专利名称：高效液相色谱法测定竹红菌甲素含量的方法
技术领域：
本发明涉及一种色谱检测方法，具体涉及一种高效液相色谱法测定竹红菌甲素含量的方法。
背景技术：
竹红菌素(Hypocrellin)是我国首次发现并应用于临床的新型光疗药物。临床证明它对某些皮肤顽症有明显的光敏治疗作用，其中包括用于治疗肥厚性瘢痕、皮肤淀粉样苔藓、牛皮藓，白癜疯等皮肤病。经过十多年来对竹红菌素的结构、光化学、光物理、光生物、药理学等各方面的广泛系统的研究，研究工作者发现与其它类型的光敏剂相比，竹红菌素作为一种新型的光敏剂，具有易纯化、化学修饰性好、三重态量子产率高、单重态氧量子产率高、光毒性高、从正常组织排出速度快等优点，因此被公认为是一种极有应用前景的光疗药物。竹红菌素又具有抗癌活性，对实体肉瘤和体外癌细胞具有明显的抑制作用。竹红菌素中最主要的光敏成分为竹红菌甲素(HA)。它属于羟基苝醌类衍生物(图1)。有关它的定量分析研究目前还很少。目前竹红菌甲素含量的测定主要运用分光光度计测量其紫外吸收值，容易受杂质干扰，误差较大。
竹红菌药物正越来越得到广泛运用，竹红菌甲素的科学研究也越来越广泛深入。这一切都对竹红菌甲素定量检测方法的准确性和简便性提出了更高的要求，目前所用的分光光度计定量方法已经不能满足科学发展的需要。特别是，竹红菌甲素一般都由天然产物中提取，而天然提取产物中一般都含有大量的杂质存在。如果选用一般的紫外或示差折光检测器，则这些杂质常常存在于竹红菌甲素色谱峰周围，甚至与竹红菌甲素的色谱峰相叠加，影响了竹红菌甲素定量的准确性。在大量的实验比较后，发明人发现，利用竹红菌甲素的荧光发射性质，如果选用荧光检测器，则可以解决这一难题。竹红菌甲素在激发光为410nm时，于610nm处发射较强的荧光，而大部分杂质都不具备这一发光的特性。因此，选用荧光检测器，并将检测波长定在此处，则大部分杂质都被滤过而不出现在色谱峰中，对竹红菌甲素的色谱测定不造成影响，而保证了竹红菌甲素定量的准确性。
目前之所以没有竹红菌甲素色谱方面的研究成果，是因为要找到适合竹红菌甲素的色谱分析方法相当困难。所做的大量实验表明，竹红菌甲素在一般的C18，C8，以及离子交换色谱柱上，均呈现拖尾达数分钟的扁平色谱峰，改变流动相的洗脱强度，pH值，缓冲盐浓度等均无法使之优化；竹红菌甲素色谱峰不仅峰形差，而且理论塔板数很低，在对竹红菌提取液的分析中，达不到可行的分离效果和回收率。发明人推断这种现象可能是竹红菌甲素分子中的羟基、羰基、以及甲氧基等基团与色谱柱中的硅羟基的作用引起。
发明内容
竹红菌甲素作为新型的光疗药物正广泛用于临床及科学研究。为了提高竹红菌甲素定量的准确性和简便性，避免杂质干扰，适应临床药物及科学研究的需要，本实验首次将反相高效液相色谱法用于竹红菌提取物中竹红菌甲素含量进行测定。针对分光光度计方法的缺点，设计一种快速简便，选择性强，灵敏度高，准确并且容易操作的测定竹红菌甲素浓度的方法。
结合目前色谱柱技术对硅羟基活性的研究成果，发明人选用不同的已知硅羟基活性的色谱柱进行实验，结果发现，硅羟基活性越高，色谱峰越扁平，拖尾越严重，证实了发明人的推断。因而，发明人选用运用双封端保证很低硅羟基活性的Zorbax Extend C18柱，获得良好的峰形，竹红菌甲素色谱峰的理论塔板数达到4000以上。
经过大量比较实验，最后选用能去掉大量杂质影响的荧光检测法。荧光检测器除了选择性好的优点外，又具有灵敏度高的特点，因而本发明的检测最小量达到纳克级，对竹红菌甲素产业化后的质量控制具有实际意义。
所以，本发明目的可以通过以下技术方案实现一种高效液相色谱法测定竹红菌甲素含量的方法，包括以下步骤a.色谱柱选用Zorbax Extend-C18 column(4.6mm ID×150mm，5μm)；b.以甲醇和水作为色谱流动相；c.所用条件为柱温30℃，流速1ml/min；荧光检测器激发波长410nm；发射检测波长610nm。
在选择适合的流动相方面，发明人也做了大量的实验摸索。为了研究流动相pH值对保留时间的影响，在甲醇与水的流动相体系中将水的pH值用乙酸和三乙胺分别调到pH＝3.5、4.2、5.0、7.5、8.2。与未加酸碱调节的流动相比较发现，随着pH值逐渐降低，保留时间略有增加，但伴随着峰形展宽；而碱性pH值使保留时间略有减小但样品组分间分离度降低。总地来说，pH值改变对样品分离的影响不大。从分子结构角度来看，竹红菌甲素分子中含有羟基、羰基等基团，但羟基中的H已和旁边羰基的O原子形成氢键，而这样的稳定结构使流动相的酸碱度对其影响不大。因而发明人选用甲醇与水作为流动相系统。而在甲醇与水作为流动相的系统中，随着甲醇比例的增大，竹红菌甲素保留时间迅速减小。考虑到分析时间、分离度及峰形等综合因素，最后选择甲醇/水＝83/17(体积比)，柱温30℃。
本发明技术进步在于测定准确，方法简单，灵敏度高，方法专一。
1.线性试验及检测限试验表明，在一定浓度下，竹红菌甲素的回归方程的相关系数γ＝0.9999，线性范围内线性关系很好，易于定量准确。检出限(S/N＝3)为1.2ng，最小可测的量达到纳克级，灵敏度高。
2.精密度试验测出相对标准偏差为0.3％左右，表明方法的重复性很好。
3.整个实验过程约半小时，也就是说，在半小时内，运用本方法即能成功将竹红菌甲素与其他杂质分开，并准确测量出其含量。
图1、图2分别为竹红菌甲素标准品、竹红菌提取液样品的液相色谱图。
具体实施例方式
实施例1取采自云南浦江县的竹红菌样品，干燥粉碎，准确称取约1g，加入甲醇250ml，称重，于避光条件下70℃水浴中回流50min。冷却后加甲醇补足减失质量，摇匀后过滤。续滤液过0.45μm微孔滤膜后进样，对其中的竹红菌甲素含量进行分析，得到其中的竹红菌甲素含量分别为28.0mg/g。
实施例2取采自云南宁蒗县的竹红菌样品，干燥粉碎，准确称取约1g，加入甲醇250ml，称重，于避光条件下70℃水浴中回流50min。冷却后加甲醇补足减失质量，摇匀后过滤。续滤液过0.45μm微孔滤膜后进样，对其中的竹红菌甲素含量进行分析，得到其中的竹红菌甲素含量分别为27.2mg/g。
工作原理和工作过程流动相甲醇和水载着竹红菌甲素等被测物质进入色谱柱，ZorbaxExtend-C18色谱柱将竹红菌甲素与其他杂质分开，使它们依次到达荧光检测器被检测识别，检测器给出不同成分的响应值，分别对应其进样量的多少。
权利要求
1.一种高效液相色谱法测定竹红菌甲素含量的方法，包括以下步骤a.色谱柱选用Zorbax Extend-C18 column；b.以甲醇和水的体积比为83∶17作为色谱流动相；c.所用条件为柱温30℃，流速1ml/min；荧光检测器激发波长410nm；发射检测波长610nm；进样体积为10μl。
2.按照权利要求1所述的高效液相色谱法测定竹红菌甲素含量的方法，其特征在于作为色谱流动相的甲醇/水的体积比为83/17。
全文摘要
高效液相色谱法测定竹红菌甲素含量的方法，包括以下步骤a.色谱柱选用Zorbax Extend－C18 column；b.以甲醇和水的体积比为83∶17作为色谱流动相；c.所用条件为柱温30℃，流速1ml/min；荧光检测器激发波长410nm；发射检测波长610nm；进样体积为10μl。优化方案中，作为色谱流动相的甲醇/水的体积比为83/17。本发明以大量实验和理论分析，找到了适合竹红菌甲素的色谱分析方法，填补了竹红菌甲素色谱方面的研究空白。
文档编号G01N30/00GK1648656SQ20041006598
公开日2005年8月3日 申请日期2004年12月29日 优先权日2004年12月29日
发明者周家宏, 顾晓天, 冯玉英, 魏少华 申请人:南京师范大学