专利名称：无机磷的测定方法及其诊断试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及测定无机磷的方法，以及应用该方法配制而成的诊断试剂盒，属于医学检验测定技术领域。
背景技术：
人体内部的磷元素约有87％存在于骨骼中，血液中的磷与骨骼中的磷保持动态平衡关系。另一方面，血液中钙和磷的浓度之间有一定关系，两者的乘积保持在一定范围之内，以毫克为单位，大约每100毫升血浆中钙和磷的含量之积为35～40。正常人血钙升高则血磷降低，反之亦然。当上述乘积大于40时，钙和磷以骨盐形式沉积在骨组织；大于70时，可发生转移性钙化；小于35时，则将妨碍骨组织的钙化，甚至使骨盐再溶解，影响成骨作用，引起佝偻病或软骨病。一般地，可以通过维生素D、甲状旁腺激素、降钙素等来调节血浆中钙和磷的浓度。
目前，人体的含磷总量还不能直接测定，大多是检测血浆或血清中磷酸根离子浓度来反映。由于H2PO4-在血液等自然条件下最能稳定存在，是无机磷的主要存在形式，因而测定H2PO4-的浓度便能间接代表或推知无机磷的总量。常用的检测方法有磷钼酸还原法/非还原法、染料结合法、酶法、同位素稀释质谱法、原子吸收分光光度法、流动注射分析法等等。其中，决定性的方法是同位素稀释质谱法，中等实验室推荐使用的常规方法是磷钼酸比色法。
磷钼酸还原法又分“无蛋白血滤液法”和“不去蛋白法”，前者需将血液先去蛋白，后者需在试剂中加入非离子型表面活性剂以避免混浊。所用还原剂和表面活性剂的种类很多，性能比较稳定的还原剂有硫酸亚铁、硫酸亚铁铵、硫酸肼、米吐尔等，表面活性剂则以聚乙二醇基苯基醚(TritonX-100)最理想。
磷钼酸非还原法又称“直接紫外法”，是在340nm或325nm波长直接测定磷钼酸杂聚化合物，方法简便，便于自动化。但黄疸、溶血、脂浊血清在340nm有吸收，必须做标本空白，否则结果偏高。
相比于其它检测方法，酶法以其选择性好、灵敏度高、可实现自动化分析等优点而备受人们青睐，用酶法测定无机磷含量既是目前人们的研究热点，也是将来的发展趋势。但是，采用不同的试剂和测试路线，检测的灵敏度、检测结果的准确性会有很大的差别，直接影响到该方法的使用与推广。
发明内容
本发明的目的是提供一种酶法测定无机磷含量的方法，以及应用该方法配制而成的无机磷诊断试剂盒。采用该试剂盒中的试剂，能够利用紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪对血浆、血清等样品中无机磷的含量进行快速、准确测定，以便推广使用该检测方法和诊断试剂，使本领域内医学检验测试手段得到丰富和发展。
为实现本发明的目的，一种测定无机磷的方法，通过以下步骤进行首先，将血浆、血清等需要测定的样品与含有甘油醛-3-磷酸、甘油醛-3-磷酸脱氢酶和氧化型辅酶的试剂混匀，使之发生以下反应，
然后，将反应混合物置于紫外/可见光分析仪或者半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm的吸光度的上升速度，进而测算出样品中无机磷的含量。
测定过程中，被测样品与试剂的使用比例按体积控制在1∶10～1∶500，反应温度控制在20℃～50℃，反应时间控制在2～30分钟，检测时设定副波长在405nm以上。
实现本发明方法测定血浆、血清等样品中无机磷含量的诊断试剂盒可以是单剂，由以下成分组成缓冲液 40～200mmol/l，甘油醛-3-磷酸 1～20mmol/l，氧化型辅酶 0.5～5mmol/l，甘油醛-3-磷酸脱氢酶 5000～50000U/l，稳定剂/试剂总体积 10～80％。
也可以将以上单剂中的各种成分进行组合，配制成双剂，比如 双剂的配方不仅仅限于上述表中所列，其中试剂I的成分甘油醛-3-磷酸、氧化型辅酶等可以放在试剂II，试剂II中的甘油醛-3-磷酸脱氢酶也可以放到试剂I，如此可以形成多种配方，不再一一列举。
为使试剂更稳定，还可以配制成三剂，比如
与双剂类似，三剂的配方也不仅仅限于上述配方，其中试剂I的氧化型辅酶可以放在试剂II或试剂III中，试剂II中的甘油醛-3-磷酸可以放在试剂I或试剂III中，试剂III中的甘油醛-3-磷酸脱氢酶也可以放到试剂I或者试剂II中，如此可以形成多种配方，不再一一列举。
上述诊断试剂盒的成分当中，选择缓冲液的基本要求是PH值在6.0～11.0范围之内，可以是“三羟甲基氨基甲烷～盐酸(Tris-HCl)缓冲液”、“三乙醇胺(Triethanolamine)缓冲液”、“2-氨基-2-甲基-1-丙醇(2-Amino-2-methyl-1-propanol)缓冲液”、“咪唑～盐酸(Imidazole-HCl)缓冲液”、“双甘氨肽(Glycylglycine)缓冲液”、“柠檬酸～柠檬酸钠缓冲液”、“巴比妥钠～盐酸缓冲液”、“硼酸～硼砂缓冲液”、“甘氨酸～氢氧化钠缓冲液”、“硼砂～氢氧化钠缓冲液”或者“碳酸钠～碳酸氢钠缓冲液”中的至少一种，但选择范围并不受这些列举所限制。
此外，为减少各试剂成分之间的交叉影响、保持试剂的稳定性，以便长期储存，以上单剂、双剂的试剂I/试剂II、三剂的试剂I/试剂II/试剂III当中通常加入稳定剂，其用量约占所在试剂总体积的10～80％(或者浓度在10～50mmol/l范围之内)。
用作稳定剂的物质可以是乙二醇、丙二醇、甘油、硫酸铵、硫基乙醇、腺苷二磷酸、牛血清白蛋白、碳酸盐、胆酸盐、葡聚糖、乙二胺四乙酸、黄素腺嘌呤二核苷酸、黄素单核苷酸、葡萄糖、谷氨酸盐、还原型谷胱甘肽、乳糖、甘露醇、丁二酸盐或者氯化钠中的至少一种。
上述无机磷诊断试剂盒的试剂成分当中，所述氧化型辅酶是——氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD+、氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸NADP+、氧化型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸thio-NAD+或者氧化型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸thio-NADP+；所述还原型辅酶是——还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸NADPH、还原型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸thio-NADH或者还原型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸thio-NADPH。
研究表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下配方成分关系的无机磷诊断试剂盒较为理想，也是本发明的优选方案缓冲液80～120mmol/l，甘油醛-3-磷酸 2～10mmol/l，氧化型辅酶1～4mmol/l，甘油醛-3-磷酸脱氢酶 10000～30000U/l，稳定剂/试剂总体积 20～50％。
本发明利用甘油醛-3-磷酸脱氢酶在血浆、血清等样品中的无机磷的激活下与甘油醛-3-磷酸作用，将氧化型辅酶反应成还原型辅酶。由于还原型辅酶在340nm有非常明显的吸收峰，而它们对应的氧化型辅酶在340nm没有吸收峰，因此，测量反应前后340nm处吸光度的上升幅度，便能很好地反映出被测样品中无机磷的含量。
本发明技术方案的突出的实质性特点和显著的进步主要表现在(1)本发明完全利用酶学方法，酶解反应具有特异性高的特点，通过将氧化型辅酶反应成还原型辅酶，定量反映出被测样品中无机磷的含量，测试结果准确；(2)参与酶偶联反应系统的反应成分都是外加的，不受内、外源物质的污染，测试过程精确度高；(3)该方法简便、易操作，可快速得到检测结果，而且反应是在缓冲液条件下进行，不会污染环境；(4)该方法在普通紫外/可见光分析仪或者半、全自动生化分析仪上便可检测，不需要特殊或额外仪器，测试成本低廉，便于行业内推广应用；(5)应用本发明提供的测定方法可以制成液态试剂、干粉试剂、干试剂等多种形式的试剂，主要用于测定人体和其它动物体内血磷的含量，也可以结合稀释、浓缩等辅助手段来测定其它样品中无机磷的含量；(6)本发明提供的液态无机磷诊断试剂盒，稳定性好，存在于其中的各种酶的三维空间结构保持完整，很好地保证了应用测试效果。做成双剂或者三剂以后，能够进一步减少各种成分之间的交叉影响，提高试剂的稳定性，便于长期储存。
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明技术方案作进一步说明。这些例子仅是一些应用范例，不能理解为对本发明权利要求保护范围的一种限制。
实施例一(单剂)按以下成分和用量配制血清中无机磷诊断试剂盒双甘氨肽缓冲液 80mmol/l，甘油醛-3-磷酸 2mmol/l，thio-NAD+1mmol/l，甘油醛-3-磷酸脱氢酶 10000U/l，乙二醇 50％(占试剂总体积)。
在全自动生化分析仪(日立-7080)上设定温度37℃、反应时间10分钟、测试主波长340nm、测试副波长405nm以上，被测样品与试剂的体积比例为1∶25，反应方向为正反应(吸光度上升，下同)。
加入血清样品和配成的单剂，两者在分析仪内部自动混匀，检测、记录340nm吸光度的上升情况。一共检测读点31次，大约每隔20秒记录一次数据，根据速率法、终点法等方法，对照相应的标准曲线测算出血清样品中无机磷的含量。对同一批样品多次重复以上过程，测试结果重复性好、精确度高。
实施例二(双剂)按以下成分和用量配制血清中无机磷诊断试剂盒试剂I——咪唑～盐酸缓冲液 100mmol/l，甘油醛-3-磷酸 6mmol/l，NADP+2mmol/l，甘油 20mmol/l；试剂II——咪唑～盐酸缓冲液 100mmol/l，甘油醛-3-磷酸脱氢酶 20000U/l，乙二醇50％(占试剂II总体积)。
在全自动生化分析仪(日立-7080)上设定温度30℃、反应时间15分钟、测试主波长340nm、测试副波长405nm以上，被测样品与试剂I和试剂II的总体积之比为1∶25，试剂I与试剂II的用量之比为4∶1，反应方向为正反应。
先加入血清样品和试剂I，5分钟之后加入试剂II，三者在分析仪内部自动混匀，检测、记录340nm吸光度的上升情况。根据速率法、终点法等方法，对照相应的标准曲线测算出血清样品中无机磷的含量。对同一批样品多次重复以上过程，测试结果重复性好、精确度高。
实施例三(三剂)按以下成分和用量配制血清中无机磷诊断试剂盒试剂I——
三乙醇胺缓冲液 120mmol/l，thio-NADP+4mmol/l，丙二醇 50％(占试剂I总体积)；试剂II——三乙醇胺缓冲液 120mmol/l，甘油醛-3-磷酸 10mmol/l，丙二醇 50％(占试剂II总体积)；试剂III——三乙醇胺缓冲液 120mmol/l，甘油醛-3-磷酸脱氢酶 30000U/l，乙二醇 50％(占试剂III总体积)。
在全自动生化分析仪(日立-7080)上设定温度25℃、反应时间20分钟、测试主波长340nm、测试副波长405nm以上，被测样品与试剂I、试剂II和试剂III的总体积之比为1∶25，试剂I、试剂II和试剂III的用量为8∶1∶1，反应方向为正反应。
先加入血清样品和试剂I、试剂II，5分钟之后加入试剂III，它们在分析仪内部自动混匀，检测、记录340nm吸光度的上升情况。根据速率法、终点法等方法，对照相应的标准曲线测算出血清样品中无机磷的含量。对同一批样品多次重复以上过程，测试结果重复性好、精确度高。
实施例四(双剂优选例)按以下成分和用量配制血磷诊断试剂盒试剂I——Tris-HCl缓冲液 100mmol/l，甘油醛-3-磷酸 2mmol/l，NAD+2mmol/l，甘油50％(占试剂I总体积)；
试剂II——Tris-HCl缓冲液 100mmol/l，甘油醛-3-磷酸脱氢酶 10000U/l，甘油50％(占试剂II总体积)。
在全自动生化分析仪(日立-7080)上设定温度37℃、反应时间10分钟、测试主波长340nm、测试副波长405nm以上，被测样品与试剂I和试剂II的总体积之比为1∶25，试剂I与试剂II的用量之比为4∶1，反应方向为正反应。
先加入血清样品和试剂I，5分钟之后加入试剂II，三者在分析仪内部自动混匀，发生以下原理性反应
检测、记录340nm吸光度的上升情况。根据速率法、终点法等方法，对照相应的标准曲线测算出血清样品中无机磷的含量。对同一批样品多次重复以上过程，测试结果重复性好、精确度高。
总之，实验证明采用本发明的测定方法，完全可以通过紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪器，测定出血浆、血清等样品中无机磷的含量，测试灵敏度高、精确度好，不受内、外源物质的污染。而且，本发明提供的无机磷诊断试剂盒，稳定性好，长时间存放之后仍然能够准确检测各种类型样品中的无机磷含量。
权利要求
1.一种测定无机磷的方法，包括以下步骤①将待测样品与含有甘油醛-3-磷酸、甘油醛-3-磷酸脱氢酶和氧化型辅酶的试剂混匀，使之发生以下反应， ②将反应混合物置于紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪下，检测主波长340nm的吸光度的上升幅度，测算出样品中无机磷的含量。
2.根据权利要求1所述的测定无机磷的方法，其特征在于待测样品与试剂的使用比例按体积控制在1∶10～1∶500。
3.根据权利要求1或2所述的测定无机磷的方法，其特征在于反应温度控制在20℃～50℃，反应时间控制在2～30分钟，检测时设定副波长在405nm以上。
4.一种无机磷诊断试剂盒，盒中试剂由以下成分组成缓冲液 40～200mmol/l，甘油醛-3-磷酸 1～20mmol/l，氧化型辅酶 0.5～5mmol/l，甘油醛-3-磷酸脱氢酶 5000～50000U/l，稳定剂/试剂总体积 10～80％。
5.根据权利要求4所述的无机磷诊断试剂盒，其特征在于所述缓冲液的PH范围是6.0～11.0。
6.根据权利要求5所述的无机磷诊断试剂盒，其特征在于所述缓冲液是“三羟甲基氨基甲烷～盐酸缓冲液”、“三乙醇胺缓冲液”、“2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲液”、“咪唑～盐酸缓冲液”、“双甘氨肽缓冲液”、“柠檬酸～柠檬酸钠缓冲液”、“巴比妥钠～盐酸缓冲液”、“硼酸～硼砂缓冲液”、“甘氨酸～氢氧化钠缓冲液”、“硼砂～氢氧化钠缓冲液”或者“碳酸钠～碳酸氢钠缓冲液”中的至少一种。
7.根据权利要求4所述的无机磷诊断试剂盒，其特征在于所述稳定剂为乙二醇、丙二醇、甘油、硫酸铵、硫基乙醇、腺苷二磷酸、牛血清白蛋白、碳酸盐、胆酸盐、葡聚糖、乙二胺四乙酸、黄素腺嘌呤二核苷酸、黄素单核苷酸、葡萄糖、谷氨酸盐、还原型谷胱甘肽、乳糖、甘露醇、丁二酸盐或者氯化钠中的至少一种。
8.根据权利要求4所述的无机磷诊断试剂盒，其特征在于所述氧化型辅酶是——氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD+、氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸NADP+、氧化型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸thio-NAD+或者氧化型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸thio-NADP+；所述还原型辅酶是——还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸NADPH、还原型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸thio-NADH或者还原型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸thio-NADPH。
9.权利要求4～8中任意一项无机磷诊断试剂盒，其特征在于所述试剂配成单剂、双剂或者三剂。
全文摘要
本发明涉及测定无机磷的方法及其诊断试剂盒。利用甘油醛－3－磷酸脱氢酶在血浆、血清等样品中的无机磷的激活下与甘油醛－3－磷酸作用，将氧化型辅酶反应成还原型辅酶，检测反应前后主波长340nm处吸光度的上升幅度，从而测算出样品中无机磷的含量。该方法特异性高，不受内、外源物质的污染，测试结果精确、准确性好。将诊断试剂盒制成双剂或三剂可减少各成分的交叉影响，保持试剂的稳定性，便于长期储存。该方法在普通紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪上便可快速检测，不需要特殊或额外仪器，测试成本低廉，便于行业内推广应用。
文档编号G01N21/31GK1779464SQ200410065570
公开日2006年5月31日 申请日期2004年11月23日 优先权日2004年11月23日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司