例如带有第二谐波产生的装置，只需最小限度的收集光(collectionoptic)，因为非线性光的产生只发生在界面上(不施加电场)，所以理论上，允许高精度的区分和快速扫描。
用于模拟依赖于界面非线性活性物质的方向的一般方程式是χ(2)＝Ns<α(2)>
其中χ(2)是非线性敏感度，Ns是界面上单位面积的分子总数，<α(2)>是这些分子非线性超极化率α(2)的方向分布的均值。描述产生第二谐波的非线性相互作用的一般公式是α(2)(2～)＝βE(ω)E(ω)或P(2)(2ω)＝χ(2)E(ω)E(ω)，其中α和P分别是以2ω频率振荡的诱导分子和宏观偶极子，β和χ(2)分别是超极化率和第二谐波(非线性)敏感度张量，E(ω)是以ω频率振荡的入射辐射的电场成分。宏观非线性敏感度χ(2)与微观β超极化率的方向均值相关。下一级关于诱导宏观偶极子膨胀的术语描述了其它非线性现象，例如第三谐波产生。第三级术语对应于双光子荧光这样的非线性现象。为了产生和频或差频，驱动电场(基谐波)在不同频率(即ω1和ω2)振荡，非线性辐射在和频或差频(ω1±ω2)振荡。
SHG的强度与非线性敏感度的平方成比例，并取决于样品中定向的非线性活性物质的量，因此SHG的强度与这种方向的变化成比例，这种变化不仅在界面，也在大量排列的物质(后者例如通过电场-极机制)。可以利用这种特性检测构象变化。例如使用非线性活性标签或部分检测受体的构象变化，该标签附着于或结合于受体；构象变化引起标签关于表平面(或施加电场的方向)的方向的变化并导致非线性光学信号的物理性质的变化。这种技术本身就对界面上的这些变化十分灵敏，也可以使它对大多数变化敏感，这是通过对极分子施加电场或简单地通过检测系统中由于其数量密度或方向的波动变化而能产生超雷利散射(HRS)的部分而实现的，如本领域人员知道的。
在超雷利散射(HRS)中，非线性活性分子的波动引起瞬时从中心对称的偏离，从而发生少量的第二谐波发射，虽然这种发射是不相干的。因为除了其它性质，波动依赖于分子大小，所以HRS可用于将溶液中的未结合分子与结合了一种或多种结合配偶体(本文中也称为探针)的同样的分子区别开。热能驱动HRS所需的波动，但也可施加外力诱导或放大波动，因而增强HRS信号。例如，通过向溶液中注射一阵或一股流体可以将流场用于暂时定向溶液中的分子。对样品施加脉冲和交流电场也能增强HRS信号。
文献中有很多使用HRS检测非线性光学分子的β(超极化率)的实例。本发明将HRS的用途扩展到检测结合相互作用和筛选能够结合或调节探针-靶相互作用的测试分子(本文中也称为靶)或调节剂(下文说明)。
下列文献(及其中的参考文献)描述了HRS技术Clays，K.et al.，″Nonlinear Optical Properties ofProteins Measured by Hyper-Rayleigh Scattering in Solution″，Science，v.262(5138)，1419-22Vance，FW，Lemon B.I.，Hupp，J.T.Enormous Hyper-RayleighScattering from Nanocrystalline Gold Particle Suspensions″，J.Phys.Chem.B 10210091-93(1999).
电场诱导第二谐波(EFISH)是非线性光学领域已知的技术，可以如本发明所述，使用该技术使正常情况下不是非线性活性的系统(例如体相)产生非线性活性，这是通过施加破坏体相的对称的电场而实现的。在一个具体实施方案中，用EFISH技术，通过施加dc电场诱导介质中的排列，并使得能够观察非线性活性(例如SHG)，从而测量溶液中分子的超极化率。这有时也称作再定向机制。
EFISH是第三级非线性光学效应，其偏振源写做P(2)(ω3)＝χ(2)(-ω3；ω1，ω2)Eω1Eω2偏振是施加两个光学场(opticalfield)和一个静电(dc)场的结果。下列文献描述了将EFISH技术应用到，例如液相和凝聚相样品
R.Dworczak and D.Kieslinger，Phys.Chem.Chem.Phys.，2000，2，5057-5064.
J.L.Oudar，J.Chem.Phys.，1977，67，446.
B.F.Levine and C.G.Bethea，J.Chem.Phys.，1974，60，3856.
B.F.Levine and C.G.Bethea，J.Chem.Phys.，1975，63，2666.
K.D.Singer and A.F.Garito，J.Chem.Phys.，1981，75，3572.
C.G.Bethea，Applied Optics，1975，14，1447.
B.F.Levine and C.G.Bethea，J.Chem.Phys.，1976，65，1989.
B.F.Levine and C.G.Bethea，J.Chem.Phys.，1974，60，3856.
B.F.Levine，J.Chem.Phys.，1975，63，115.
B.F.Levine and C.G.Bethea，J.Chem.Phys.1977，66，1070.
J.L.Oudar and D.S.Chemla，J.Chem.Phys.，1977，66，2664.
R.S.Finn and J.F.Ward，J.Chem.Phys.，1974，60，454.
B.F.Levine and C.G.Bethea，Appl.Phys.Lett.，1974，24，445.
另外，用来施加电场的电极可以在空间上排列(周期性排列)以实现半相匹配(quasi-phase matching)。半相匹配是已知技术，用于通过改变具有相干长度周期的材料的非线性敏感度，增加非线性活性材料的有效非线性路径长度。下列文献(及其中的参考文献)描述了这种技术M.Jger et al.，Appl.Phys.Lett.68，1996，1183.
M.M.Fejer et al.，IEEE Journal of Quantum Electronics，v.28，1992，2631.
G.D.Landry et T.A.Maldonado，Optics Express，v.5，1999，176.
在EFISH技术中，用来施加电场的电极可以采取例如现有技术中发现的多种形状，形式和组成。例如，电极可以是角状或点状的以增加这些情形中产生的电场强度。电极可以各种方式定位于样品中；例如，电极放置在基质上(如石印，印刷，蚀刻等)，该基材本身与含有靶和探针的液体样品接触；或者电极放置在其中流动或容纳含有靶和探针的样品的薄腔的底部或顶部。
非随机定向和非线性活性非随机定向是产生表面选择性非线性光学信号所必需的。只有系统的非中心对称区才能产生非线性光。如果空间存在一点，叫做“中心”或“倒置中心”，以这个点将所有原子倒置(x，y，z)→(-x，-y，-z)，而分子或材料不发生变化，那么这个分子或材料就是中心对称的。例如，如果一个分子是组成均一的且是球形的，它就是中心对称的。中心对称分子或材料没有非线性敏感度或超极化率，而这些是第二谐波或更高谐波，和频或差频产生所必需的。非中心对称分子或材料没有这个倒置中心，因此是非线性活性的。非中心对称区域可以在表面，例如阵列，基质等，或者在体相中，例如溶液，但是，体相需要施加电场破坏区域的对称以产生体相的非线性活性(同EFISH技术)。
本发明利用了下述性质，即当探针与靶结合后，探针相对于它要附着或定位的表面的任何非随机定向导致靶的非随机定向。系统的非随机定向使得可以利用非线性光学技术监测，例如表面的结合活性。系统非随机定向的任何变化，例如由于发生结合时的构象变化而产生的非随机定向的变化，可以修饰非线性光学信号。要确定检测到的非线性信号的变化是由构象变化引起的，可以利用本领域技术人员已知的对照来实现，该对照包括例如测定阻断化合物与受体的结合，已知该阻断化合物不产生受体的构象变化。
在一个实施方案中，探针或靶，或者两者都不是天然线性活性的，随后，在系统中引入不同种类的非线性活性物质以产生系统非线性活性。这些物质影响包含探针和靶的样品发射出的一种或多种非线性活性光束，这些物质包括如下所述的标签，修饰剂，指示剂，调节剂，抑制剂和增强剂。当本发明以标签或修饰剂应用时，靶的非随机定向产生标签或修饰剂的非随机定向，并直接导致表面选择性非线性光学信号(例如，强度)的增加。靶与附着或定位了探针的非特异性相互作用(例如与探针的非特异性结合)，或者靶与不存在探针的表面区域的非特异性相互作用(例如与基质或固体支持物的非特异性结合)会产生0值或低的多的表面选择性非线性光学信号，这是因为本领域技术人员熟知的相消性干扰。当本发明以指示剂应用时，探针的非随机定向也引起表面选择性非线性光学信号增加，因为表平面附近的表面电荷密度大于探针随机定向时的电荷密度，而探针随机定向导致较低的表面电荷密度。
非线性活性标签本发明所使用的标签是非线性活性部分，粒子或分子，它们能够共价或非共价的与分子，粒子或相(例如，脂双层)结合，以使获得的系统更具非线性光学活性。标签在下述情况中使用当分子，粒子或相(例如，脂双层)不是非线性活性的，而要使系统是非线性活性的；或者系统已经是非线性活性的，要在系统中加入额外的操作参数。外源标签预先附着在分子或粒子上，测定前将任何未结合或未反应的标签从标记实体中分离。在一个具体实施方案中，非线性活性部分在体外附着到靶或探针分子上。或者，标签留在含有探针和靶的溶液中，并吸附到一些粒子(例如增强剂)或表面，以产生与结合的标签不同的非线性活性反应(即超极化率或二级敏感度)。作为示例，根据本领域公知技术，用EFISH或超雷利散射确定候选分子或粒子是否为非线性活性的，其中适宜的对照和背景测定是在没有应用候选非线性活性物质存在的情况下进行的。用非线性活性标签和/或标签调节剂标记探针，就可以用表面选择性非线性光学技术以一种直接的光学手段检测探针-靶的结合反应，此时这种结合反应导致探针的方向或构象的变化。
本发明的另一个实施方案中，使用了至少两个不同的非线性活性标签。附着的两个或多个不同标签的方向选择为使发射的相干非线性光束的方向容易确定。两个或多个不同的标签可在下述试验中使用应用一种或几种频率的多条基谐波光束，该光束与样品成一种或几种偏振方向入射，导致发射出至少两条非线性光束。
确定一个具体分子或粒子能否作为非线性活性标签使用，一种方法是利用在空气-水界面发生的第二谐波产生来研究所述分子或粒子。例如，对于粒子，如果粒子在空气-水界面聚集，该聚集方式赋予粒子净余方向(netorientation)(在相干长度的长度等级上)，那么粒子层会产生第二谐波光。另一种方法是测量悬浮粒子样品，检测超雷利散射。还有另一种方法，包括使用EFISH确定候选分子或粒子是否是非线性活性的。通过以dc电场诱导介质中的排列并观察SHG，该作用以用于测定溶液分子的超极化率。这种类型的测量不需要粒子本身在界面上排序，但要求粒子是非线性活性的，并因此是非中心对称的。
在一个具体实施方案中，如上文所述，修饰金属毫微粒子及其聚集体以产生生物学非线性活性标签。下列文献描述了对金属毫微粒子及其聚集体的修饰J.P.Novak and D.L.Feldheim，“Assembly of Phenylacetylene-Bridged Silver and GoldNanoparticle Arrays”，J.Am.Chem.Soc.，2000，122，3979-3980.
J.P.Novak et al.，“Nonlinear Optical Properties of Molecularly Bridged Gold NanoparticleArrays”，J.Am.Chem.Soc.2000，122，12029-12030.
Vance，FW，Lemon B.I.，Hupp，J.T.Enormous Hyper-Rayleigh Scattering fromNanoerystalline Gold Particle Suspensions″，J.Phys.Chem.B 10210091-93(1999).
下列文献(及其中的参考文献)描述了由合成染料和许多其它分子生产生物标签的已有技术Greg T.Hermanson，Bioconjugate Techniques，AcademicPress，1996.
在一个具体实施方案中，采用已知程序步骤将非线性活性标签构建为对光束是光敏性或光调节性的，因此用选定的光束照射样品，标签就成为非线性光学活性的(或者是更多或更少的非线性光学活性)。所述光束能够例如断裂化学键(例如，应用紫外线)，现有技术中称为‘笼状(caged)’化合物。
调节剂调节剂包括当调节剂接近非线性活性物质时改变非线性活性物质的非线性反应的或包括改变探针-靶相互作用(例如结合反应)动力学或平衡特性的任何物质(例如，部分，分子，生物成分或化合物)。调节剂能够改变探针-靶结合的速率以及平衡常数，或者通常，促进或降低探针-靶相互作用。调节剂的例子如下抑制剂，药物，小分子，激动剂和拮抗剂以及Au粒子。在例如筛选过程中可检测候选调节剂作为调节剂的能力。
一个具体实施方案中，在存在一些相互作用调节剂的情况下检测探针-靶相互作用，调节剂例如小分子，药物，其它部分，分子或粒子，它们能够以某种方式改变探针-靶的相互作用(例如，与探针有一定亲和性且阻断或抑制靶结合)。调节剂在靶-探针相互作用发生之前，之中或之后加入。
抑制剂抑制剂降低或阻止探针-靶相互作用。抑制剂可以是任意物质，例如部分，分子，化合物或粒子。优选的抑制剂与靶-探针之间已知的结合相互作用竞争。抑制剂也是一种调节剂。本文中，抑制剂也称为阻断试剂或阻断剂。
一个具体实施方案中，通过检测当选抑制剂与受体和激动剂一同存在(激动剂可以是天然分子，合成分子等)时激动剂诱导的构象变化的消除，从而筛选可能是受体激动剂的抑制剂的化合物。
修饰剂修饰剂指能与靶，探针或靶-探针复合物结合并能从中被检测和区别的非线性活性物质(例如分子或粒子)。理想情况是，修饰剂本身不显著改变和参与靶-探针反应。修饰剂与非线性活性标签，例如SHG-活性标签的区别在于修饰剂具有对靶，探针或靶-探针复合物的特异性结合亲和性，而SHG-标签只是通过特定化学键或非特异性方式(例如静电)附着到，例如生物成分上。修饰剂可根据其对靶，探针或靶-探针复合物的特异性结合亲和性(也称为‘分子识别’)用于检测探针-靶复合物，并用于在表面选择性非线性光学技术中区别靶，探针或靶-探针复合物。例如，对双链DNA比对单链DNA亲和力强(较大的结合常数)的修饰剂，可用于检测与表面附着探针的杂交，因为在单链靶和探针的杂交过程中，定向修饰剂的量增加。一个具体实施方案中，修饰剂由非线性活性物质和另一物质构成，其中另一物质是生物成分(蛋白，抗体等)，构建体对探针，靶或探针-靶复合物有不同的结合亲和性，以使得能够使用表面选择性非线性光学技术对其进行区分。修饰剂也可以是具有非线性活性的非天然分子(例如，合成的化学分子，药物等)，它能与靶，探针或靶-探针复合物特异性结合(识别)，并且对上述三种物质有不同的结和亲和性，使得可以应用表面选择性非线性光学技术区分它们。一个具体实施方案中，修饰剂溶解于或悬浮于含有靶成分的溶液或水相中。
修饰剂分子或粒子的例子包括，但不限于，生物成分，核酸，蛋白，小分子，生物细胞，病毒，脂质体，受体，激动剂，拮抗剂，抑制剂，激素，抗体，抗原，肽，受体，药物，酶，配体，核苷，多聚核苷，碳水化合物，cDNA，激素，过敏原，cDNA，半抗原，寡核苷酸，生物素，链霉抗生物素，多核苷酸，寡糖，肽核酸(PNA)或核酸类似物。另外一些非限制性实施方案中，修饰剂包含下述家族的部分补骨脂素，溴化乙锭，磷酸甲酯，氨基磷酸酯，碘化丙锭，吖啶，9-氨基吖啶，吖啶橙，氯喹，pyrine，棘霉素，4′，6-二脒-2-苯基吲哚，二氢氯化物(DAPI)，琥珀酰氨吖啶-9-羧酸酯，氯喹，pyrine，棘霉素，4′，6-二脒-2-苯基吲哚，二氢氯化物(DAPI)，单链结合蛋白(SSB)，三吡咯肽，flavopiridol或焦宁Y。
指示剂以下部分详细描述指示剂。指示剂包括非线性活性分子或粒子，其在表面或界面附近的非线性光学性质和方向随着表面的电荷极化，电荷密度或电势的调节而调节。本发明的一个方面，固定在表面的靶与探针的结合调节表面的电荷或电势。另一方面，细胞表面电势由于离子通道性质的改变而变化，所述离子通道性质的改变例如开启，关闭，对应于靶(配体)结合的离子渗透性的增加或减少。本发明的另一个方面，指示剂作为标记用于成像，例如，细胞或组织成像。优选指示剂本身不相当大程度地改变或参与靶-探针反应。指示剂溶解于或悬浮在含靶成分的液体，介质，溶液或水相中。指示剂优选不移位到泡或细胞的脂双层中。指示剂优选对应于表面电荷密度或电势的变化而自由移动。
在水或溶剂中存在溶解的或悬浮的指示剂的情况下，测定玻璃-溶剂或玻璃-水界面的非线性光学反应，是分析候选分子是否能作为指示剂的方法之一。由于玻璃带有净余负电荷，如果候选分子存在时，在界面产生的非线性光学辐射强度大于候选分子不存在时的背景信号，那么该候选分子可以作为指示剂。另一种分析候选分子的指示剂能力的方法是，检测在半导体-液体界面产生的非线性光学辐射强度，它是在半导体和大量液体之间所施加电压(也因此是表面电荷密度)的函数。还有一种方法是检测候选指示剂溶液或悬液的超雷利散射(HRS)，因为如果HRS产生，并且候选分子本身是带电荷的或偶极性的，那么该分子就能作为指示剂。
唑类染料4-[5-甲氧苯基-2-唑基]吡啶甲磺酸盐(也称为4PyMPO-MeMs)是一个可用的指示剂，它在中性pH时具有很强的第二谐波活性和化学稳定性(Salafsky和Eisenthal，Chemical PhysicsLetters 2000，319，435-439)。另外，由于双光子吸收导致的荧光斯托克司频移很大，因此第二谐波光束容易与荧光分离。这个家族的其它染料具有相似性质(J.H.Hall等人，″Syntheses andPhotophysical Properties of Some 5(2)-Ary1-2(5)-(4-pyridyl)oxazoles and Related Oxadiazoles and Furans″，J.HeterocyclicChem.29，1245(1992))。这些和其他分子或分子聚集体可用作本发明的指示剂。这些分子包括，但不限于5-(4-甲氧苯基)-2-(4-甲氧苯基)-2-(4-吡啶基)唑2-(4-甲氧苯基)-5-(4-吡啶基)唑2-(4-甲氧苯基)-5-(4-吡啶基)二唑2-(4-甲氧苯基)-5-(4-吡啶基)呋喃2-(4-吡啶基)-4，5-二氢萘酚[1，2-d]-1，3-唑5-芳基-2-(4-吡啶基)-4-R-唑，其中R是氢原子，甲基，乙基或其它烷基2-(4-吡啶基)环烷并[d]唑2-(4-吡啶基)菲并[9，10-d]-1，3-唑6-甲氧基-4，4-二甲基-2-(4-吡啶基)茚并[2，1-d]唑4，5-二氢-7-甲氧基-2-(4-吡啶基)萘酚[1，2-d]-1，3-唑用作指示剂的其它分子或下述家族的分子包括，但不限于部花青茋吲哚二羰菁半花青Stilbazims偶氮染料菁族Stryryl-based染料亚甲基蓝二氨基苯化合物多烯偶氮茋三氰基乙烯基苯胺三氰基乙烯基偶氮三聚氰胺吩噻嗪-stilbazole聚酰亚胺磺酰取代的偶氮苯2，3-二氢-1-茚二酮-1，3-吡啶甜菜碱荧光素苯并唑苝聚甲基丙烯酸酯氧杂菁衍生的粒子指示剂毫微米到微米大小的固体微粒子或毫微粒子包括，但不限于，球状(乳胶，聚苯乙烯，硅石，等)或条状，它提供了一个能通过化学或静电方式用非线性活性部分衍生的表面区域，致使整个物质比用其它方式获得的具有高得多的超极化率。例如，非线性活性染料通过静电相互作用在硅石珠表面排列(染料是正电荷性，硅石表面是负电荷性)，且如果用靶反应性接头衍生，整个珠子就可以作为指示剂。如果非线性活性部分能够在固体表面排列，从而部分之间的相干扰很小，总体超极化率与其数量成非线性比例(例如，二次方程的)。固体粒子的形状可以变化，大小从毫微米到微米。可应用的粒子包括的实例，但不限于，聚苯乙烯珠和硅石珠，它们都已经是商品化的。
a.共价附着可用作指示剂的固体粒子，其表面能用现有技术已知的各种化合物衍生。非线性活性部分能共价偶联于固体粒子或其衍生层。
例如，聚苯乙烯珠能以葡聚糖，乳糖或胺衍生(后一种情况，是通过氯甲基基团与乙二胺联接)。硅石能以有机功能性硅烷衍生，例如使用三氯硅烷或其它功能性硅烷(例如甲氧基，胺，或其它功能性基团)，以产生各种化学功能性表面。衍生的珠表面随后与非线性活性部分进行适宜的化学反应产生指示剂。
b.静电附着非线性活性部分能够静电结合于微米或毫微米大小的粒子表面，产生具有大的超极化率的指示剂。带电荷的非线性活性部分，例如有机染料，可在带相反电荷的微粒子表面定向，因此当物体是合适的几何形状时，产生净余的超极化率。合适的几何形状例如球形微粒子，其直径约等于基谐波光的波长，即从几十毫微米到微米，以使球体相对面的非线性活性部分之间的相消性相干扰最小化。当越过约为光波长大小的球体的全部表面进行积分时，球体表面每个染料的超极化率是大的并且是正的。作为实例，但不限于所述实例，可使用下述程序步骤。硅石珠(约200nm，大致的球形)与低浓度的3-氨丙基三甲氧基硅烷或3-氨辛基三甲氧基硅烷反应，因此只有约5-10％的表面硅烷醇与硅烷试剂共价偶联。随后，这些胺基基团与胺基反应性同双功能交联剂二琥珀酰亚氨戊二酸(DSG，Pierce Chemical)反应，在约5-10％的珠表面产生胺基反应性接头。接着，珠与4-[5-甲氧苯基-2-唑基]吡啶甲磺酸盐(也称为4PyMPO-MeMs)一起温育，即通过静电结合于表面上带电荷的硅烷醇，并有一些程度的定向的带正电荷的染料。离心除去珠的剩余染料。在某些情况中，静电吸附强的足以固定带电荷的染料，即使不存在体相浓度。
现有技术中已知的和可使用的一些非线性活性物质包括，但不限于，下述物质及其衍生物唑或二唑分子5-芳基-2-(4-吡啶基)唑2-芳基-5-(4-吡啶基)唑2-(4-吡啶基)环烷并[d]唑部花青茋吲哚二羰菁半花青Stilbazims偶氮染料菁族
Stryryl-based染料亚甲蓝二氨基苯化合物多烯偶氮茋三氰基乙烯苯胺三氰基乙烯偶氮三聚氰胺吩噻嗪-stilbazole聚酰亚胺磺酰取代的偶氮苯2，3-二氢-1，3-茚二酮-1，3-甜菜碱吡啶荧光素苯并唑苝聚甲基丙烯酸酯氧青菁噻吩并噻吩为评估某物质是否有非线性活性，下述性质预示着潜在的非线性活性大的偶极矩差异(分子基态和激发态的偶极矩的差异)，大的荧光斯托克司频移，芳香性或共扼键性质。在进一步评估该物质中，实验人员可使用本领域技术人员熟知的简单技术确定非线性活性，例如检测空气-水界面的SHG，或当介质中存在或不存在要评估的物质时，检测EFISH的SHG。一旦从实验中筛选出了适合的非线性活性物质，如果需要，将该物质与对生物靶有特异性的物质缀合，由此产生用于表面选择性非线性光学检测或成像技术的靶构建体。
增强剂本文中增强剂指当放置于非线性活性物质临近时，能增强(增加)非线性活性物质(例如，部分，分子或粒子)横截面的物质(例如，部分，分子或粒子)(例如，增加产生的第二谐波辐射的强度)。现有技术中的增强效果的实例包括“共振增强”和“表面增强”。通过与增强剂的电子跃迁或细胞质基因组共振的共振，实现非线性活性横截面部分，分子或粒子的增强。在分子或表面上或其附近添加增强剂，导致增强剂例如共价，静电或非共价等的偶联于分子或表面，或者增强剂不直接与分子或表面偶联，而是接近分子或表面，例如增强剂吸附到细胞表面，使增强剂增加探针上标签的非线性反应。
下面(及其中的参考文献)描述了生产，设计和使用共振-增强粒子，例如金属毫微粒子，用于非线性光学方法(SHG，表面增强的共振拉曼，)S.Nie和S.Emory，Science，1997，75，1102；P.V.Kamat，M.Flumiani，G.V.Hartland，J.Phys.Chem.B，1998，102，3123；H.Ditlbacher等人，Appl.Phys.B，2001，DOI10，1007/s003400100700；C.Sonnichsen等人，Appl.Phys.Lett.，2000，77，2949；B.Lamprecht等人，Appl.Phys.B，1997，64，269；J.P.Novak，J.Am.Chem.Soc.，2000，122，12029；S.R.Emory，W.E.Haskins，S.Nie，J.Am.Chem.Soc.1998，120，8009；W.P.McConnell等人，J.Phys.Chem.B 2000，104，8925；F.W.Vance，B.I.Lemon，J.T.Hupp，J.Phys.Chem.B 1998，102，10091；P.Galletto等人，J.Phys.Chem.B 1999，103，8706；S.R.Emory，S.Nie，J.Phys.Chem.B 1998，102，493共振增强或表面增强的物质的存在使得可以增加样品的非线性活性横截面。现有技术中的共振增强物质的实例如下金属或金属性的(例如金，银)毫微粒子或胶体颗粒，金属涂覆粒子(例如，银涂覆的乳胶毫微球)，上述任一物质的集合体或簇，上述任一物质经合理设计的簇，链或集合体(例如，为破坏对称的非中心对称集合体，粒子或簇)，等。
在某些情况下，需要进行一些实验确定最佳的标记策略和/或使用增强剂或修饰剂进行指定测量。例如，靠经验调整偶联化学，反应条件等，确定最佳标记策略。当存在和不存在候选增强剂时，通过测量，例如非线性活性物质的SHG强度，测试候选增强剂对非线性活性物质的影响(如果必要，增强剂通过接头与非线性活性标签连接；或者例如通过探针-靶反应使增强剂接近标签)。当施加电场时(EFISH)，增强剂对非线性活性标签的影响可在界面(例如空气-水或固-液)或体相中发生。
分子标志类似物也可通过引入分子标志的非线性类似物来操纵系统的非线性活性，该类似物是经修饰整合非线性活性标签(或其调节剂)，而不是荧光团和猝灭剂的分子标志探针。这些分子标志的非线性光学类似物在本文中称作分子标志类似物(MB类似物或MBA)。用于本发明的MB类似物可根据本领域技术人员熟知的程序步骤合成。
在一个具体实施方案中，如本发明所述，用MB类似物探针作为杂交探针，它能报告互补靶核酸的存在，而无需将探针-靶杂交体与杂交实验中的多余探针分离，也无需对靶进行标记。标记靶不仅耗时，而且改变了样品中原本存在的靶的水平。MB类似物探针也用于检测活细胞中的RNA，用于监视密闭反应容器中特定核酸的合成，用于构建自报告寡核苷酸阵列。使用它们可进行同质的一试管实验，以鉴别DNA的单个核苷变异，检测固定在表面的用于界面监测的病原体或细胞。
图20A和20B说明了一个MB类似物探针的实施方案。具有超极化率，对应于一种或几种基谐波光束的照射能产生非线性光辐射的一种物质附着到探针的一端或一个位置(例如，染料分子，见图20B)。在接近非线性活性标签的探针的另一端或另一位置，附着有另一当两种物质接近时能增加或减少非线性活性标签产生的非线性光辐射的物质(例如，10nm金粒子，见图20B)。附着是通过共价键或通过本领域已知的其它一些方式实现的。一个具体实施方案中，非线性活性标签是具有超极化率的有机染料，例如公知的唑类染料及其衍生物。唑类染料及其衍生物可商业性的从Molecular Probes(Eugene，OR)获得，用胺基和巯基连接于各种探针，包括核酸。一种物质，例如金毫微粒子，已知它能增强与之接近的非线性活性物质产生的非线性光辐射，它可作为调节标签产生的非线性光辐射的物质。一个具体实施方案中，MB类似物探针固定在固体表面，例如平坦的玻璃表面或微球体表面，或者MB类似物用于同质溶液，并且在EFISH测量中用施加电场检测。如果MBAs固定在表面上，非线性活性物质至少在表面部分定向并满足表面选择性非线性光学技术所需的非中心对称条件。
Au毫微粒子能增强非线性光辐射的强度，例如当毫微粒子与唑染料彼此接近时，唑类染料以几个数量级散射第二谐波。探针与互补靶杂交时，非线性光辐射的强度降低并可根据探针-靶杂交的量来定量所述降低。除了其它因素，这种技术的灵敏性取决于杂交发生之前的背景非线性光学信号。用于检测与图20B所示探针杂交程度的各种靶序列是图20中的靶1-4(分别是SEQ ID NO1-4)。
本发明可用于检测靶样品的单核苷多态性(SNPs)，因为MBA探针在其与靶结合中有高度选择性，并且探针和靶序列之间一个碱基对的差异将产生与靶完全互补时相比低得多的杂交亲和性。MBA探针也可作为标签。
5.1探针-靶相互作用分析实验在本发明的描述中，测试分子也称为“靶”，候选结合配偶体也称为“探针”。下述是能根据本发明分析的探针-靶相互作用类型的例子i)探针-靶结合导致探针，靶或两者的构象变化。
ii)探针-靶结合导致非线性活性物质偶极矩的变化，所述物质是探针，靶或两者都是，作为探针-靶结合的结果。
探针-靶结合也能导致构象和偶极矩联合发生变化。
另外，检测探针-靶相互作用可在界面，体相中(同质相)，或包含界面和体相的区域进行。
本发明可应用于分子系统或单一分子——即，全体反应测量或单一分子反应测量。
一个优选实施方案中，靶是G蛋白偶联受体(GPCR)。GPCRs是一类蛋白，当被配体激活时会发生构象变化，因此能应用本发明对其进行研究。在这种情况中，如果GPCR自身不是非线性活性的，则使用非线性活性标签标记该蛋白，通过非线性活性标签的方向变化检测或查询构象变化。GPCRs能附着于表面，并且配体激活受体引起的构象变化可导致标签方向的变化，并因此使非线性光束(例如，第二谐波产生)的性质改变，例如强度，波长或偏振。如果需要，可在样品暴露于配体之前测量背景信号。
在某些情况中，一种成分与受体的结合将导致被测量的非线性光的性质的变化，即使该受体没有被激活。例如，这可能是因为结合复合物中该成分与受体之间的相互作用，该相互作用改变了附着于受体的标签的方向。如果需要，可进行对照实验将测得的非线性光性质的变化归因于该成分和指定受体的结合或激活。例如，使用已知结合指定受体但不产生构象变化的某成分作为标记反应的对照；如果标签方向上的任何测得的变化仅仅是由于受体的激活，则通过改变标签的结合化学以改变标记位点和/或遗传修饰受体引入新的标记位点。
例如，用与表平面(例如，宿主细胞膜)平均成θ角的方向(或超极化率方向)的非线性活性标签标记受体。受体与一些配体结合和/或激活后，标签与表平面的平均夹角变为β角。由受体结合或激活引起的即使是很小的角度变化也会导致测量的非线性光性质(例如，非线性光强度)的相当大变化。例如，如果产生的非线性光的强度与超极化率对膜平面垂直的向量成比例，那么角度变化引起的强度变化百分比是[cos(θ)/cos(β)]2，并且非线性光强度二次方的依赖于超极化率的垂直向量。例如，假设超极化率方向是δ函数，如果θ→β变化了25-30°，那么非线性光强度将降低约9％。
在某些情况中，需要一些实验确定最佳的标记策略和/或使用增强剂或修饰剂进行指定测量。例如，靠经验调整偶联化学，反应条件等，确定最佳标记策略。
或者，使靶分子溶解并利用其固有的偶极矩，通过液相中施加的电场使其极化；如果靶具有超极化率(即，靶或者原本就是非线性活性的，或者是通过附加非线性活性标签而变成非线性活性的)，通过EFISH技术将产生非线性光信号，并以该信号作为背景。加入配体(即探针)激活靶分子，将发生构象变化。如果该构象变化不导致靶分子产生相当大的偶极矩变化，那么靶分子的数量和净余方向也不发生相当大的变化。然而，如果这种构象变化传到非线性部分，其整体方向将改变，导致被测的非线性光性质的变化。如果配体与靶分子的结合导致非线性活性靶分子产生相当大的偶极矩的变化，在电场中排列的靶分子数量将改变，使被测的非线性光性质发生变化。溶液中于施加电场下排列的分子数量依赖于该分子的偶极矩。用于模拟该依赖程度的方程式是Langevin方程N＝N0exp(-μE/kT)，其中N是排列物质的数量，μ是其偶极矩，E是与偶极矩平行的电场大小，N0是暴露于电场中的分子数量，k是玻耳兹曼常数，T是开氏温标。探针-靶相互作用引起的偶极矩变化将导致排列分子数量的大的变化，以及这些分子产生的非线性光强度的大的变化。例如，带有非线性活性标签和给定偶极矩的探针与靶结合，形成的具有更大或更小偶极矩的探针-靶复合物导致产生的非线性光强度的变化。如果每个分子所带电荷的位置和数量是已知的话(例如，通常是蛋白的情况，其晶体结构是已知的)，那么测得的由于结合引起的变化也可用于计算分子的结合构象。
上述说明是任何导致偶极矩变化或构象变化的探针-靶相互作用的例子。离子通道蛋白是另一类对应于激活作用发生构象变化的重要的蛋白，也可应用本发明的方法对其进行研究。
表面选择性非线性光学技术也是一种相干技术，即基谐波和非线性光束之间有确定的相位关系，并且宏观样品中非线性光束的波阵面(在相干长度之内)是同相的。这些特性提供了很多优点，有利于表面或高通量研究，在这些研究中，例如检测单个表面或微阵列表面。使用非线性光基于表面选择性进行检测的装置，例如带有第二谐波发生的装置，只需最小限度的收集光，因为非线性光的产生只发生在界面上，所以理论上，允许高精度的区分和快速扫描。
探针-靶相互作用(例如，结合反应，构象变化等)与本发明在下述可测量的信息方面相互关联，例如i)非线性或基谐波光的强度ii)非线性或基谐波光的波长或光谱iii)基谐波光在表面或基质入射的位置(例如，为了成像)iv)非线性光的偏振现象v)i)，ii)，iii)或iv)的时程vi)i)，ii)，iii)，iv)和v)一个或几个的组合本发明的优点例举如下i)灵敏性并且直接依赖于样品中非线性活性物质的方向和/或偶极矩，有利于检测探针中的构象变化和导致非线性活性物质(例如，探针，靶或两者)的偶极矩发生相当大的改变的结合。
ii)与基于荧光的检测相比，具有更高的信噪比(更低的背景)，因为只有在形成非中心对称情况的表面，才产生表面选择性非线性光，或者在施加电场以诱导非中心对称的同质相中，对表面进行的表面选择性非线性光检测具有非常狭小的‘景深’(depth of field)。基于荧光的检测方案中，其荧光源包括从处于视野中但不在焦平面的物质发出的荧光，自身荧光，和杂散激发光对发射的荧光的污染；这些不是背景非线性光辐射的来源。
iii)当测量中要求存在液体溶液时，即在洗掉步骤消除或妨碍结合过程的测量中，非线性光学技术是有利的。本发明的这个方面可应用于需要大量物质存在的平衡测量(自由能，结合常数，等)，或应用于需要在一段时间进行的动力学测量。
iv)光漂白和热效应比发生在荧光中的更低——分子中双光子吸收横截面比单光子横截面低得多，并且非线性光学技术涉及散射，而不涉及吸收。
v)只需最小限度的收集光并预期更高的信噪比，因为基谐波和非线性光束(例如，第二谐波)相对于界面有确定的入射和射出方向。相对于基于荧光的检测，这是一个优点，在基于荧光的检测中，以各向同性的方式发出荧光，并且在目标平面(例如含有探针的界面)之外可能存在大的自身荧光背景。
vi)容易应用于珠，生物细胞，脂质体或其它粒子，它们不平坦的表面与支持介质，溶液等形成界面。
vii)容易从被靶实际激活的探针中(例如，受体)区别靶和探针的结合。
viii)探针和靶之间的结合过程在存在一种或多种小分子，药物，阻断剂或其它成分的情况下进行，这些物质影响探针-靶结合过程的性质，例如平衡常数，结合动力学等。
一个实施方案使用了表面阵列，该阵列用现有技术中已有的各种方法构建。对于DNA微阵列，多数是用三种非标准方法中的一种制备的(S.C.Case-Green et al.，Curr.Opin.Chem.Biol.2(1998)，404)Affymetrix，Inc.探针阵列用模式化的光指导的组合化学合成制备(S.A.Fodor，Science 277(1997)，393)；斑点阵列根据D.H.Duggan et al.，Nature Genet.21(Suppl.)(1999)，10；M.Schenaet al.，Science 270(1995)，467；P.O.Brown和D.Botstein，Nature Genet.21(Suppl.)(1999)，33；和L.McAllister et al.，Am.J.Hum.Genet.61(Suppl.)(1997)，1387的方法制备；喷墨技术也可用于一个碱基一个碱基的合成寡核苷酸，这是通过在适合的基质上按顺序的进行基于溶液的反应实现的(A.P.Blanchard etal.，Biosens.And Bioelectron.11(1996)687。这些文献的相关部分在此引入作为参考。
例如，核酸，寡核苷酸或核苷酸阵列如下构建Pat.No.6,110,426，Pat.No.5,143,8546,110,426(此处将其相关部分引入作为参考)，Pat.No.5,143,854(此外将其相关部分引入作为参考)或Fodor et a1.，“Light-directed Spatially-addressableParallel Chemical Synthesis，″Science，1991，251，767-773.可溶性蛋白阵列如下构建R.Ekins，F.W.Chu，Trends inBiotechnology，1999，17，217，(此处将其相关部分引入作为参考)。膜蛋白阵列可根据下述方法，通过流动脂质膜微模式(micropatterning)来构建Groves，J.T.，Ulman，N.，Boxer，S.G.，″Micropatterning fluid bilayers on solid supports″，science，1997，275，651-3(此处将其相关部分引入作为参考)。阵列基质可由玻璃，硅，铟锡氧化物，或已知的任何其它基质组成。所研究的表面阵列的元件之间可包含物理屏障物，因此在化学反应步骤中，元件(及其生物分子)彼此保持隔离。阵列位置由不同探针，各处的相同探针或它们的某种组合构成。也可在棱镜的下侧构建阵列使得光束全内反射和短暂的非线性光产生。或者将阵列基质与棱镜接触，也产生同样的结果。
电泳系统可与表面阵列联合使用，例如使用流体通道或微毛细管将试剂或生物成分传递到一个或多个位点。样品包括微毛细管通道的阵列，彼此各不相同，每一个都允许靶-探针反应发生；成像技术也由阵列元件组成，每个元件是微毛细管通道或通道流入或排空的反应室。
基谐波和非线性光束的偏振可用偏振光器件选择。通过分析非线性光束的强度(它是基谐波和非线性偏振的函数)，可获得更多关于探针-靶复合物的信息(例如，更高的信噪比)。并且，通过选择和分析基谐波或非线性光辐射的偏振，背景辐射将降低或信号强度增加。
检测也可使用多重内反射板来完成(N.J.Harrick，″InternalReflection Spectroscopy″，John Wiley & Sons，Inc.，New York，1979此处将其相关部分引入作为参考)，它使得基谐波光束与阵列表面多重接触，因此产生的非线性光强度增加。另一种选择方案是构建一侧有阵列表面而一端有损耗性耦合器的光学空腔，以允许非线性光的输出耦合，形成光学微腔，它在共振条件下能够积累非常高的强度，因此增加产生的非线性光的量。
多核苷酸阵列可作为探针。寡核苷酸是靶或探针时，优选非线性活性标签附着于5′或3′端。有许多联接部分和方法将分子(可以是非线性活性标签)附着到寡核苷酸的5′或3′端，如下述参考文献所例举的Eckstein，编者，Oligonucleotides and AnaloguesAPractical Approach(IRL Press，Oxford，1991)；Zuckerman等人，Nucleic Acids Research，155305-5321(1987)(寡核苷酸上的3′硫羟基)；Sharma et al.，Nucleic Acids Research，193019(1991)(3′巯基)；Giusti et al.，PCR Methods and Applications，2223-227(1993)和Fung et al.，U.S.Pat.No.4,757,141(通过购自Applied Biosystems，Foster City，Cafil.的Aminolink.TM.II 5′磷氨基)Stabinsky，U.S.Pat.No.4.739,044(3′氨基烷基磷酰基)；Agrawal et al.，Tetrahedron Letters，311543-1546(1990)(通过氨基磷酸酯键附着)；Sproat et al.，Nucleic Acids Research，154837(1987)(5′巯基)；Nelson etal.，Nucleic Acids Research，177187-7194(1989)(3′氨基)；此处将其考相关部分引入作为参考。
优选在合成过程中使用商业可获得的联接部分标记寡核苷酸，例如，从Clontech Laboratories(Palo Alto，Cafil.)获得。一个具体实施方案中，固相合成结束时，用以亚磷酰胺衍生染料的方法可以很方便的将罗丹明和荧光素染料附着到寡核苷酸的5′羟基，例如Wooet al.，U.S.Pat.No.5,231,191；和Hobbs，Jr.，U.S.Pat.No.4,997,928，此处将其相关部分引入作为参考。
优选，寡核苷酸存在于阵列中。
蛋白阵列可用于确定一个给定的靶蛋白是否与固定在表面的探针蛋白结合；这些阵列也可用于研究与探针蛋白结合的小分子。蛋白阵列可按照如下方法制备G.MacBeath和S.L.Schreiber，″PrintingProteins as Microarrays for High-Throughput FunctionDetermination″，Science 2000，289，1760-1763，用于，例如，确定一个给定的靶蛋白是否与固定在表面的探针蛋白结合。
探针在其上形成的表面可由广泛范围的材料组成，生物的，非生物的，有机的，无机的，或这些物质的任意组合，存在形式有颗粒状，线状，沉淀物，凝胶，薄片，管状，球状，容器状，毛细管，垫状，薄片，薄膜，板状，片状等。表面可以是任何便利的形状，例如，盘状，方形，球形，圆形等。表面优选平面但也可选用另外各种表面构型。例如，表面包含凸起和凹陷区域，样品就放置于此处。表面及其外表优选形成刚性支撑物，以使样品在其上形成。选择表面及其外表以提供适当的光吸收性质。例如，表面是聚合的Langmuir Blodgett薄膜，功能化玻璃，Si，Ge，GaAs，GaP，SixOy，SixNy，改性硅，或广泛范围的任意一种凝胶或聚合物，例如(聚)四氟乙烯，(聚)偏二氟乙烯，聚苯乙烯，聚碳酸酯及其组合。根据这些综述说明，其它表面材料对本领域人员是显而易见的。一个优选实施方案中，表面是平坦的玻璃或硅石。
一些实施方案中，用已知的技术对基质的表面进行蚀刻以提供期望的表面特性。例如，采用形成管沟，v-槽，台式结构等方式，使合成区域更加接近于照射光的焦点。表面也可带有反射“镜”结构以最大化的发射所收集的光。
探针的化学特征(例如，蛋白结构或寡核苷酸序列)从固体表面的一个位点到另一位点变化，或者相同的探针均一的覆盖表面。靶可以且有单一特征或者是不同特征的靶的组合。
一个具体实方案中，测得探针-靶结合反应的动力学是靶浓度的函数。在该实施方案中，测量非线性光强度和/或光谱的时程。测得的信息转化为结合的靶浓度的时程(例如，以mM/s或μM/s表示的探针-靶的浓度)。也可使用探针-靶结合平衡或形成的动力学速率的药物或调节剂，以比较添加的物质对探针-靶反应的影响。
不涉及使用表面选择性非线性光学技术的各种现有技术，包含与本发明相关的部分。下面列出的实例及其中的参考文献作为本发明的参考King et al..，U.S.Patent 5,633,724描述了对扫描物的扫描和分析；Fork et al.，U.S.Patent 6,121,983描述了激光的多路技术以产生适合于扫描的激光阵列；Foster，U.S.Patent5,485,277；Fodor et al.，U.S.Patent 5,324,633和Fodor etal.，U.S.Patent 6,124,102描述了含有附着探针阵列的基质，以及扫描分析确定探针和靶之间结合反应的动力学和平衡特性；Kainet al.，U.S.Patent 5,847,400描述了对基质的激光扫描；Kinget al.，U.S.Patent 5,432,610描述了用于积聚能量的光学共振空腔；Walt et al.，U.S.Patent 5,320,814，Walt et al.，U.S.Patent 5,250,264，Walt et al.，U.S.Patent 5,298,741，Walt et al.，U.S.Patent 5,252,494，Walt et al.，U.S.Patent6,023,540，Walt et al.，U.S.Patent 5,814,524，Walt et al.，U.S.Patent 5,244,813描述了基于光纤的设备；Fiekowsky etal.，U.S.Patent 6,095,555，描述了成像及对图象的基于软件的分析；Stern et al.，U.S.Patent 5,631,734描述了数据采集；Stimson et al.，U.S.Patent 6,134,002描述了共焦成像技术；Sampas，U.S.Patent 6,084,991描述了基于CCD的成像技术；Stern et al.，U.S.Patent 5,631,734描述了光刻制备附着于表面的探针；Shalon et al.，U.S.Patent 6,110,426描述了制备附着于表面的探针的方法和设备；Slettnes，U.S.Patent 6,040,586描述了基于位置的扫描技术；Trulson et al，U.S.Patent 6,025,601描述了探针-靶结合于表面的成像方法。
附着于表面的细胞和细胞微阵列这部分概述了有关生物细胞与表面的分界以及在表面构建生物细胞阵列的一些方法，它们能用于本发明的实验。已经描述了很多方法制备均一微模式的细胞阵列用于其它应用，例如使用光化学抗光刻法(Mrksich和Whitesides，Ann.Rev.Biophys.Biomol.Struct.2555-78，1996).。在这种光致抗蚀剂法中，用光致抗蚀剂均匀覆盖玻璃平板，并在光致抗蚀剂涂层上放置遮光模以确定期望的“阵列”或模式。在曝光后，未遮盖区域的光致抗蚀剂消除。全部的光刻限定表面被疏水性物质均匀覆盖，这种疏水性物质例如有机硅烷，它不仅结合于裸露的玻璃表面，也结合于光致抗蚀剂覆盖的表面。然后，将光致抗蚀剂从玻璃表面剥离，裸露出的玻璃上显出斑点阵列。接着，用有机硅烷洗涤玻璃平板，该有机硅烷具有末端疏水基团或化学反应性基团，例如氨基。疏水性有机硅烷结合于裸露玻璃上的斑点，形成的玻璃平板其疏水表面上具有疏水性或反应性斑点组成的斑点阵列(位于初始光致抗蚀剂存在的区域)。疏水基团的斑点阵列提供了与某种细胞，包括神经元起源细胞进行非特异性和非共价结合的基质(Klienfeld et al.，J.Neurosci.84098-4120，1988)。反应性离子蚀刻已被类似地应用于硅晶片表面产生具有两种不同类型纹理的表面模式。(Craighead et al.，Appl.Phys.Lett.37653，1980；Craighead et al.，J.Vac.Sci.Technol.20316，1982；Suhet al.Proc.SPIE 382199，1983)。
在基于特异性然而非共价相互作用的其它方法中，使用光致抗蚀剂冲压产生被蛋白吸附性链烷硫醇覆盖的金表面(Singhvi et al.，Science 264696-698，1994)。裸露的金表面用抑制蛋白的吸附的聚乙烯封端的链烷硫醇覆盖。将整个表面暴露于层粘连蛋白后，胞外基质中发现了细胞结合性蛋白，活的肝细胞均匀的附着于层粘连蛋白覆盖的岛并在其上生长。(Singhvi et al.1994)。采用涉及强的，但非共价的金属螯合作用的精加工，以特定蛋白模式覆盖金表面(Sigal etal.，Anal.Chem.68490-497，1996)。在这种情况中，用次氮基乙酸封端的链烷硫醇模式化金表面。金裸露区域用三(乙二醇)覆盖以减少蛋白吸附。添加Ni2+后，发现由5个组氨酸标记的蛋白的特异性吸附是动力学稳定的。
通过将特定分子，例如蛋白化学交联于模式基质的的反应性位点，可以实现更加特异的，均一的细胞结合(Aplin和Hughes，Analyt.Biochem.113144-148，1981)。对基质的另一种光学模式的精加工制造了反应性斑点阵列。用化学吸附于玻璃的有机硅烷洗涤玻璃平板以覆盖玻璃。通过确定阵列模式的遮光模用深度紫外线照射有机硅烷涂层。这种照射断裂Si-C键形成反应性Si自由基。与水的反应使Si自由基形成极性的硅烷醇基团。极性的硅烷醇基团组成阵列的斑点，并经进一步修饰与斑点上的其它反应性分子偶联，如U.S.Pat.No.5,324,591所述，在此将其引入作为参考。例如，含有生物功能性基团，如自由氨基部分的硅烷可以硅烷醇基团反应。自由氨基基团可作为生物分子共价附着的位点，所述生物分子例如蛋白，核酸，碳水化合物和脂类。利用表面上自组装的单层使哺乳细胞在表面上的粘着模式化的其它方法，包括Lopez et al.，″Convenient Methods forPatterning the Adhesion of Mammalian Cells to Surfaces UsingSelf-Assembled Monolayers of Alkanethiolates on Gold，″J.Am.Chem.Soc.，1993，115，5877-5878，Georger et al.，″CoplanarPatterns of Self-assembled Monolayers for Selective Cell-adhesion and Outgrowth，″Thin Solid Films 210(1-2)716-719APR 30 1992，和Spafgo et al.，PNAS 91(23)11070-11074(1994)。
已经说明了通过反应性氨基，将凝集素非模式化的共价附着于玻璃基质，已知凝集素与细胞表面相互作用(Aplin和Hughes，Analyt.Biochem.113144-148，1981)。在支持物上形成细胞的均一阵列的光学方法需要较少的步骤，并且比光致抗蚀剂法更快(例如，只需两个步骤)，但需要使用昂贵光源发出的高强度的紫外线。
细胞在表面培养或生长，不需要另外的衍生作用。现有技术中已知的这种类型的表面包括Becton-Dickinson Falcon盘等。
所有这些方法制造的细胞阵列或表面附着细胞层是均一的。在光致抗蚀剂法中，细胞结合于疏水性斑点阵列和/或特定分子附着于这些斑点，随后结合细胞。因此，细胞以相同的方式结合到阵列中所有斑点上。在光学方法中，细胞通过粘附作用与阵列中的斑点的自由氨基基团结合。也存在并可使用将各种细胞类型附着于相同的基质以同时结合这些细胞类型的方法。
核酸阵列核酸阵列在很多生物学和临床研究中是有用的，这些研究中，使用阵列平行的分析一种或多种基因。遗传性疾病通常是由于基因不适当的转录引起的——或者太多或者太少——或者全部缺失。这种缺陷在癌症中尤其普遍，当调节基因被删除，失活，或变成组成型活性时，都发生这种缺陷。与一些由于单个缺陷基因导致的遗传疾病(例如囊性纤维化)不同，临床表现相似的癌症，遗传学上是异质的。http//www.cs.wustl.edu/～jbuhler//research/array/glossary.html-geneticallyheterogeneous。例如，即使对于一个病人，前列腺癌(前列腺腺癌)也可以是由几个不同的，独立的调节基因缺陷导致的。在一组前列腺癌病人中，每一个人都可能有一组不同的丢失或缺损基因，预示着对该疾病不同的预后和治疗。
癌症研究中，比较杂交能达到两个目的它能精确查明使正常细胞改变为癌细胞的转录差异，它能区别异质癌症中异常转录的不同模式。了解癌症的各种不同的原理对于发明靶向各种不同的疾病的治疗方法是至关重要的，这样每个病人才能获得最适合的和最有效的治疗。
癌症是遗传学异质疾病的普通实例，但决不是唯一的实例。糖尿病，心脏病，和多发性硬化也属于这种已知其遗传风险因子是异质的疾病。
肽-核酸另一实施方案中，本发明使用了肽核酸和寡聚体，它是核酸的类似物，其中肽样主链取代不带电荷的主链。PNAs在现有技术中是已知的。下面的参考文献提供了关于在很广泛的应用范围中使用这些核酸类似物的综述，包括表面和基于阵列的杂交，其中PNAs附着于表面并允许序列互补的DNAs或RNAs与其结合。
例如，使用PNA寡聚体代替DNA寡聚体作为表面附着探针成分。使用PNA寡聚体的一个主要优点是，与例如DNAs或RNAs(含有带电的磷酸基团)的杂交反应仅微弱地依赖于(例如解链温度)离子强度，因为它的电荷排斥比传统的DNA-DNA等杂交中的小的多。因此，可使用表面选择性非线性光学技术，在任意的离子强度条件下跟踪探针-靶杂交。PNAs是商业上可获得的(例如，从Applied Biosystems，Foster City，CA)，或者其它DNA类似物可以合成并使用。
下述参考文献是关于使用PNAs的综述Nielsen，et al.″Peptide nucleic acids(PNA)Oligonucleotide analogues with a polyamidebackbone″Antisense Research and Applications(1992)363-372Nielsen，et al.″Peptide nucleic acids(PNAs)Potential Antisense and Anti-gene Agents.″Anti-Cancer Drug Design 8(1993)53-63Buchardt，et al.″Peptide nucleic acids and their potential applications in biotechnology″TIBTECH 11(1993)384-386Nielsen，P.E.，Egholm，M.and Buchardt，O.″Peptide Nucleic Acid(PNA).A DNA mimicwith a peptide backbone″Bioconjugate Chemistry 5(1994)3-7Nielsen″Peptide nucleic acid(PNA)A lead for gene therapeutic drugs″AntisenseTherapeutics 4(1996)76-84
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下述文献描述了在基于阵列的检测中使用PNAs，包括将PNAs探针附着到固体表面的方法Hoffmann，R.，et al.″Low scale multiple array synthesis and DNA hybridization of peptidenucleic acids″Pept.Proc.Am.Pept.Symp.，15th(1999)233-234Matysiak，S.，Hauser，N.C.，Wurtz，S.and Hoheisel，J.D.″Improved solid supports andspacer/linker systems for the synthesis of spatially addressable PNA-libraries″NucleosidesNucleotides 18(1999)1289-1291.
5.2附加实施方案附图阐明了利用第二或更高次谐波以及和频或差频产生的装置和样品的各种具体的实施方案。
图1举例说明了一个实施方案，其中通过从表面反射入射的基谐波光产生第二谐波光。光源5提供了在样品中产生第二谐波光所必需的基谐波光。一般的光源是皮秒或毫微微秒激光，波长可调或不可调，并且商业上可获得。激光器发出基频(ω)的光线且其偏振通过使用，例如合乎该光线频率和强度的半波板10进行选择(例如，从MellesGriot，Oriel or Newport Corp.获得)。光束经透镜15聚焦并穿过滤光器20，该滤光器设计成透过基谐波光但阻断非线性光(例如，第二谐波)。滤光器用来阻止第二谐波光束回射到激光器腔中，这会干扰激光的性质。光束经过镜子25的反射，以相对于表面特定的角度θ照射到表面的特定位置。如果需要，可使用下述仪器扫描镜子25以控制镜子的位置，所述仪器是检流计控制的镜扫描仪，旋转的多角形的镜扫描仪，布拉格衍射器，声光偏转器，或本领域已知的其它方法。样品表面3O可以放置在一个x-y平移台35上(计算机控制)从而在表面上选择特定位置以产生第二谐波光束。表面可以是玻璃，塑料，硅或其它任意能反射基谐波或第二谐波光束的固体表面。样品表面可以被密封，且表面与液体接触。另外，使用微毛细管或其它液体运输通道(未显示)，泵或电泳元件将样品30注满或排空，上述装置都是计算机控制的。基谐波或第二谐波的输出光束(与表面成特定夹角，即θ1-一般它们的方向接近一条直线)从表面反射，基谐波用适合于第二谐波光束的滤过器45滤过，只留下谐波光束(2ω)。第二谐波被镜子40反射，如果必要，以偏振光50选择其偏振，并用透镜55聚焦到检测器60。透镜15和55可以是现有技术中用于聚焦或光束成形的透镜的任意组合。如果需要，可使用单色器60在第二谐波光束的光谱波段中选择特定波长。检测器可以是光电倍增管，CCD阵列，或现有技术中已知的高灵敏性的其它任意检测装置。例如，使用以单光子计数模式运行的光电倍增管。在检测器中，光产生与其强度成比例的电压。记录和扫描(或其组合)阵列表面每个位置的随发展进程转变的数据，并绘出表面每个区域产生的第二谐波强度的图。
申请人设想使用和频或差频，其中使用与图1结构类似的装置，单光源5被双光源取代，该双光源发出频率ω1和ω2的两个基谐波光束。和频或差频(Ω)即为Ω＝ω1±ω2。当样品表面是由离散元件组成的阵列时，单个元件或平行的多于一个的元件可以被基谐波光访问。而且，依赖于特定的装置结构，可以检测单个元件或平行的多个元件。
图2举例说明了一个实施方案，其中利用全内反射(损耗波产生)产生第二谐波。基谐波光(ω)直接指向棱镜元件70的表面。光束在位置(a)折射，穿过棱镜和指标匹配膜75照射基质80。棱镜70和基质80由光学透明材料构成，并优选相同类型的材料。棱镜70是Dove棱镜或支持损耗区域的任意其它元件(例如，波导管，纤维和薄金属膜)。折射性的指标匹配膜75可以是油，但优选如Sjodin所公开的可压缩性光学聚合物″Optical interface means″，PCT publicationWO 90/05317，1990。棱镜75和基质80可以是一元的，由相同材料构成的整片(即，不含指标匹配膜)。根据在80和85中的折射率及在其界面上光束的入射角，在80与样品室85中的介质形成的界面上产生损耗波。电场振幅从基质表面指数性的衰减，1/e的长度为从毫微米到微米，这种衰减依赖于几种因素，包括表面电势，样品室中平衡离子的密度(如果有的话)。样品室充满空气，气体或液体例如溶液或水。面向样品室的表面80上的‘x’标记强调目标样品(例如，构建的探针)放置在这一边。基质80可以是能从75和85之间滑出的“芯片”，以测量不同的基质。图中的元件90是样品室的一个通道，它能通过例如泵，静电等方式将液体或气体输入或抽出样品室。如果必要，整个样品装配在x-y平移台95上。
图3举例说明了一个实施方案，其中使用板状电介质波导管将基谐波光传递到样品表面(光束的产生，定向和检测如图I的元件1-5和8-13所示)。可利用平行板或电介质波导管将基谐波光偶联到波导管传播模式中。图中显示了两个板极(110和115)以及区域(120)。如果板极115和区域120的折射率小于光的折射率(基谐波和第二谐波两者)，则形成波导管模式。这种模式在基质中产生多重内反射，它可用于增加界面产生的第二谐波光的量。例如，可以用在波导管上表面划出或雕出的衍射光栅105将基谐波光束100与波导管110偶联。基谐波沿波导管的长度传播并在表面的顶部和底部形成多重全内反射。基质110上的‘x’标记表示所要测量的样品表面(即，包含探针)。如果这个界面比材料110和115之间的界面明显产生更多的第二谐波光，那么光强度可以忽略不计。例如，如果SH标记的靶与固定在‘x’位置的探针结合，并且110和115之间界面的原子结构在外延上匹配，那么110/120界面产生的第二谐波光比110/115界面产生的多得多。
另一实施方案中，一个平面波导管结构110用于固体基质(图3)。在这个实施方案中，具有高折射率材料的一薄层115(波导管)，例如TiO2或Ta2O5，沉积在基质110顶部(一般是玻璃)。波导管中划有一个细的衍射光栅115，且激光器100发出的光应用该光栅偶联进波导管中。用透镜和滤光器收集第二谐波光，并用PTM型检测器或CCD相机检测。
图4A-C举例说明了一个进行探针-靶反应的流动池的实施方案。流动池3220的细节如图所示。图4A是正视图，图4B是横截面视图，图4C是空腔的后视图。参考图4A，流动池3220包括其表面4202上的空腔3235。空腔的深度例如可为约10-1500mu.m，但也可采用其它深度。一般，空腔的表面积大于探针样品的尺寸，约为13×13mm。进口4220和出口4230与空腔相通。一些实施方案中，进出口的直径约为300-400mu.m并分别通过管4221和4231与冷却循环池相连，以控制空腔的温度。冷却池的循环水以特定的温度进出空腔。
空腔周围形成很多沟槽4208，使其与流动池的其它部分热隔离。由于流动池的热质减少，空腔的温度将得到更加有效和精确的控制。
一些实施方案中，一个具有基本上平坦表面的面板4205将空腔分为两个亚空腔。面板4205可以是光吸收性玻璃，例如RG1000nm滤过器。RG1000玻璃在可见光谱的高吸收性(在低于700nm的任何波长都检测不到RG1000的表面发射率)能基本抑制任何可能会被入射波长激活的背景发光。光吸收玻璃光亮平滑的表面也减少了入射光的散射，减轻了在入射波长过滤杂散光线的负担。玻璃还提供了一个再次分隔空腔的耐用介质，因为玻璃相对来说更能抵抗在DNA杂交实验或其它化学反应中普遍存在的高盐环境的侵蚀。
面板4205可用多个螺钉，夹子，RTV聚硅氧烷接合剂或其它粘合剂安装在流动池中。参考图4B，包含入口4220和出口4230的亚空腔4260被面板4205封闭。因此，冷却池中的水与空腔3235隔离。这种设计提供了分隔的空腔以进行化学反应和控制温度。因为控制温度的空腔就在进行反应的空腔下面，所以反应的温度参数能被更有效的控制。
基质130与表面4202配合并封闭空腔3235。优选地，当基质和流动池匹配时，基质上的探针阵列包含在空腔3235中。一些实施方案中，以O形环4480或其它密封材料改善基质和流动池的匹配。可任选的，面板4205的边缘4206是倾斜的，使得可以采用更大的密封横截面以改善匹配且不增加空腔的体积。一些实施方案中，希望保持空腔的体积越小越好以便更加精确的控制反应参数，例如温度或化合物的浓度。另外，更小的体积只需要更少量的材料进行实验，因此废弃物也减少。
再回到图4A，凹槽4211可任选的在表面4202上形成。凹槽，例如约2mm深，2mm宽。一个实施方案中，凹槽4211当安装在表面4202上时被基质遮盖。凹槽与通道4213和连接于真空泵的真空装置4212相通。真空泵使凹槽内产生真空，从而使基质粘附到表面4202。任选的，使用一个或多个垫圈改善流动池和基质之间的密封。
图4D举例说明了基质与流动池匹配的另一种技术。当安装到流动池时，面板4290施加足够使基质130固定在两者之间的压力。面板4290可用例如多个螺钉4291，夹子，夹钳，针，或其它安装装置安装。一些实施方案中，面板4290包括开口4295以使样品暴露于入射光。开口4295可任选的被玻璃或其它基本透明或半透明的材料遮盖。或者，面板4290由基本透明或半透明的材料构成。
参考图4A，面板4205包括与亚空腔3235相通的出入口4270和4280。管4271与4270连接，管4181与4280连接。管4271和4281通过连接管4222分别插入管4221和4231。连接管4222，例如，可以是T形连接管，均在其开口4223有密封装置4225。密封装置4225能阻止冷却池中的水从连接管渗漏。应该理解，可以使用其它构型，例如能提供类似4220和4230的附加通道。
管4271和4281使得选择的流体能引入空腔或通过空腔循环。一些实施方案中，管4271和4281可与泵相通，以使流体通过空腔循环。一个实施方案中，管4271和4281与搅动系统相通，该搅动系统搅动并使流体通过空腔循环。
参考图4C，凹槽4215任选的在流动池的表面4203上形成。凹槽的尺寸例如为约2mm深，2mm宽。一个实施方案中，表面4203与平移台匹配。当流动池在平移台上匹配时，凹槽4211被平移台遮盖。凹槽4215与通道4217和连接于真空泵的真空装置4216相通。真空泵使凹槽4215内产生真空，从而使表面4203粘附到平移台上。任选的，形成额外的凹槽以增加匹配压力。任选的，可用螺钉，夹子，针，各种类形的粘合剂或其它固定技术将流动池安装在平移台上。
进一步的可选实施方案中，如图5A-C所示，珠，细胞，脂质体或其它物体的悬液含有探针(130)。从这些样品中散射的非线性光——例如，一个各向同性的样品，其中的每个珠或其他物体都具有相干长度或进一步分离——以某种强度分布在各个方向产生。基谐波光透射过悬液(130)，收集非线性辐射。可采用多种散射非线性光的收集模式。例如，从正向(A)，与基谐波光成直角(B)，或使用累计球的方法(C)收集第二谐波。C部分显示了一个累计球165，样品150放置其中。基谐波光(145)进入入射口(170)，穿过样品(150)，在球壁反射并被反射板(175)停止。通过出口(155)从球体表面收集散射的第二谐波光，并通过光纤线(160)偶联到球体外。细胞是研究受体，细胞表面分子和其它生物成分构象变化的一个方便和天然的系统。珠可以支撑磷脂双层(例如，带有膜蛋白)，或者探针例如蛋白或核酸能附着于其表面。珠给样品提供了大量的分布表面积，它能有效代替平面表面形状，尤其是当基谐波和非线性光用于透射模式时。
一个可选实施方案中(图6)，用各种光学装置将激发光从点状转变成一些其它形状。例如，呈点状光束形状的基谐波光束转变成线状，以利于扫描样品表面。然而，除了其它因素，由于非线性光束的强度依赖于基谐波的强度(一般，以二次方程的形式依赖于基谐波的强度)，这种转化将导致在给定的位置产生较少的非线性光强度。为了产生线状的基谐波(一般，是一个约2mm直径的圆点)，可将基谐波光束投射到具有约10倍放大率的显微镜物镜，然后用150nm消色差透镜校准光束，这种方法是现有技术中已知的，如在U.S.Pat.No.5,834,758.中所公开的。如图6所示，一般的基谐波光180的光束直径为2-3mm。该光束穿过显微镜物镜185。该物镜的放大率是10，将光束扩张至约30mm。光束穿过透镜190。该透镜可以是150nm消色差透镜，可以校准光束。一般，经扩张的校准光束的光线强度成高斯分布。为使光束的强度变化最小化，在透镜190后面插入掩蔽物195以掩蔽光束的顶部和底部，因此只有光束的中央部分通过。一个实施方案中，掩蔽物允许通过约7.5mm的水平光束。然后，该光束穿过柱面透镜200，该透镜具有100mm f.l.的水平圆柱轴，由Melles Griot在制造。柱面透镜在垂直方向扩张光束点。或者，使用双曲透镜垂直方向扩张光束，此时产生拉平的光强度分布。光从柱面透镜穿过透镜205。任选的，在柱面透镜后插入平面镜以反射激发光朝向透镜205。为获得约15mm高的光束，柱面透镜200和透镜205的焦距比例约为1∶2，这样能将光束放大到15mm。透镜205，在一些实施方案中是80mm消色差透镜，将光聚焦于样品表面210上约15mm×50微米的线上。
如图7A-B所示的可选实施方案中，探针模式是一个二维阵列(A，表面上阵列的俯视图)，其中表面的每个区域—— 实施方案中是{1，35}——可以是不同的寡核苷酸或蛋白序列(或者是相同序列或不同序列的组合)。B部分是孔(215)中含有靶(225)的样品表面(220)的侧视图，此处显示的靶是附着有第二谐波活性标签(X)的蛋白。孔中容纳液体或缓冲液，使孔中成分与基质的其它部分或基质阵列的其它元件物理隔离。基谐波光可以是多重的，形成的每个光束由单个镜子导向以同时扫描阵列中不同的行和区域，这样更加增强该技术用于高通量研究的潜力。
可选实施方案中，使用下述方法将探针DNA附着到基质上Levicky et al.″Using Self-Assembly to Control the Structureof DNA Monolayers on GoldA Neutron ReflectivityStudy，″Journal of the American Chemical Society 1209787-9792(1998)，或Chrisey et al.，″Covalent Attachment ofSynthetic DNA to Self-Assembled Monolayer Films″，NucleicAcids Research 24，3031，(1996)的方未能。在Chrisey等人的方法中，如图8中所示，使用了熔融硅石或氧化硅基材(230)并以N-(2-氨乙基)-3-氨丙基三甲氧硅烷(EDA)(235)进行衍生。一个实施方案中，EDA修饰的表面以同双功能性交联剂(SMPB)处理，SMPB的琥珀酰亚氨酯部分与EDA的第一位氨基团反应(240)。碱基对序列(xzzy)(此处‘xzzy’代表整个序列)之后的巯醇-DNA寡聚体与SMPB交联剂的马来酰亚胺部分反应，生成(250)所示的共价结合物质。
可选实施方案中，如图9所示，表面阵列的元件是物理隔离的，使得不同的试剂，靶溶液等可以选择性的加入到任意一个或全部元件中。(A)部分是基质(225)的顶视图，该基质具有隔离不同的孔区域的隔离物或壁(260)——在这个实施中是16个孔。(B)部分是带有附着探针(270)的孔(265)的侧视图。这种阵列在现有技术中常见，例如96孔板等，并且是商业上可获得的(Fisher Scientific，Inc.等)。
可选实施方案中，玻璃基质表面用一层反射金属，例如银覆盖。这种金属层能够增加非线性光的产生和收集。生物分子或其它粒子可以附着在金属顶部的衍生层上。例如，金属用一层二氧化硅(SiO2)涂覆，然后用一层氨基硅烷，例如3-氨基-辛基-三甲氧基硅烷涂覆。用接头将寡核苷酸或多核苷酸附着到氨基硅烷层，该接头将寡核苷酸的3′或5′端与氨基基团连接。或者，寡核苷酸或多核苷酸吸附于氨基硅烷层。图10说明了这种类型的实施方案，其中用银涂层(280)衍生玻璃基质(275)。然后，一薄层SiO2沉积到银涂层(285)上面并用氨基硅烷(290)衍生。
一个具体实施方案中，核酸或PNA微阵列可从商业获得或依据公开文献构建(例如http//cmgm.stanford.edu/pbrown/mguide/index.Html)。所使用的表面化学参见Chriseyet al.，″Covalent Attachment of Synthetic DNA to Self-Assembled Monolayer Films″，Nucleic Acids Research 24，3031，(1996)，其中寡核苷酸附着到熔融硅石片上自组装的单层硅烷薄膜上。通过N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷实现硅烷化。
另一实施方案中，通过光指导的合成(S.A.Fodor，Science 277(1997)，393)或通过化学合成(例如Chrisey et al.，″CovalentAttachment of Synthetic DNA to Self-Assembled MonolayerFilms″，Nucleic Acids Research 24，3031，(1996))将寡核苷酸或PNAs附着到固体基质上。
在其它实施例中，寡核苷酸或PNA的表面或微阵列可以从商业途径获得或根据公开的文献(如，http//cmgm.stanford.edu/pbrown/mguide/index.html)构建。
DNA微阵列可以从商业途径获得或根据公开的文献构建，例如(如，http//cmgm.stanford.edu/pbrown/mguide/index.html)。优选应用的表面化学参见Chrisey et al.，“Covalent Attachment ofSynthetic DNA to Self-Assembled Monolayer Films”，NucleicAcids Research 24，3031，(1996)，其中寡核苷酸附着于熔融硅石片的自组装的单层硅烷薄膜。在玻璃或二氧化硅上通过N-(2-氨乙基)-3-氨丙基三甲氧基硅烷和Hoheisel，J.D.“Improved solidsupports and spacer/linker systems for the synthesis ofspatially addressable PNA-libraries”Nucleosides Nucleotides18(1999)1289-1291实现硅烷化。与PNA寡核苷酸接触的缓冲液或溶液可以从本领域已知的范围内选择。杂交和冲洗溶液可见现有技术。例如，网址cmgm.stanford.edu/pbrown/protocols给出了探针-靶杂交的详细指示。
微阵列可以在x-y平移台上安装，并通过个人电脑(PC控制)来驱动，所述个人电脑使用电动传送器(从Oriel，Inc.得到)或现有技术中多种方法中的一种(如，V.G.Cheung et al.，“Making andreading microarrays”，Nature Genetics(Suppl.)，1999，2115-19)。
在可选择的实施方案中，可以使用基于珠的纤维光学阵列(参考文献34)，其中光束(如，基谐波和第二谐波)通过全内反射沿纤维的路径传播。基谐波光偶联到光学纤维束或单根光学纤维，且第二谐波光在末端表面产生并且通过纤维反向收集。附图11A-B举例说明了一个纤维光学束阵列。(A)部分表示一束纤维光学电缆(295)，在其远端有放置珠(300)的孔。(B)部分表示单根光学纤维的特写图。基谐波光(ω)向有珠子的远端(305)传播。某些基谐波光与第二谐波光(2ω)一起从珠子反向散射回来，并且反向经过纤维达到近端，所述近端有一个光列(coptical train)和检测系统(未显示)将基谐波辐射和第二谐波辐射进行分离。珠子(310)用探针覆盖。
在可选择的实施方案中，绿色荧光蛋白(GFP)或其非线性活性突变体被用于在体内标记蛋白，所述标记通过根据本领域熟知的突变发生进行。GFP或其突变体是第二谐波活性的，并且可以作为蛋白的插入标记。例如一个细胞膜受体可以通过突变发生用GFP进行标记。在表面选择性非线性光学技术中，用基谐波光束照射包括这种GFP标记受体的细胞时，所述细胞产生某些背景第二谐波光。当配体或其它化合物结合于受体并诱导活化时-并且同时产生构象变化-由于受体的构象变化导致的GFP标记轻微位移，第二谐波的强度和/或光谱和/或时程将会改变(例如，归咎于GFP蛋白总净余方向的变化)。测量到的非线性光学性质的变化由此与构象变化和配体结合相关。
在可选择的实施方案中，附图1中非线性辐射的检测器(65)是一个光电倍增管，以单光子计数模式工作。光电流脉冲可以是电压转化的，使用Model SR445 Fast Preamplifier和Model SR400Discriminator(由Stanford Research Systems，Inc.提供)进行放大和区别，并且然后送至计数器(由Kinetic Systems提供的Model3615 Hex Scaler)。通过一个DAC输出器(由Kinetic Systems提供的Model 3112，12-Bit DAC)的光子计数门控和检流计控制可以使用数字延迟/脉冲发生器(由Stanford Research Systems，Inc.提供的Model DG535)进行同步化。通过使用并行寄存器(由DSPTechnologies，Inc.提供的Model PR-604)，一个CAMAC控制器卡(由DSP Technologies，Inc.提供的Model 6002)和一个PC适配器卡(由DSP Technologies，Inc.提供的Model PC-004)，可以实现与个人电脑29的交流。
在可选择的实施方案中，一个带通，凹口，或滤光器被置于一个或所有光束通路中(如，基谐波，第二谐波等)，允许，例如，更宽的光谱带宽或更多光通量。
在可选择的实施方案中，一个界面，凹口通路，带通，反射，或吸收滤光器可以被用于代替附图中的滤光器以使基谐波或非线性光束通过或被阻断。
根据另一个实施方案，通过使用一个电荷耦合检测器(CCD)代替光电倍增管或其它光电检测器来检测非线性光束。CCD亚系统与电脑内装配的数据采集板互通并被其控制。数据采集板可以是本领域熟知的类型，例如Computer Boards Inc.生产的CIO-DAS16/Jr。例如，数据采集板和CCD亚系统可以下述方式运行。数据采集板通过将时钟信号传送至CCD亚系统来控制CCD集成周期(integration period)。在一个实施方案中，CCD亚系统设置CCD集成周期为4096时钟周期。通过改变时钟频率，CCD集成数据的实际时间可以被控制。在一个集成周期中，每个光电二极管聚集的电荷与到达所述光电二极管的光线量成比例。集成周期结束时，电荷转移到CCD的移位寄存器，并且开始一个新的集成周期。移位寄存器以电压的形式存贮电荷，代表CCD阵列上入射的光线模式。然后电压以时钟频率传送到数据采集板，在此它们被数字化并且存储在计算机内存中。以这种方式，在每个集成周期中，一个样品带被成像。其后，一个后续的行进行集成，直至样品被完全扫描。
在一个特定实施方案中，在两个或多个光谱点或带，使用单色器，滤光器，或其它波长选择性设备，通过测量非线性辐射(如，第二谐波辐射)对一个样品的非线性光谱进行测量。
在一个特定实施方案中，一个单色器(60)可被置于所述设备中检测元件之前，以对非线性光学辐射进行光学解析(附图1)。
在一个特定实施方案中，现有技术(Peleg et al.，“Nonlinearoptical measurement of membrane potential around singlemolecules at selected cellular sites，”Proc.Natl.Acad.Sci.V.96，1999，6700～6704，或Campagnola et al.，“High-resolution nonlinear optical imaging of live cells by secondharmonic generation，”Biophysical Journal 77(6)，3341～3349(1999))中描述的成像技术可以通过使用SHG标记的组分(例如标记的配体或受体)代替现有技术中使用的膜插入性染料进行。使用SHG标记的组分，所述成像技术可被用于成像固体表面，细胞表面或其它界面。
在一个特定实施方案中，通过正位移(displacement)，抽吸，电泳方式或其它现有技术已知的方式控制组分流入或流出反应室，通道(或微观流体)可被用于将组分导入样品室。
在一个特定实施方案中，所述装置可以被装配进用户关闭的产品，使用用户控制的界面(一个LED板，例如基于个人电脑的软件)，所述界面带有插入或去除可抛弃的基材(如，生物芯片)的选项，所述可抛弃的基材带有附着的探针。
在一个特定实施方案中，一个附图1中的光电二极管，雪崩光电二极管，或其它光电检测器(65)可被用作光检测手段。
在一个特定实施方案中，可以使用一个固定位置的表面阵列，并且使用本领域熟知的方法扫描表面上的入射光，例如检流计镜或多边形镜。
可选择的实施方案包括一种扫描或成像方法，所述方法中样品中非线性辐射的物理性质作为位置(x，y，z)的函数被测量。扫描方法可以包括台平移(x-y)和光束扫描的组合，例如，其中后者控制阵列表面上基谐波光束的入射位置。
在一个特定实施方案中，一个止流混合室被用于迅速混合样品室中的组分。
在一个特定实施方案中，通过使用另一种方法，例如靶的放射性标记或荧光标记，测量靶浓度来确定比例常数(第二谐波光强度对结合于附着探针的靶的浓度的校准曲线)。一旦校准曲线已知，对于一个给定的探针和靶类型(如，cDNA，RNA，寡核苷酸大小等)，结合的靶的浓度可以使用所述关系和测量到的第二谐波强度进行确定。本实施方案可被普及到任何其它由样品发出的非线性光束，包括第三谐波，和频或差频光。
在一个特定实施方案中，非线性光学的，表面选择性装置可以包括一个不带有激发光源(如，带有样品室，滤光器，检测器，单色器，计算机界面，软件，或其它部分)的单元，以使用户可以自己提供激发光源并且将其应用于这里所述的方法。
在可选择的实施方案中，可测量信息可以被实时记录。
在本发明中使用表面选择性非线性光学技术的装置的各种构型检测探针-靶反应或其效果的装置可以采取多种构型。以其最简单的形式，所述装置将包括下列i)一个基谐波光源ii)测量第二谐波或其它非线性光束强度的检测器。
所述装置更精细的版本将使用，例如一个单色器(用来选择波长)，一个滤过器，滤光器，干涉器或其它光谱滤光器(用来选择波长或将基谐波与高谐波分开)，一个或多个偏振光学器件，应用电场的工具，一个或多个指引和聚焦光线的镜片或透镜，电脑控制器，软件，等等。
传送或产生非线性光线(如，SHG)的模式可以基于下述方法中的一种或多种TIR(全内反射)，纤维光学(有或没有附着的珠子)，透射(基谐波透过透过样品)，反射(基谐波从样品反射)，扫描成像(允许人们扫描样品)，共焦成像或扫描，用于能量累积的共振腔，多路结构。
测量的信息可以采取包括一个或多个下述参数的向量的形式{光强度(一般，通过PMT或光电二极管转化为光电压)，光的波长(使用单色器和/或滤光器确定)，时间，基材位置(用来排列样品，例如，其中不同亚样品作为基材位置的函数编码，并且将基谐波导向各个(x，y)位置}。所述装置的两个一般构型是成像扫描(基材成像-强度，波长等，作为x，y坐标的函数)和分光镜(为某些平面或细胞，脂质体或其它颗粒悬浮物测量强度，波长，等)。
基谐波光束可以通过多种途径传送到样品。附图12-16是传送基谐波和产生第二谐波光束的不同模式的示意图。可以认为，在和频和差频构型中，基谐波光束将由两种或多种光束组成，并将在界面产生差频光束或和频光束。为达到举例说明的目的，这里仅仅详细描述产生第二谐波的情况。而且应该明确，在所有情况下，为了选择界面间相互作用容积的精确位置，样品室3可以装配到平移台(1-，2-或3-维自由度)。在所有情况下，样品室可以装配有流送口和管，以用来引入(或冲洗)例如分子，颗粒，细胞，等组分。
透射附图12A是依赖于基谐波和第二谐波光束透射的构型的示意图。基谐波320(ω)透过样品室330，并且在一个体积单元(由圆圈表示)内相互作用，所述体积单元中包括一个或多个能够产生第二谐波光束325(2ω)的界面。基谐波和第二谐波光束基本上在一条直线上，如光线325所示。样品室可以包括在一些基质中悬浮的珠子，颗粒，脂质体，生物细胞等，提供能够产生响应基谐波的第二谐波的界面区域。如图所示，第二谐波被检测到与基谐波在一条直线上，但是也可以从与基谐波成角度的方向上检测到，例如与基谐波光束成90°。
附图12B是另一个依赖于基谐波和第二谐波光束透射的构型的示意图。将基谐波335传递到一个样品室345，并且第二谐波在上表面产生-所述表面可以用固定化探针或吸附的颗粒，脂质体，细胞等衍生化。在上表面和细胞中包含的基质的界面上，第二谐波340在以一个圆圈表示的一个体积单元内产生。
附图12C是基本上与附图2A中描述的构型相似的示意图，除了样品室3的底面，而不是上表面，被用来产生第二谐波。
全内反射附图13A是一个波导管4的示意图，所述波导管可以作为全内反射波导管折射基谐波365并且将其导向波导管380和样品室375之间界面的位置。在用一个圆圈表示的所述位置，基谐波将会产生第二谐波，并且进行全内反射；第二谐波将与基谐波基本上共线传播并脱离棱镜380。一般，波导管380与空气接触。在本附图中，波导管380是一个Dove棱镜。
附图13B是一个与附图13A中描述的构型相似的示意图，除了波导管400使得能够有波导管4和样品室395之间全内反射的多重点，增加基谐波光束产生的第二谐波光的量。
纤维光学附图14描述了传送或收集基谐波或第二谐波光束的纤维光学方法的多种构型。在附图14A中，描述了一个基谐波源和纤维光学器件之间的耦合元件410。基谐波，由此耦合到纤维光学波导管405中，传送到一个样品室415。在附图14A中，纤维的尖端可以作为能够产生第二谐波的目标界面，或所述尖端可以仅仅将基谐波导入到包括悬浮细胞，颗粒等的样品室。在附图14A中，第二谐波光通过纤维光学器件反向收集。
附图14B除了一个珠子附着于纤维光学器件(根据本领域熟知的手段)尖端外与附图14A完全相同。所述珠子可以加强第二谐波光的收集效率或用探针或吸附的物质衍生化，并与样品室425的基质呈现可以产生第二谐波光的界面。
附图14C除了使用一个立体角检测器450影响第二谐波光的收集外，与附图14A和14B完全相同。
光学共振腔光学共振腔被定义为在至少两个反射元件之间，并且沿着腔内光路有腔内光束。所述光学腔或共振器由两个或多个排列的反射镜面组成，以便捕捉入射光，并使其在反射镜之间来回反射。这样，腔内的光线可以在量级上比入射光强好几倍。这种现象众所周知，并且在不同方面得到应用(参见，例如Yariv A.″Introduction to OpticalElectronics″，2d Ed.，Holt，Reinhart and Winston，NY 1976，第8章)。相同的样品室可以存在于光学腔内或在光学共振腔之外。
附图15是一个光学共振能量累积腔构型的示意图。附图15A是一个光学共振腔的图表，其中样品室465置于腔内，并且基谐波和第二谐波透射过样品室465-一个对于含有悬浮颗粒，细胞，珠子等的样品室有用的构型。基谐波455进入反射光学器件460的光学共振腔，并且在反射器件460和462(腔内光束)之间累积能量。反射镜460优选是倾斜的(不与入射基谐波455的方向垂直)，以防止腔内光束反射回光源。460和462的天然反射率和透射率可以被调整，以使基谐波在腔内累积到合适的能量水平。基谐波在样品室由一个圆圈表示的体积单元内产生第二谐波光。反射光学器件460可反射基谐波和第二谐波，但反射光学器件462可以基本上反射基谐波，但是允许随后检测到的第二谐波475透过。美国专利U.S.Pat.No.5,432,610(Kinget al.)描述了用于化学传感的二极管-泵(pumped)能量累积腔，并且所述专利及其中的参考文献在此以参考文献的形式并入本发明。
附图15B是一个光学共振能量累积腔构型的示意图，其中基谐波475通过从光学器件480的反射进入光学腔。第二反射光学器件482详细说明光学共振腔。器件490是一个波导管(例如一个棱镜)，与样品室485接触，并且在波导管和样品室表面的界面上允许基谐波全内反射，产生第二谐波光。器件482基本上反射基谐波，但是使随后检测到的第二谐波495透过。
反射附图16A是涉及基谐波和第二谐波光束反射的构型的示意图。基质525涂覆有一薄层反射材料520，例如金属，并且在此之上沉积有适合附着探针或吸附颗粒，细胞等(例如，SiO2)的层515。该层与样品室510接触。基谐波500透过样品室510，并且在层515和层520之间的界面产生第二谐波。基谐波和第二谐波505从层520的表面反射回来。
附图16B基本上与附图15A相同，除了第二谐波和基谐波光束是从样品室540含有的基质和层545之间的界面反射的535。层545是沉积到基质550上的反射性或部分反射性涂层，并且适合吸附颗粒，细胞等或附着探针。
附图16C显示一个示意图，显示只有样品室565需要被用于反射几何形状。样品室565部分充满一些基质570，并且基谐波和第二谐波光束是从表面570的气-液或蒸汽-液体界面反射的560。
检测方式当期望信息作为基质位置(x，y)的函数时，电荷耦合检测器(CCD)阵列检测器特别有效。CCD包括一个象素阵列(也就是，光电二极管)，其中每个象素可以独立测量照射于其上的光线。对一个给定的装置的几何形状，起于一个特定基质位置(x，y)的非线性光线可以通过测量非线性光线的强度来确定，所述非线性光线照射于和基质有一段距离的CCD阵列位置(Q，R)-这些得以确定是由于与荧光发射自发的，随机的，多方向的性质相比，非线性光束是相干的，校准的(并且通常与基谐波共传播)。对于CCD阵列，检测器中的一个或多个阵列元素{Q，R}将映射基质表面的特定区域，允许轻松确定作为基质位置(x，y)函数的信息。光电二极管检测器和光电倍增管(PMTs)，雪崩光电二极管，光敏晶体管，真空光电二极管或用来将入射光转化为电信号(也就是，电流，电压等)的其它现有技术已知的检测器也可以用来检测光线强度。对于CCD检测器，CCD与装在设备电脑中的数据采集板互通并受其控制。数据采集板可以是现有技术熟知的类型，例如ComputerBoards Inc.生产的CIO-DAS16/Jr。例如，数据采集板和CCD子系统可以下述方式工作。数据采集板通过向CCD子系统发送时钟信号控制CCD集成周期。在一个实施方案中，CCD子系统设置CCD集成周期为4096时钟周期。通过改变时钟频率，CCD集成数据的实际时间可以被控制。在一个集成周期内，每个光电二极管聚集的电荷与到达所述光电二极管的光线量成比例。集成周期结束时，电荷转移到CCD的移位寄存器，并且开始一个新的集成周期。移位寄存器以电压的形式储存电荷，代表CCD阵列上入射的光线模式。然后电压以时钟频率传送到数据采集板，在此它们被数字化并且存储在计算机内存中。以这种方式，在每个集成周期中，一个样品带被成像。其后，一个后续行进行集成，直至样品被完全扫描。
样品基质和样品室样品基质和室可以具有一个或多个下述特征中的多种形式，但不限制于此完全封闭的，封闭的或非封闭的并与流动池和泵连接，将基质与全内反射棱镜结合以允许非线性光束的短暂产生，基质与共振腔结合用于基谐波能量累积，一个允许基谐波多通路的光学装置用来增加非线性响应，含有悬浮生物细胞，颗粒，珠子等的样品室。
数据分析数据分析处理检测器测量的信息向量。信息可以是时间依赖性的和动态的。它可以对一种或多种生物成分，抑制剂，拮抗剂，激动剂，药物，小分子等的浓度是依赖性的，所述浓度在一次测量中或两次测量之间可以有变化。信息也可以依赖于波长等。通常，通过检测与样品中诱导的构象变化相关的非线性光学性质的变化，非线性光线的强度可以转化为一个特定状态(例如，一个成分的表面关联浓度或细胞膜上打开或关闭的离子通道的量)的浓度或量。
数据分析的详细内容可以根据实验不同而不同。现有大量文献在构象和荧光强度之间建立联系，(参见Glauner et al.，Nature402，813(1999)，Ghanouni et al.，Proc.Natl..Acad.Sci.，v.98，5997(2001)，和Ghanouni et al.，Journal of BiologicalChemistry，v.276，24433(2001)，及其中的参考文献)。建立了非线性光学技术的类似方法。例如，第二谐波光强度的平方根(与光线的电场振幅成比例)与一个样品中非线性活性物质的量乘物质超极化率的方向均值成比例。这是一种众所周知的关系，可以用于通过非线性光束强度对构象变化(并且依次地，对探针的结合亲和力)进行定量。感兴趣的反应的动力学和平衡性质可以通过测量和合适的数据分析确定。
筛选候选结合配偶体结合试验分子的候选结合配偶体可以通过检测探针-靶结合的构象变化进行筛选。筛选结合于试验分子的一种或多种候选结合配偶体的方法涉及测量一种或非线性光束的一种或多种物理性质，所述光束从所述样品发出所述样品含有试验分子和一种或多种候选结合配偶体，其中相对于不存在暴露于一种或多种候选结合配偶体的情况下测量到的值，非线性光束一种或多种物理性质的改变表明发生了结合。在一个优选的实施方案中，候选结合配偶体不附着于表面。
本发明可以使用的探针或靶包括但不限于天然存在的，人工改变的，或遗传工程的，生物物质或非生物物质。候选的探针或靶也包括但不限于一种或多种下述组分核酸，蛋白，小分子，有机分子，生物细胞，病毒，分子标志，脂质体，受体，抗体，激动剂，拮抗剂，抑制剂，半抗原，配体，抗原，卵母细胞，激素，蛋白，肽，受体，药物，脂类，神经节苷脂，酶，核苷酸，碳水化合物，cDNA，寡核苷酸，核苷，多聚核苷，多核苷酸，脂类，神经节苷脂，寡糖，肽核酸(PNA)，毒素，核酸类似物，离子通道受体，G偶联蛋白受体。在一个特定实施方案中，探针可以在基质或固体表面上以阵列的形式排列，同时探针的性质或化学性质保持恒定或在阵列的区域内变化。
选择候选结合配偶体的一个实施方案中，可以将一个外电场应用于样品以引起非线性光学技术所需的非中心对称条件。例如，用非线性活性标记进行标记的蛋白(如，溶解的GPCRs)在电场中可以被部分定向。测量背景非线性光线信号。当结合于蛋白的配体添加到基质中时，它触发蛋白的构象变化(对该领域技术人员熟知)，导致非线性光线信号性质的改变(如，强度的变化)。所述方案在筛选结合于蛋白的配体库(小分子，药物等)方面非常有用-也就是，高通量药物筛选。在一个优选的实施方案中，所述蛋白是GPCRs，一种熟知的涉及疾病的蛋白家族，并针对其设计药物。药物可以是以某些方式与受体相互作用(如，结合)的激动剂，拮抗剂，抑制剂等。下述参考文献(及其中的参考文献)描述了可以使用的GPCRs的不同实例。
P.Ghanouni et al.，“Agonist-induced conformational changes in the G-protein-coupling domain of the β2adrenergic receptor”，Proc.Natl..Acad.Sci.，v.98，5997(2001).
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Helmreich，E.J.M.and Hofmann，KP，“Structure and Function of Proteins in G-protein-coupled signal transfer”，Biochimica et Biophysica Acta 1286，285(1996).
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Lodish，Harvey，et al.，Molecular Cell Biology(4thed.，2000).
筛选调节剂本发明提供一种根据调节测试分子及其结合配偶体之间相互作用的能力筛选一种或多种候选调节分子的方法。以前描述了调节剂和抑制剂分子的作用。相对于测试分子不暴露于结合配偶体时测量到的结果，从含有测试分子及其结合配偶体和调节剂的样品发出的非线性光束的一种或多种物理性质的任何变化，是候选调节分子调节测试分子及其结合配偶体之间相互作用(也就是，增加或减少结合)能力的指示。
例如，本发明可被用于监控基因表达或涉及药物筛选或高通量筛选的研究，其中测试候选药物的结合，或其对探针-靶结合的影响，也就是，减少或增强探针-靶结合。在其它情况下，例如，可以通过一种药物结合于生物细胞表面上受体或其它分子的能力测试其功效。在另一个特定实施方案中，通过测试阻断激动剂结合于受体，筛选作为受体激动剂的潜在抑制剂的化合物，也就是，当受体和激动剂与候选抑制剂同时存在时，去除由激动剂诱导的构象变化。
在一个特定实施方案中，本发明被用于药物筛选或高通量筛选，其中测试一种候选药物活化或抑制探针(如，受体，离子通道蛋白等)的能力。测试一种候选药物激活探针中构象变化的能力-在这种情况下，人们寻找探针的激动剂。
在可选择的实施方案中，靶-探针相互作用可以在一些相互作用的调节剂存在下测量-所述调节剂是，例如在某些方面改变靶-探针相互作用(如，对探针有某些亲和力并阻断或抑制靶的结合)的小分子，药物，或其它部分，分子或粒子。使用非线性光学方法研究调节剂对探针-靶结合的影响，其中已知靶结合于探针。调节剂可以在探针-靶相互作用发生之前，之中或之后加入。
在一个特定实施方案中，一个生物探针-靶结合反应可以在激动剂，拮抗剂，药物，或小分子存在下被测量，所述激动剂，拮抗剂，药物，或小分子可以阻断，启动或调节所述探针-靶结合反应的结合强度(如，平衡常数)。本实施方案可以用于许多情况，例如当想得知一种药物阻断或调节一个用于医学或基础研究的特定探针-靶反应的功效时。
检测构象变化可以通过本发明在界面或主体中研究构象变化，其中构象变化导致从样品发出的一种或多种非线性光束的一种或多种物理性质的变化。构象变化可以由生物或化学结合启动，或通过生物组分，药物，小分子，激动剂或拮抗剂结合于与分子或粒子启动，并且可以如这里对结合相互作用所述的进行测定。
在一个特定实施方案中，作为某些探针-靶相互作用的结果，在具有非线性易感性的界面区域上发生方向或偶极矩的变化。一个非线性活性标记可以被附着于目标探针上，并且探针与某些靶(例如测试其活化探针能力的候选药物，并由此诱导构象变化)在溶液中结合，导致方向或偶极矩的变化，并且这改变界面区域的非线性易感性，以及非线性光束的性质(如，强度，偏振，波长)。
在另一个实施方案中，通过应用外电场(EFISH技术)建立一个非中心对称区域。所述区域可以是界面，主体，或其某些组合。探针或靶(探针，靶或两者都是非线活性的，其本身是非线性活性的或者使用非线性活性标记进行标记的)通过电场极化，并由此产生一个背景。当探针和靶之间发生结合反应时，可以激活一种或两种物质的构象变化，或导致物质偶极矩的变化，导致测量到的非线性光学信号的变化。
为了与核酸杂交(寡核苷酸，多核苷酸，RNA等)共同使用，靶寡核苷酸可以暴露于一个阵列的表面，所述表面上放置有探针寡核苷酸。在发生序列互补杂交和伴随构象变化的阵列中(相应于已知位置)的探针寡核苷酸序列，基谐波光可以引起非线性光学信号的变化，或所述信号背景的变化。这些可以被检测到，并且与阵列元素和寡核苷酸序列的空间位置有关。例如，核酸微阵列的两个主要应用是1)鉴定序列(基因或基因突变)-例如监控DNA变异；和2)确定基因表达水平(丰度)。有许多形式可以用来制备阵列。例如，在一种情况下，使用机器人点样并且暴露于一组单独的或混合的靶(R.Ekins，F.W.Chu，Trends in Biotechnology，1999，17，217)，探针cDNA(500-5000碱基对长度)可以在例如玻璃等固体表面上被固定化。另一种形式涉及合成寡核苷酸(20-25聚体寡核苷酸)或原位肽核酸探针(在固体基质上，Fodor et al.，″Light-directed，SpatiallyAddressable Parallel Chemical Synthesis，″Science 251(4995)767-773 1999年2月15日)或通过传统合成后进行芯片上固定化。所述阵列然后暴露于靶DNA，杂交，并且确定互补序列的性质或丰度。
可以制备蛋白阵列(参见例如，G.MacBeath和S.L.Schreiber，″Printing Proteins as Microarrays for High-ThroughputFunction Determination″，Science 2000，289，1760-1763)以确定一个给定靶蛋白是否在表面上结合于固定化探针蛋白。这些阵列可以用于研究小分子与靶蛋白的结合。
现有技术还记载了许多关于微阵列技术和应用的综述。例如，那些Ramsay，″DNA chips-states-of-the-art，″NatureBiotechnology 1998，16(1)，40-44(其相关部分在此作为参考文献引入)；Marshall et al.，″DNA chips-an array ofpossibilities，″Nature Biotechnology 1998，16(1)，27-31(其相关部分在此作为参考文献引入)；S.A.Fodor，Science 277(1997)，393(其相关部分在此作为参考文献引入)；D.H.Duggan et al.，Nature Genet.21(Suppl.)(1999)，10(其相关部分在此作为参考文献引入)；M.Schena et al.，Science 270(1995)，467(其相关部分在此作为参考文献引入)；L.McAllister et al.，Am.J.Hum.Genet.61(Suppl.)(1997)，1387(其相关部分在此作为参考文献引入)；和A.P.Blanchard et al.，Biosens.AndBioelectron.11(1996)687(其相关部分在此作为参考文献引入)。
构象变化也允许利用表面选择性非线性光学技术，通过测量结合诱导的构象影响，研究探针和靶之间结合的程度或范围。在一个特定实施方案中，用非线性活性标记进行标记的探针附着于固体表面或基质上。当探针与靶结合时，探针的构象发生变化，并且就表面而言标记的方向和基谐波光束也发生变化。在一个优选实施方案中，候选结合配偶体(探针)不附着于表面。在另一个实施方案中，非线性活性标记或部分在体外附着于靶或探针分子。探针-靶结合的程度可以通过测量的非线性光学辐射的性质(如，强度)的变化量相互联系。例如，标记的寡核苷酸根据本领域熟知的方式附着于固体基质，并且暴露于靶以测试杂交。当对靶的杂交发生时，寡核苷酸上标记的方向发生变化。可以使用现有技术已知的微阵列(在不同表面位置的不同寡核苷酸序列)或有相同寡核苷酸序列的基质。本发明另一个示范性实施方案是，表面附着蛋白和靶-其它蛋白，配体等之间的结合，其中结合反应触发构象变化。通常，可以使用本发明研究任何表面附着物质，所述表面附着物质与其它任何物质或刺激物结合或相互作用时经历构象变化。进一步，当使用对电荷密度或其变化的微小变化敏感的指示剂时，表面附着探针不需要标记。如果探针的构象变化导致表面上电荷排列的变化-甚至所述变化是暂时的-靠近界面的指示剂可以用来检测那些变化并报告构象变化。
如上所述，在一个特定实施方案中，一个MB类似物探针被用于检测结合的程度或范围。例如，通过用非线性活性标记对分子标志探针进行标记，并且测量在某些界面上，或在主体内标记方向是否改变(通过非线性光强度的变化)，人们可以研究靶链是否互补以及它们互补的程度，这是由于非线性光强度中测量到的变化量可以与杂交程度相关。在一个特定实施方案中，一个Au毫微粒被用于增强非线性光辐射的强度，例如当所述毫微粒和唑染料相互接近时，由唑染料散射产生的第二谐波呈若干数量级。当探针与一个互补靶杂交时，非线性光辐射的强度减少，并且这种减少与探针-靶杂交量有定量关系。在其它参数中，本技术的灵敏度通过杂交发生前非线性光信号背景进行确定。
使用本发明的其它方案虽然本发明可被应用于许多科学分析领域并且具体而言在化学和生物学领域，本发明在药物开发或基础研究中特别有用，其中测试化合物(靶)的结合和活化探针的能力，其中探针是离子通道蛋白，GPCR蛋白，或其它受体，或其它分子。
装置具有广泛的适应性。在固定位置的扫描，成像，检测技术等都可以方便地与本发明一同使用。本领域中扫描微阵列包括基于共焦的方案和基于非共焦的方案。U.S.Pat.No.5,834,758(Trulson等-其相关部分在此作为参考文献引入)描述了一种使用荧光检测的基于非共焦的微阵列成像方案。然而，样品的放置应该非常平坦，以使仅仅在一个单一焦平面成像，以得到良好的面外分辨率。因此，为达到这种目的，优选应用一种需要特定组分的精确调节的平移台，导致设备的成本增加，其寿命也可能增加。所述类型装置的成像质量可以对机械振动敏感。而且，面外(非表面结合的)荧光团的分辨率对本技术的灵敏度产生限制。U.S.Pat.No.6,134,002(Stimson等-其相关部分在此作为参考文献引入)是使样品平面，也就是一个微阵列，成像的共焦扫描显微镜装置的一个例子。虽然基于共焦的技术有良好的深度分辨率，但由于反扫描(descanning)的要求而扫描速度低，并且光通量低，减少总信噪比和本技术的灵敏度。
本发明可用于研究其它生物组分之间的结合过程细胞和病毒；蛋白-蛋白相互作用；蛋白-配体；细胞-配体；蛋白-药物；核酸-药物，细胞-小分子；细胞-核酸；肽-细胞；寡核苷酸或多核苷酸，病毒-细胞，蛋白-小分子等，以及通常任何导致构象变化的结合反应。仿生膜例如磷脂支持双层(如，卵磷脂酰胆碱)也可以被应用，并且对涉及膜蛋白探针的研究特别有用。
通过直接标记或使用对探针或靶有结合亲和力且本身固有或被提供非线性活性的修饰分子或其他候选物，可以使探针，靶，受体等成为非线性活性(使其超级化)，并且由于将修饰物与探针或靶结合的分子键，该修饰分子或候选物可以通过移位响应探针或靶的构象变化。一个受体的抗体是所述修饰分子的例子。所述修饰分子可以本身阻断受体的活性区域，以使潜在激动剂，抑制剂，活化剂，等可以结合到受体上并产生作用。
本发明应用的另一个例子是标记受体或对某些病毒有亲和力的其它组分。当病毒与受体或其它组分结合或相互作用时，所述相互作用可以影响就基谐波光束方向而言标记的方向，并由此改变测量到的非线性光线的性质(如，非线性光线的强度)。
本技术与阵列应用的其它例子包括细胞阵列，有或没有膜或附着蛋白等的支持脂类双层阵列。本领域存在许多将生物分子(如，核酸，蛋白和细胞)与阵列形式的固体支持物偶连的方法。广泛的灵活度可以用于提供建立阵列的方法。它们可以涉及，例如，直接与基质，化学衍生的基质，某些类型的中间层(如自组装的单层，水凝胶或其它本领于已知的生物相容性层)共价或非共价偶联。探针(如，蛋白结构或寡核苷酸序列)的性质可以在固体表面上根据位置不同而不同，或同种探针可以均匀地覆盖表面。靶可以具有一种单独特征或是不同特征靶的组合。阵列可以通过各种途径制备，包括但不限于喷墨印刷，光刻法，微接触印刷(micro-contact printing)，或任何其它制造它们的领域的技术人员已知的方式。
由于非线性光学技术的表面选择性，结合过程可以被实时并且在主体生物成分存在时被测量，可以测量平衡结合曲线和动力学，组分的主体浓度可以变化，并且由于使用基于荧光的检测，除去未结合组分的“冲洗”步骤可以是不必要的。
设计装置时可以有广泛的灵活度，所述装置包括但不限于，基谐波光源，必需进行控制的光列，聚焦或传送基谐波和非线性光束，阵列的设计，检测系统，使用光栅或滤光器和收集光学器件。产生(辐射)或收集的模式可以变化，包括，例如使用损耗波(全内反射)，平面波导管，反射，或透射几何学，纤维光学器件，近场照射，共焦技术或使用累积能量的微腔，或集成检测系统如累计球。许多在固体表面上扫描微阵列的方法可以被改变以适合应用。例子包括Trulson等的U.S.Pat.No.′s 5,834,758(1998)，Trulson等的6,025,601(2000)，Stern等的5,631,734(1997)，和Sampas(2000)的6,084,991-其相关部分作为参考文献在此引入。
因为第二谐波光束对表面平面产生一个特定的角度，人们可以读出非线性光学辐射的性质，例如，在两维阵列形式中，作为基谐波入射位置的函数，不需要机械地平移检测器或样品，并且不需要大量收集光学器件。在“光束扫描”的实施方案中，不需要机械平移样品表面或检测器-仅仅是样品上基谐波入射方向和/或角度的变化(对于固定的样品和检测器)-所述装置提供更加快速的扫描能力，增加了制造的方便性并延长寿命。
当使用本发明研究界面时，界面可以包括硅石，玻璃，硅，氮化硅，聚苯乙烯，尼龙，塑料，金属，半导体或绝缘表面，或任何其混合，或任何探针例如生物组分可以吸附或附着的表面。界面也可以包括生物细胞和脂质体表面。附着和固定化可以通过本领域熟知的各种技术进行。例如，寡核苷酸可以通过″Microarray BiochipTechnology″，M.Schena(Ed.)，Eaton Publishing，1998描述的技术制备-其相关部分在此作为参考文献引入。并且，例如对于蛋白，表面可以用乙醛硅衍生化以与生物分子的表面上的胺偶联(G.MacBeath和S.L.Schreiber，″Printing Proteinsas Microarraysfor High-Throughput Function Determination″，Science2000，289，1760-1763-其相关部分在此作为参考文献引入)。也可以使用BSA-NHS(BSA-N-羟基琥珀酰亚胺)表面，首先将BSA分子层附着到表面，然后用N，N′-双琥珀酰亚胺碳酸酯将其活化。BSA上活化的赖氨酸，天冬氨酸，谷氨酸残基与蛋白上的表面胺反应。
本发明可以应用于全部分子或单一分子-也就是，全部反应测量或单一分子反应测量。
有或没有膜蛋白或其它膜结合成分存在时，也可以使用支持磷脂双层，例如，Salafsky et al.，Architecture and function ofmembrane proteins in planar supported bilayersA study withphotosynthetic reaction centers″Biochemistry 35(47)14773-14781(1996)-其相关部分在此作为参考文献引入，″Biomembranes″，Gennis，SpringerVerlag，Kalb et al.，1992和Brian et al.，″Allogeneic Stimulation of Cyto-toxic T-cellsby Supported Planar Membranes，″PNAS-Biological Sciences 81(19)6159-6163(1984)-其相关部分在此作为参考文献引入。支持磷脂双层在本领域熟知，并且现有许多制造它们的技术，所述支持磷脂双层有或没有膜蛋白存在。这些支持双层通常应该浸入水溶液以阻止它们暴露于空气中时被破坏。
探针可以是生物细胞，脂质体，珠子等的一部分，它们天然形成一个界面，所述界面由于它们的尺寸可以产生非线性光学辐射(虽然它们名义上是中心对称的，但它们的直径具有可见光谱中波长的量级，并且根据该领域熟知的技术允许产生非线性光线)。可选择地，探针可以是分子或颗粒(如，溶解于去污剂的受体)，通过应用电场诱导其定向。现有技术中已经熟知，使用电场以产生一个能够产生非线性辐射的-如第二谐波，和频或差频产生的非中心对称区域。所述现有技术的一个方面通常被称作′EFISH′-电场诱导的第二谐波产生。在一个特定实施方案中，一个适用的电场用于在一个区域内极化分子以在一个相或一种物质中建立一种有序的(非中心对称)区域；得到的区域然后可以产生非线性光学辐射。
在一个特定实施方案中，探针-靶杂交可以通过在有表面附着探针的基质上的某些位置检测非线性光线(如第二谐波光)的强度测量；当标记的靶与表面上探针结合时，第二谐波光的强度发生变化，并且由于结合变为部分定向，因此满足在界面产生第二谐波光的非中心对称条件。可以通过许多方法完成用界面上探针-靶结合复合物浓度模拟光强度，例如通过使用放射性标记或荧光标记校准给定探针-靶相互作用的技术。可以根据本领域技术人员所熟知的方法控制靶对表面的非特异性结合，例如i)特意添加非互补靶并测量表面选择性非线性光学信号，或ii)添加已知阻止探针-靶结合的阻断剂，添加互补靶并测量得到的表面选择性非线性光学信号。在情况i)中，添加非互补靶时，表面选择性非线性光学信号的变化显著低于添加互补靶时的变化。在情况ii)中，存在阻断剂时的信号变化显著低于没有阻断剂时的信号变化。
6.实施例实施例6.1一个分子标志类似物(MB类似物)寡核苷酸，偶联到一种非线性活性染料，并被纯化，从例如Midland Certified Reagent Company(Midland，TX)的商业途径购买。使用的非线性活性唑染料是通过3’端的胺基附着的唑(SE)1-(3-(琥珀酰亚胺基氧基羰基)苄基)-4-(5-(4-甲氧基苯基)唑-2-基)溴化吡啶(PyMPO，SEMolecular Probes Corp.)。
将寡核苷酸置于EFISH室的样品孔中。现有技术中存在多种EFISH室。使用文献C.G.Bethea(′Experimental technique of dc inducedSHG in liquidsmeasurements of the nonlinearity of CH2I2″，Applied Optics 1975，14，1447)中描述的样品室。适用电场的方向与激光束的电场平行。一种商业豪微微秒锁模系统(Mira 900 andVerdi 5W)被用作基谐波源。基谐波被导入电极之间的室区域。使用滤光器阻断反向反射的第二谐波进入振荡器；使用滤光器阻断样品外的基谐波光。使用平面-凸透镜(Melles Griot Inc.)收集第二谐波光并聚焦于单色器(CM110 CVI Laser)。使用带有Bertan电源的Hamamatsu光电倍增管检测光线。光电倍增管的信号被送到StanfordResearch Systems SR400光子计数单元，并且使用个人电脑处理。使用Bertan电源施加电场，并且使用家用电子设备脉冲电并使其与激光脉冲同步化。
当有电场时，染料标记的MB类似物探针通过应用电场极化。通过对比不存在和存在靶时极化的MB类似物的平均第二谐波强度，可以测量靶对MB类似物的结合亲和力(或如果亲和力未知，则为序列)。不存在靶时的SHG信号代表测量背景，作为“基线”与靶存在时的信号比较。
添加完全互补靶时，MB类似物探针被活化并导致构象变化，及由此产生的非线性活性染料的平均方向的变化。由于测量到的SHG光线强度与非线性活性染料的平均方向成比例，染料方向的改变导致第二谐波光束强度的变化。对MB类似物探针序列不完全互补的靶将以较低的亲和力与MB类似物探针结合，并由此活化较少部分MB类似物探针分子和引起较少量构象变化。结合亲和力和第二谐波光束强度之间的关系可以方便地根据本领域已知方法显示出来，所述方法涉及相对于非线性活性物质浓度的非线性强度的变化。
实施例6.2β2肾上腺素能受体，一种GPCR蛋白，根据熟知的方法(如，Ghanouni et al.，98(11)5997PNAS)被纯化并用去污剂溶解。所述蛋白在内源半胱氨酸(Cys-265)上用1-(2，3-环氧丙基)-4-(5-(4-甲氧苯基)唑-2-基)三氟甲磺酸吡啶(PyMPO环氧化物，Molecular Probes)，即一种非线性活性染料根据标准方法以1∶1化学计量标记，并使用Ghanouni et al.，98(11)5997PNAS的工作作为指导。所述非线性活性染料附着于蛋白的部分，所述蛋白活化时进行构象变化。分离非共价结合染料后，将受体置于位于两个电极之间的基质中，并将一束基谐波(如，TiSapphire系统的约1W平均能量，约150fs脉冲的输出，例如Coherent Inc.的Verdi-Mira commercial system)通过所述基质。所述装置和样品制备(如，应用电场，电场诱导的第二谐波产生-EFISH)对所属领域技术人员来说是熟知的-使用标准光学器件将基谐波聚焦到样品上并且收集第二谐波辐射。附图18描述设备装配，附图17描述应用电场的样品固定器。根据附图17应用电场横跨基质，部分对准受体及其结合染料，并建立观察SHG必须的非中心对称条件。在400nm测量背景信号强度，使用滤光器(BG-39，CVI Laser)阻断基谐波，使用单色器选择波长(CM110，CVI Laser)，一个PMT(Hamamatsu)和单光子计数电子设备(SR-400，Stanford Research Systems)。选择400nm波长以通过染料的电子跃迁产生共振增强效果。将配体添加到基质中-例如一种测试结合的候选药物；如果配体(药物)结合到受体上，则诱导探针(受体)的构象变化，并由此改变非线性光学信号的强度。已知配体(异丙基肾上腺素)和部分激动剂(肾上腺素，沙丁胺醇和多巴酚丁胺)被用于校准由构象变化量，也就是结合亲和力，带来的非线性光学响应。
在可选择的实施方案中，标记反应可以使用各种偶联化学和/或化学计量学(标记探针)进行，以确定哪种偶联化学在非线性光学测量中提供最优信号。例如，不能先验地知道哪些探针的亚部分由于靶活化实际上经历构象变化(位移)，并且通过进行各种标记反应(已知在本领域中寻找荧光标记的最优标记条件是必需的等)，当探针被活化时，可以确定哪种化学产生一种经历构象变化的标记。
在可选择的实施方案中，离子通道或受体例如GPCR受体在生物细胞中直接用非线性活性标记和/或增强剂进行标记。例如，Glauner等的出版物(Nature，v.402 813(1999))示范了全细胞中Shaker钾离子通道的荧光标记。测量背景信号。当激动剂与受体结合时，它诱导受体构象变化，改变标记的方向和非线性光学信号(如，信号强度)。通过全细胞中的标记和/或增强剂，一个表面选择性非线性光学装置被这样用于测量受体中配体-门控构象变化。例如，基谐波光被聚焦于一个在Becton-Dickinson Falcon plates上培养的细胞层-并且根据所属领域熟知的方法收集第二谐波或高次谐波。在可选择的实施方案中，标记的细胞悬浮于基质中，并且将基谐波光聚焦于含有上述细胞的样品区域。附图18描述了所述装置的实施方案。根据所属领域熟知的方法收集第二谐波，例如相对于基谐波光束在0或90度。
在可选择的实施方案中，增强剂悬浮或溶解于含有标记的细胞或分子的基质中，以增强所述细胞或分子的非线性响应。
在可选择的的实施方案中，探针被置于人工膜或脂质体中。如果探针在细胞中表达，然后可以根据所属领域熟知的方法被纯化并重组进所述膜。
在可选择的实施方案中，探针在一个本身与棱镜接触的表面(或是棱镜的底面)上接触，培养或排列。所述棱镜允许基谐波在含有探针的界面上的全内反射，和导致更高非线性光学信号的高菲涅耳因子(电场振幅)。在所述结构模式中，基谐波光束在含有探针的界面上经历全内反射，并且其损耗波被用于产生非线性光线。附图2举例说明了所述类型的一个实施方案。在附图2中，一种指标匹配材料或液体(75)被用于将棱镜(70)偶联到一种含有微阵列(80)的基质，所述微阵列与含有靶(85)的溶液接触，在材料(80)和溶液(85)的界面发生全内反射。棱镜材料可以是，例如，BK7型玻璃(MellesGriot)，和所述可以从Corning Corp.或Nye Corp.购买到的指标匹配材料。
在可选择的实施方案中，试验建立如Salafsky和Eisenthal，″Protein adsorption at interfaces detected by second harmonicgeneration，″J Phys.Chem.B，104(32)7752-7755(2000)，Salafsky和Eisenthal，″Second harmonic spectroscopydetection and orientation of molecules at a biomembraneinterface，″Chem.Phys.Lett.319(5-6)435-439(2000)中及其中引用的参考文献所述。一个豪微微秒脉冲激光器(Mail-Tai，Spectra-Physics)被用做80MHz时用＜200fs脉冲在1W平均能量操作时800nm处的基谐波光源。激光束指向Dove棱镜(Melles Griot，BK-7)入口并用凹透镜(Oriel)(光点直径约50微米直径)聚焦。所述Dove棱镜装配到特氟隆固定器并与缓冲液或蒸馏水接触。所述光束在棱镜内经历全内反射(产生损耗波)，并且基谐波和第二谐波光束从出口处以大致一条直线出现。使用一个滤光器阻断基谐波光，同时使第二谐波通过单色器(2nm带宽狭缝)。所述单色器从380-500nm扫描，以检测第二谐波谱。如果需要，还可以改变基谐波光波长。一个单光子计数器检测器和光电倍增管被用于检测单色器的输出，并且装有软件的个人电脑被用于记录数据并控制单色器波长。在添加配体或其它刺激物以产生或测试探针中构象变化前，测量背景第二谐波信号。
实施例6.3选择有合适作为分子标志的结构的寡脱氧核苷酸，并根据所属领域技术人员已知的方法用伯胺在3’端和二硫基团在5’端和代替dT的生物素基团合成。可以使用下述MB类似物，例如5′-CCT AGC TCT AAATCG CTA TGG TCG CGC(Biotin dT)AG G-3′(SEQ ID NO6)。所述胺基反应性的非线性活性唑染料唑(SE)1-(3-(琥珀酰亚胺基氧基羰基)苄基)-4-(5-(4-甲氧基苯基)唑-2-基)溴化吡啶(PyMPO，SEMolecular Probes Corp.)与伯胺结合。在所述偶联反应中，一种100μl含有溶解于0.1M碳酸氢钠的100μM寡核苷酸的溶液与0.1mg溶解于100μl二甲基亚砜的染料的琥珀酰亚胺酯反应。反应混合物在室温下搅拌2小时。反应产物用Sephadex柱(NAP-5；Amersham Pharmacia Biotech)纯化，Sephadex柱用10ml 0.1M乙酸三乙铵(pH6.5)平衡。纯化后，所述5’端二硫化物被裂解，并且游离巯基共价附着于直径1.4nm的金簇，用于增强唑染料(Nanogold；Nanoprobes)的非线性响应，并且得到一个N-丙基马来酰亚胺并被水溶性膦配体钝化。根据所属领域技术人员熟知的方法进行Au粒子的偶联。例如，用二硫苏糖醇(DTT)裂解二硫键，且与金偶联前寡核苷酸被纯化以除去多余的DTT。将10μl的1M DTT添加于与75μl碳酸氢钠，pH8.3混合的25μl寡核苷酸。温育1小时后，所述寡核苷酸溶液使用反相色谱如上所述进行纯化。含有活化寡核苷酸的级分使用Sephadex柱(NAP-5)进行纯化，Sephadex柱用水平衡。部分洗脱产品(37pmol～370pmol DNA，悬浮于180μl水)立即与6nmol单马来酰-金粒子(Nanoprobes)反应，在含有10％异丙醇的含水20mM NaH2PO4，150mM NaCl，1mM乙二胺四乙基乙酸盐(EDTA)缓冲液，pH6.5中在4℃反应24小时。反应产物通过凝胶电泳法分析，在非变性丙烯酰胺凝胶上在Tris-硼酸EDTA(TBE)中在10V/cm进行电泳。
根据熟知方法，附着有非线性活性染料和金毫微粒子的生物素化的MB类似物偶联到链霉抗生物素蛋白衍生化的玻璃。例如，所述生物素化的MB类似物在玻璃纤维的蚀刻部分上固定化。一批光学纤维被用于单一固定化循环。通过在纤维探针的一端进行化学蚀刻，大约2cm的覆盖层被从中心剥裂。所述纤维探针垂直浸泡于49％氢氟酸溶液中12分钟。HF溶液用庚烷溶剂覆盖。用于下一步固定化实验之前，蚀刻的纤维探针用超纯水洗涤。
生物素化的MB类似物在纤维的蚀刻部分上固定化以进DNA感应。蚀刻纤维探针首先通过浸泡于1∶1v/v浓HCl/MeOH混合物中30分钟，用水冲洗，浸泡于浓硫酸中30分钟进行清洗。进一步冲洗并且接下来在水中煮沸8-10分钟。纤维的硅烷化通过在室温下，在1mM乙酸中，将其浸泡于新鲜制备的1％(v/v)DETA溶液(从United ChemicalTechnologies，Bristol PA购买的三甲氧基甲硅烷基丙基二乙烯三胺)中20分钟完成。DETA修饰的纤维探针用水充分冲洗以除去过量DETA。硅烷化的纤维探针在氮气下干燥，并且在120℃烘箱中加热固定5分钟。然后所述硅烷化的纤维在0.1M碳酸氢盐缓冲液(pH8.5)中在室温下浸泡于0.5mg/ml NHS-LC-生物素(磺基琥珀酰亚胺基(sulfo succinimidyl)-6-(生物素酰胺基)己酸酯，购自Pierce，Rockford IL)3小时。通过在4℃在含有1.0mg/ml链霉抗生物素蛋白的溶液中将生物素化的纤维温育过夜，链霉抗生物素蛋白(Sigma，St.Louis MO)结合于纤维表面。链霉抗生物素蛋白固定化的光学纤维然后浸泡于生物素化的MB类似物溶液(pH7.0时10mM磷酸缓冲液中10-6M)中长达20分钟或在4℃过夜，以允许生物素化的MB类似物在表面上固定化。
使用基谐波沿着纤维扩散产生的第二谐波，并且测量当第二谐波与MB类似物在纤维远端短暂相互作用后反向反射的第二谐波光束的强度，对光学纤维进行光学询问。不存在互补靶时，由于唑染料和Au粒子在MB类似物的发夹环结构上接近，寡核苷酸产生大量第二谐波光；这种情况下第二谐波光的强度可以作为背景。存在互补靶时，杂交反应引起所述染料和Au粒子在空间上分离，极大地减少了检测到的第二谐波光的强度。可以在发生的杂交量和第二谐波光强度之间建立一种线性关系，并由此所述有检测系统的衍生化的光学纤维作为检测选定探针的互补靶的光学设备。
实施例6.4用荧光染料光学编码的玻璃微球体用MB类似物衍生化，并且一个有不同寡核苷酸探针的微球体阵列在光学纤维的远端制备，如见于所属领域的那样(如，U.S.Pat.No.5,250,264，Walt et al.；U.S.Pat.No.5,298,741 Walt et al.；U.S.Pat.No.5,252,494Walt et al；U.S.Pat.No.6,023,540 Walt et al.；U.S.Pat.No.5,814,524 Walt et al.；U.S.Pat.No.5,244,813 Walt etal.；U.S.Pat.No.5,512,490 Walt et al.并且在商业上(例如Illumina Corporation))。所述阵列可以用于检测多重靶序列。可选择性地，光学编码可以通过使用有与标志相关的非线笥活性染料不同光谱特性的非线性活性染料完成，以使可以使用一种例如第二谐波产生的非线性光学技术进行编码和杂交检测。
如果非线性MB类似物被用于均一溶液，在EFISH方法中，可以将一个适用电场应用于MB类似物，以建立所需的非中心对称条件。
在可选择的实施方案中，人们致力于寻找阻断或减少MB类似物与靶进行结合的药物，拮抗剂，激动剂，或其它物质-这些化合物可以被称为“抑制剂”或“阻断剂”。在这种应用中，标记的靶在界面上与探针结合。抑制剂被添加于样品中，并且如果测试的特定物质成功阻断或减少了探针-靶结合，测量到的非线性光线将会改变-本实施方案中的背景辐射由于靶-探针结合而产生；抑制剂在界面上代替探针上的靶导致测量到的非线性光线产生变化，例如界面产生的非线性辐射强度减少，或非线性辐射光谱中波长位移。
在一个任选实施方案中，可以根据本领域技术人员熟知的标准方法完成对确定非特异性非线性光学信号(如，不由特异性探针-靶结合产生)的程度的控制。例如，在核酸微阵列中，当添加对探针互补或非互补的靶时，含有探针的区域之间的非线性光学信号的强度可以产生一个背景信号，所述背景信号可以在某些程度上增加(但与由于特异性探针-靶结合反应产生的信号相比小很多)。例如，可以通过仅仅添加非互补探针并且在含有探针和不含探针的区域测量非线性光学信号，来计算所述背景信号。存在阻断剂时测量非线性光学信号是本领域技术人员熟知另一种控制技术，已知所述阻断剂阻止探针-靶的结合，所述控制技术用于确定存在于更大的目标信号中的背景或人为信号量，在这种情况下是特异性探针-靶结合反应。
在本发明的另一个实施方案中，胺反应性的唑染料(SE)1-(3-(琥珀酰亚胺基氧基羰基)苄基)-4-(5-(4-甲氧基苯基)唑-2-基)溴化吡啶(PyMPO，SEMolecular Probes Corp.)与1，2-乙二胺按1∶1摩尔比反应，反应条件在Molecular Probes direction中详细说明，并允许反应完全。基于唑的染料现在包含一个单独的胺基基团。使用同双功能交联剂(Pierce，Rockford IL)，该染料可以偶联到寡核苷酸的伯胺上。
在可选择的实施方案中，一种附着有生物素的非线性活性染料可以根据本领域技术人员已知的方法进行合成，以生成染料-生物素分子，所述染料-生物素分子是生物素-荧光染料分子的非线性活性类似物，用于寡核苷酸固定化。
实施例6.5根据本领域已经确立的方法，用PyMPO，SE(Molecular ProbesCorp.)在3’或5’端(或可选择的，在胞嘧啶碱基对位置)标记一种18-25碱基对序列的肽-核酸类似物(PNA)分子标志(发夹环结构)。PNA置于纯化的水溶液中，并且用适用电场定向以产生非中心对称区域。将PNA分子和互补序列添加至标记的PNA中将会导致构象变化，并由此产生测量到的非线性光束性质的变化。
根据本领域技术人员熟知的方法，PNA(线性，非发夹环)也可以附着于玻璃或硅石表面。将序列互补的DNA添加于纯化水与含有PNA的玻璃表面接触，导致表面上PNA构象变化，并由此导致测量到的非线性光束物理性质的改变。
7.其它本发明不限于这里描述的特定实施方案的范围。事实上，除了那些这里描述的方法外，从前面的描述来看，对本发明的各种改进对所属领域技术人员是显而易见的。这些改进意欲落入附加的权利要求的范围内。
所有这里引用的文献均在此整体且为所有目的引入，并且其程度如同每个单独出版物，专利或专利申请都被特定地和单独地指出以整体且为所有目的引入。
引用的任何出版物的公开早于申请日，并且由于在先发明，不应该解释为承认本发明没有资格先于这些公开。
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<223>人工序列的描述分子标志的寡核苷酸结构<400>1aaaaaaaaaa aaaaactcgc20<210>2<211>16<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工序列的描述分子标志的寡核苷酸结构<400>2gaaaaaaaaa aaaaaa16<210>3<211>16<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工序列的描述分子标志的寡核苷酸结构<400>3gaaaaaaaca aaaaaa16<210>4<211>69<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工序列的描述分子标志的寡核苷酸结构<220>
<221>改性的碱基<222>19..49<223>n＝a，t，g，or c<400>4ctacctacag taccagcttn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnt tactcgaggg60atcctagtc69<210>5<211>25<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工序列的描述分子标志的寡核苷酸结构<400>5gcgactttt tttttttttt tctcgc 25<210>6<211>31<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工序列的描述分子标志的寡核苷酸结构<220>
<221>改性的碱基<222>28<223>t＝Biotin dT<400>6cctagctcta aatcgctatg gtcgcgctag g 3权利要求
1.一种筛选一种或多种候选结合配偶体的方法，所述配体与测试分子结合，所述方法包括(a)用一种或多种基频的一种或多种光束照射样品，所述样品包括暴露于所述一种或多种候选结合配偶体的所述测试分子；和(b)测量所述样品发出的非线性光束的一种或多种物理性质；其中(b)步骤中测量的一种或多种物理性质的值相对于所述测试分子不暴露于一种或多种候选结合配偶体时测量的一种或多种物理性质的值的变化，表明所述一种或多种候选结合配偶体与所述测试分子结合。
2.权利要求1所述的方法，其中所述测试分子结合于一种或多种非线性活性标记。
3.权利要求2所述的方法，还包括在步骤(a)之前，将所述标记结合到所述测试分子的步骤。
4.权利要求2所述的方法，其中所述一种或多种标记是共价附着的。
5.权利要求2所述的方法，其中所述测试分子非共价结合于非线性活性分子。
6.权利要求2所述的方法，其中所述测试分子和所述非线性活性标记中的一种形成融合蛋白。
7.权利要求2所述的方法，其中所述一种或多种标记包括绿色荧光蛋白或所述非线性活性蛋白的衍生物或突变体。
8.权利要求2所述的方法，其中所述标记是笼状的。
9.权利要求2所述的方法，其中所述标记是分子标志类似物。
10.权利要求2所述的方法，其中紫外光裂解所述非线性活性标记和所述测试分子之间的键。
11.权利要求2所述的方法，其中所述标记的非线性活性性质可以通过暴露于化学试剂或一种或多种光束被改变。
12.权利要求1所述的方法，其中所述候选结合配偶体结合于一种或多种非线性活性标记。
13.权利要求12所述的方法，还包括在步骤(a)之前，将所述标记与所述候选结合配偶体结合的步骤。
14.权利要求12所述的方法，其中所述一种或多种标记是共价附着的。
15.权利要求12所述的方法，其中所述候选结合配偶体非共价结合于非线性活性分子。
16.权利要求12所述的方法，其中所述候选结合配偶体和所述非线性活性标记中的一种形成融合蛋白。
17.权利要求12所述的方法，其中所述一种或多种标记包括绿色荧光蛋白或所述非线性活性蛋白的衍生物或突变体。
18.权利要求12所述的方法，其中所述标记是笼状的。
19.权利要求12所述的方法，其中所述标记是分子标志类似物。
20.权利要求12所述的方法，其中紫外光裂解所述非线性活性标记和所述候选结合配偶体之间的键。
21.权利要求12所述的方法，其中所述标记的非线性活性性质可以通过暴露于化学试剂或一种或多种光束被改变。
22.权利要求1所述的方法，其中一种或多种物理性质是强度。
23.权利要求1所述的方法，其中一种或多种物理性质是偏振方向。
24.权利要求1所述的方法，其中不存在结合于测试分子的外源非线性活性标记时，所述测试分子是非线性活性的。
25.权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种光束的波长在10～10000毫微米范围内。
26.权利要求1所述的方法，还包括将步骤(b)中测量的所述物理性质的值与不暴露于所述一种或多种候选结合配偶体时测量的物理性质的值进行比较。
27.权利要求1所述的方法，其中所述测试分子或所述候选结合配偶体结合于至少两个可区别的非线性活性标记，其中所述一种或多种光束是多重光束，并且步骤(b)包括测量至少两个从所述样品发出的非线性光束的一种或多种物理性质。
28.权利要求1所述的方法，其中所述测试分子是纯化的。
29.权利要求1所述的方法，其中所述测试分子是一种G蛋白偶联受体(GPCR)。
30.权利要求29所述的方法，其中所述GPCR结合于非线性活性标记。
31.权利要求1所述的方法，其中所述测试分子是标记的GPCR。
32.权利要求1所述的方法，其中所述非线性光束是第二谐波产生的光线。
33.权利要求1所述的方法，其中还包括将电场施加于所述样品。
34.权利要求33所述的方法，其中电场是在时间上静止的，根据时间变化的，或其组合。
35.权利要求1所述的方法，其中所述样品还包括体相。
36.权利要求35所述的方法，其中将电场应用于所述体相。
37.权利要求36所述的方法，其中电场是在时间上静止的，根据时间变化的，或其组合。
38.权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种非线性光束是第二谐波，第三谐波，一种或多种基频的和频或差频。
39.权利要求1所述的方法，其中所述测试分子是细胞，脂质体或膜表面的一部分。
40.权利要求1所述的方法，其中还包括在所述样品中不存在测试分子或候选结合配偶体的情况下，测量所述非线性光束的一种或多种物理性质。
41.权利要求1所述的方法，其中所述测试分子是天然或人工膜的一部分。
42.权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种候选结合配偶体是支持膜，脂质体或生物细胞的一部分。
43.权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种候选结合配偶体在体外偶联或结合到一固体表面。
44.权利要求43所述的方法，其中所述固体表面支持磷脂或人工双层膜。
45.权利要求44所述的方法，其中所述磷脂或人工双层包括膜蛋白。
46.权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种候选结合配偶体包括生物细胞，脂质体，囊泡，珠子，金属粒子，或非金属粒子表面的一部分。
47.权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种候选结合配偶体在固体表面上排列。
48.权利要求47所述的方法，其中所述寡核苷酸或多核苷酸附着于毫微米到微米尺寸的表面区域上。
49.权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种候选结合配偶体在一固体表面上以阵列的形式排列。
50.权利要求49所述的方法，其中所述一种或多种候选结合配偶体包括许多不同寡核苷酸或多核苷酸，所述不同寡核苷酸或多核苷酸各自包括不同的序列并附着于一固体表面的不同区域。
51.权利要求49所述的方法，其中寡核苷酸或多核苷酸以微阵列形式排列。
52.权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种候选结合配偶体包括许多不同蛋白，所述不同蛋白各自包括不同的氨基酸序列并且附着于固体表面的不同区域上。
53.权利要求52所述的方法，其中所述一种或多种包括不同氨基酸序列的候选结合配偶体各自附着于尺寸为1～1000毫微米的表面的不同区域。
54.权利要求52所述的方法，其中所述蛋白附着于尺寸为1～1000微米的表面区域。
55.权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种候选结合配偶体包括以阵列形式排列的蛋白。
56.权利要求1所述的方法，其中照射步骤涉及反射，透射，损耗波，多重内反射，近场光学，共焦，光学腔，平面波导管，纤维-光学器件或电介质板波导管。
57.权利要求1所述的方法，其中测量步骤涉及反射，透射，损耗波，多重内反射，近场光学，共焦，光学腔，平面波导管，纤维-光学器件或电介质板波导管。
58.权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种候选结合配偶体是分子标志类似物。
59.权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种候选结合配偶体附着于一表面。
60.权利要求59所述的方法，其中所述表面是金属表面，半导体表面，玻璃表面，乳胶表面，凝胶表面，纤维-光学表面，二氧化硅表面或珠子表面。
61.权利要求59所述的方法，其中所述表面是非平面表面。
62.权利要求59所述的方法，其中所述表面是化学衍生化的。
63.权利要求62所述的方法，其中所述表面是用自组装的单层衍生化的。
64.权利要求62所述的方法，其中所述表面是用有机硅烷衍生化的。
65.权利要求1所述的方法，其中测量步骤在不同时期重复进行。
66.权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种候选结合配偶体附着于自组装的单层。
67.权利要求66所述的方法，其中自组装单层属于硅烷或末端功能硅烷化学家族。
68.权利要求1所述的方法，其中测量的非线性光束的一种或多种物理性质表明所述结合的热力学或动力学性质。
69.权利要求1所述的方法，其中所述结合涉及化学键，静电力，物理吸着，化学亲和性，化学吸附，分子识别，物理-化学结合，氢键或杂交方法。
70.权利要求1所述的方法，其中非线性光束是循环偏振的。
71.权利要求1所述的方法，其中样品在一界面上，所述界面包括细胞，脂质体，囊泡表面，或固体表面。
72.权利要求1所述的方法，其中样品还包括一种或多种选自修饰分子，修饰粒子，增强剂，调节剂，抑制剂，分子标志类似物，和指示剂的物质。
73.权利要求1所述的方法，其中非线性光束的产生，收集或检测的模式是一种或多种选自反射，透射，损耗波，多重内反射，近场光学技术，共焦，光学腔，平面波导管，纤维-光学器件和电介质板波导管，和近场技术的模式。
74.权利要求1所述的方法，其中所述测试分子是药物或阻断剂。
75.一种筛选一种或多种候选调节分子的方法，所述调节分子具有调节测试分子及其结合配偶体之间相互作用的能力，所述方法包括(a)用一种或多种基频的一种或多种光束照射样品，所述样品包括所述测试分子，所述测试分子暴露于(i)所述结合配偶体，和(ii)所述一种或多种候选调节分子；和(b)测量所述样品发出的非线性光束的一种或多种物理性质；其中(b)步骤中测量的一种或多种物理性质的值相对于不暴露于一种或多种所述候选调节分子时测量的一种或多种所述物理性质的值的变化，表明一种或多种所述候选调节分子调节所述测试分子及其结合配偶体之间的相互作用。
76.权利要求75所述的方法，其中一种或多种物理性质是强度。
77.权利要求75所述的方法，其中一种或多种物理性质是偏振方向。
78.权利要求75所述的方法，其中在不存在结合于测试分子的外源非线性活性标记的情况下，所述测试分子是非线性活性的。
79.权利要求75所述的方法，其中所述一种或多种光束的波长在10～10000毫微米范围内。
80.权利要求75所述的方法，其中所述非线性光束是第二谐波产生的光线。
81.权利要求75所述的方法，其中照射步骤涉及反射，透射，损耗波，多重内反射，近场光学，共焦，光学腔，平面波导管，纤维-光学器件或电介质板波导管。
82.权利要求75所述的方法，其中测量步骤涉及反射，透射，损耗波，多重内反射，近场光学，共焦，光学腔，平面波导管，纤维-光学器件或电介质板波导管。
83.权利要求75所述的方法，其中测量步骤在不同时期重复进行。
84.权利要求75所述的方法，其中测量的非线性光束的一种或多种物理性质表明所述结合的热力学或动力学性质。
85.权利要求75所述的方法，其中所述结合涉及化学建，静电力，物理吸着，化学亲和性，化学吸附，分子识别，物理-化学结合，氢键或杂交方法。
86.权利要求75所述的方法，其中样品还包括一种或多种选自修饰分子，修饰粒子，增强剂，调节剂，抑制剂，分子标志类似物和指示剂的物质。
87.权利要求75所述的方法，其中非线性光束的产生，收集或检测的模式是一种或多种选自反射，透射，损耗波，多重内反射，近场光学技术，共焦，光学腔，平面波导管，纤维-光学器件和电介质板波导管，和近场技术的模式。
88.权利要求75所述的方法，其中所述测试分子是纯化的。
89.权利要求75所述的方法，其中所述测试分子是G蛋白偶联受体(GPCR)。
90.权利要求75所述的方法，其中所述GPCR结合于非线性活性标记。
91.权利要求75所述的方法，其中所述测试分子是标记的GPCR。
92.权利要求75所述的方法，其中还包括将电场施加于所述样品。
93.权利要求92所述的方法，其中电场是在时间上静止的，根据时间变化的，或其组合。
94.权利要求75所述的方法，其中所述样品还包括体相。
95.权利要求94所述的方法，其中将电场施加于所述体相。
96.权利要求95所述的方法，其中电场是在时间上静止的，根据时间变化的，或其组合。
97.权利要求75所述的方法，其中所述一种或多种非线性光束是第二谐波，第三谐波，一种或多种基频的和频或差频。
98.权利要求75所述的方法，其中所述样品还包括一种或多种候选结合配偶体。
99.权利要求98所述的方法，其中还包括将步骤(b)中测量到的所述物理性质的值与不暴露于一种或多种所述候选结合配偶体时测量到的物理性质的值进行比较。
100.权利要求98所述的方法，其中所述测试分子或所述候选结合配偶体结合于至少两个可区别的非线性活性标记，其中所述一种或多种光束是多重光束，并且步骤(b)包括测量所述样品发出的至少两种非线性光束的一种或多种物理性质。
101.权利要求98所述的方法，其中所述一种或多种候选结合配偶体在一固体表面上以阵列的形式排列。
102.权利要求101所述的方法，其中所述一种或多种候选结合配偶体包括许我不同寡核苷酸或多核苷酸，所述不同寡核苷酸或多核苷酸各自包括不同的序列并且附着于固体表面的不同区域。
103.权利要求101所述的方法，其中寡核苷酸或多核苷酸以微阵列的形式排列。
104.权利要求98所述的方法，其中所述一种或多种候选结合配偶体包括以阵列形式排列的蛋白。
105.权利要求98所述的方法，其中所述一种或多种候选结合配偶体是分子标志类似物。
106.权利要求98所述的方法，其中所述一种或多种候选结合配偶体附着于一表面。
107.权利要求106所述的方法，其中所述表面是金属表面，半导体表面，玻璃表面，乳胶表面，凝胶表面，纤维-光学表面，二氧化硅表面或珠子表面。
108.权利要求106所述的方法，其中所述表面是非平面表面。
109.权利要求106所述的方法，其中所述表面是化学衍生化的。
110.权利要求109所述的方法，其中所述表面是用自组装的单层衍生化的。
111.权利要求109所述的方法，其中所述表面是用有机硅烷衍生化的。
112.一种检测测试分子结合于结合配偶体时所述测试分子的构象变化的方法，所述方法包括将所述测试分子与一种或多种候选结合配偶体接触，其中测试分子或一种或多种候选结合配偶体用非线性活性部分标记，所述部分分别对测试分子或一种或多种候选结合配偶体来说不是天然的；(a)用一种或多种基频的一种或多种光束照射所述接触的测试分子；和(b)测量从所述样品发出的非线性光束的一种或多种物理性质；其中步骤(b)中测量到的所述一种或多种物理性质的值相对于不存在所述一种或多种候选结合配偶体时测量到的所述一种或多种物理性质的值的变化，表明所述一种或多种候选结合配偶体中的至少一种结合于所述测试分子，并且所述结合诱导所述候选结合配偶体，所述测试分子，或所述候选结合配偶体和所述测试分子两者的构象变化。
113.权利要求112所述的方法，其中所述一种或多种物理性质是强度。
114.权利要求112所述的方法，其中所述一种或多种物理性质是偏振方向。
115.权利要求112所述的方法，其中在不存在结合于测试分子的外源非线性活性标记的情况下，所述测试分子是非线性活性的。
116.权利要求112所述的方法，其中所述一种或多种光束的波长在10～10000毫微米范围内。
117.权利要求112所述的方法，其中还包括将步骤(b)中测量的所述物理性质的值与不暴露于所述一种或多种候选结合配偶体时测量的物理性质的值进行比较。
118.权利要求112所述的方法，其中所述测试分子或所述候选结合配偶体结合于至少两个可区别的非线性活性标记，其中所述一种或多种光束是多重光束，并且步骤(b)包括测量至少两个从所述样品发出的非线性光束的一种或多种物理性质。
119.权利要求112所述的方法，其中所述测试分子是纯化的。
120.权利要求112所述的方法，其中所述测试分子是G蛋白偶联受体(GPCR)。
121.权利要求120所述的方法，其中所述GPCR结合于非线性活性标记。
122.权利要求112所述的方法，其中所述非线性光束是第二谐波产生的光线。
123.权利要求112所述的方法，其中还包括将电场施加于所述样品。
124.权利要求123所述的方法，其中电场是在时间上静止的，根据时间变化的，或其组合。
125.权利要求112所述的方法，其中所述样品还包括体相。
126.权利要求125所述的方法，其中将电场施加于所述体相。
127.权利要求126所述的方法，其中电场是在时间上静止的，根据时间变化的，或其组合。
128.权利要求112所述的方法，其中所述一种或多种非线性光束是第二谐波，第三谐波，一种或多种基频的和频或差频。
129.权利要求112所述的方法，其中所述一种或多种候选结合配偶体在一固体表面以阵列的形式排列。
130.权利要求129所述的方法，其中所述一种或多种候选结合配偶体包括许多不同寡核苷酸或多核苷酸，所述不同寡核苷酸或多核苷酸各自包括不同的序列并且附着于一固体表面的不同区域。
131.权利要求129所述的方法，其中寡核苷酸或多核苷酸以微阵列的形式排列。
132.权利要求112所述的方法，其中所述一种或多种候选结合配偶体包括以阵列形式排列的蛋白。
133.权利要求112所述的方法，其中照射步骤涉及反射，透射，损耗波，多重内反射，近场光学技术，共焦，光学腔，平面波导管，纤维-光学器件或电介质板波导管。
134.权利要求112所述的方法，其中测量步骤涉及反射，透射，损耗波，多重内反射，近场光学技术，共焦，光学腔，平面波导管，纤维-光学器件或电介质板波导管。
135.权利要求112所述的方法，其中所述一种或多种候选结合配偶体是分子标志类似物。
136.权利要求112所述的方法，其中所述一种或多种候选结合配偶体附着于一表面。
137.权利要求136所述的方法，其中所述表面是金属表面，半导体表面，玻璃表面，乳胶表面，凝胶表面，纤维-光学表面，二氧化硅表面或珠子表面。
138.权利要求136所述的方法，其中所述表面是非平面表面。
139.权利要求136所述的方法，其中所述表面是化学衍生化的。
140.权利要求139所述的方法，其中所述表面是用自组装的单层衍生化的。
141.权利要求139所述的方法，其中所述表面是用有机硅烷衍生化的。
142.权利要求112所述的方法，其中测量步骤在不同时期重复进行。
143.权利要求112所述的方法，其中所述一种或多种候选结合配偶体附着于自组装的单层。
144.权利要求143所述的方法，其中自组装单层属于硅烷或末端功能硅烷化学家族。
145.权利要求112所述的方法，其中测量到的非线性光束的一种或多种物理性质表明所述结合的热力学或动力学性质。
146.权利要求112所述的方法，其中所述结合涉及化学建，静电力，物理吸着，化学亲和性，化学吸附，分子识别，物理-化学结合，氢键或杂交方法。
147.权利要求112所述的方法，其中样品还包括一种或多种选自修饰分子，修饰粒子，增强剂，调节剂，抑制剂，分子标志类似物和指示剂的物质。
148.权利要求112所述的方法，其中非线性光束的产生，收集或检测的模式是一种或多种选自反射，透射，损耗波，多重内反射，近场光学技术，共焦，光学腔，平面波导管，纤维-光学器件和电介质板波导管，和近场技术的模式。
149.权利要求112所述的方法，其中非线性活性标记共价结合于所述测试分子或所述一种或多种候选结合配偶体。
150.权利要求112所述的方法，其中非线性活性标记共价结合于一分子，所述分子非共价结合于所述测试分子或所述一种或多种候选结合配偶体。
151.权利要求112所述的方法，其中还包括将步骤(b)中测量的所述一种或多种物理性质的值与不存在所述一种或多种候选结合配偶体时测量的一种或多种物理性质的值进行比较。
152.一种检测测试分子与一种或多种候选结合配偶体之间结合诱导的构象变化的程度或范围的方法，所述方法包括(a)将所述测试分子和一种或多种候选结合配偶体接触，其中测试分子或一种或多种候选结合配偶体用非线性活性部分标记，所述部分分别对测试分子或一种或多种候选结合配偶体来说不是天然的；(b)用一种或多种基频的一种或多种光束照射所述接触的测试分子；和(c)测量从所述样品发出的非线性光束的一种或多种物理性质；其中步骤(c)中测量到的所述一种或多种物理性质的值相对于不存在所述一种或多种候选结合配偶体时测量到的所述一种或多种物理性质的值的变化程度，表明所述结合诱导的构象变化的程度或范围。
153.权利要求152所述的方法，其中一种或多种物理性质是强度。
154.权利要求152所述的方法，其中一种或多种物理性质是偏振方向。
155.权利要求152所述的方法，其中测试分子在不存在结合于测试分子的外源非线性活性标记的情况下，是非线性活性的。
156.权利要求152所述的方法，其中所述一种或多种光束的波长在10～10000毫微米范围内。
157.权利要求152所述的方法，其中还包括将步骤(b)中测量的所述物理性质的值与不暴露于所述一种或多种候选结合配偶体时测量的物理性质的值进行比较。
158.权利要求157所述的方法，其中所述测试分子或所述候选结合配偶体结合于至少两个可区别的非线性活性标记，其中所述一种或多种光束是多重光束，并且步骤(b)包括测量至少两个从所述样品发出的非线性光束的一种或多种物理性质。
159.权利要求152所述的方法，其中所述测试分子是纯化的。
160.权利要求152所述的方法，其中所述测试分子是G蛋白偶联受体(GPCR)。
161.权利要求160所述的方法，其中所述GPCR结合于非线性活性标记。
162.权利要求152所述的方法，其中所述非线性光束是第二谐波产生的光线。
163.权利要求152所述的方法，其中还包括将电场施加于所述样品。
164.权利要求163所述的方法，其中电场是在时间上静止的，根据时间变化的，或其组合。
165.权利要求152所述的方法，其中所述样品还包括体相。
166.权利要求165所述的方法，其中将电场施加于所述体相。
167.权利要求166所述的方法，其中电场是在时间上静止的，根据时间变化的，或其组合。
168.权利要求152所述的方法，其中所述一种或多种非线性光束是第二谐波，第三谐波，一种或多种基频的和频或差频。
169.权利要求152所述的方法，其中所述一种或多种候选结合配偶体在一固体表面上以阵列的形式排列。
170.权利要求169所述的方法，其中所述一种或多种候选结合配偶体包括许多不同寡核苷酸或多核苷酸，所述不同寡核苷酸或多核苷酸各自包括不同的序列并且附着于一固体表面的不同区域。
171.权利要求169所述的方法，其中寡核苷酸或多核苷酸以微阵列的形式排列。
172.权利要求152所述的方法，其中所述一种或多种候选结合配偶体包括以阵列形式排列的蛋白。
173.权利要求152所述的方法，其中照射步骤涉及反射，透射，损耗波，多重内反射，近场光学，共焦，光学腔，平面波导管，纤维-光学器件或电介质板波导管。
174.权利要求152所述的方法，其中测量步骤涉及反射，透射，损耗波，多重内反射，近场光学，共焦，光学腔，平面波导管，纤维-光学器件或电介质板波导管。
175.权利要求152所述的方法，其中所述一种或多种候选结合配偶体是分子标志类似物。
176.权利要求152所述的方法，其中所述一种或多种候选结合配偶体附着于一表面。
177.权利要求176所述的方法，其中所述表面是金属表面，半导体表面，玻璃表面，乳胶表面，凝胶表面，纤维-光学表面，二氧化硅表面或珠子表面。
178.权利要求176所述的方法，其中所述表面是非平面表面。
179.权利要求176所述的方法，其中所述表面是化学衍生化的。
180.权利要求179所述的方法，其中所述表面是用自组装的单层衍生化的。
181.权利要求179所述的方法，其中所述表面是用有机硅烷衍生化的。
182.权利要求152所述的方法，其中测量步骤在不同时期重复进行。
183.权利要求152所述的方法，其中所述一种或多种候选结合配偶体附着于一个自组装的单层。
184.权利要求183所述的方法，其中所述自组装的单层属于硅烷或末端功能硅烷化学家族。
185.权利要求152所述的方法，其中测量到的非线性光束的一种或多种物理性质表明所述结合的热力学或动力学性质。
186.权利要求152所述的方法，其中所述结合涉及化学建，静电力，物理吸着，化学亲和性，化学吸附，分子识别，物理-化学结合，氢键或杂交方法。
187.权利要求152所述的方法，其中样品还包括一种或多种选自修饰分子，修饰粒子，增强剂，调节剂，抑制剂，分子标志类似物和指示剂的物质。
188.权利要求152所述的方法，其中非线性光束的产生，收集或检测的模式是一种或多种选自反射，透射，损耗波，多重内反射，近场光学技术，共焦，光学腔，平面波导管，纤维-光学器件和电介质板波导管，和近场技术的模式。
189.权利要求152所述的方法，其中非线性活性标记共价结合于所述测试分子或所述一种或多种候选结合配偶体。
190.权利要求152所述的方法，其中非线性活性标记共价结合于一分子，所述分子非共价结合于所述测试分子或所述一种或多种候选结合配偶体。
191.权利要求152所述的方法，其中还包括将步骤(b)中测量的所述一种或多种物理性质的值与不存在所述一种或多种候选结合配偶体时测量的一种或多种物理性质的值进行比较。
192.权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种候选结合配偶体不附着于表面。
193.权利要求75所述的方法，其中所述一种或多种候选结合配偶体不附着于表面。
194.权利要求112所述的方法，其中所述一种或多种候选结合配偶体不附着于表面。
195.权利要求152所述的方法，其中所述一种或多种候选结合配偶体不附着于表面。
全文摘要
一种非线性光学技术，例如第二或第三谐波或和频或差频产生，被用于检测包括构象变化的结合相互作用，或结合的程度或范围。在本发明的一个方面，非线性光学技术检测探针中由于靶的结合产生的构象变化。在本发明的另一个方面，非线性光学技术通过检测由于探针－靶的相互作用产生的构象变化，来筛选候选探针。在本发明的另一个方面，非线性光学技术通过检测存在调节剂时的构象变化，来筛选探针－靶相互作用的候选调节剂。
文档编号G01N33/58GK1864066SQ03818983
公开日2006年11月15日 申请日期2003年6月6日 优先权日2002年6月6日
发明者乔舒亚·S·萨拉夫斯基 申请人:乔舒亚·S·萨拉夫斯基