专利名称：神经生长因子蛋白的含量测定方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及神经生长因子蛋白的含量测定方法，具体地说，涉及小鼠神经生长因子的双抗体夹心酶联免疫测定方法。
背景技术：
神经生长因子(NGF)是神经系统最重要的生物活性分子之一，也是最早发现和最典型的神经营养因子，它影响外周和中枢神经系统某些神经元的存活和分化。通常NGF由其效应神经元支配的靶组织细胞合成和分泌，它与神经末梢上的相应受体结合后进入轴突，再经逆行轴浆转运至胞体。在此过程中引起一系列的生物效应，如诱导突起生长，促进某些蛋白和酶的合成等。
虽然对于神经生长因子的测定已经有一些研究成果，但其测定的准确度差。因此，长期以来一直需要提供一种简便准确的测定方法。本发明的发明人经过长期试验，在小鼠神经生长因子的成品中，添加了保护剂和稳定剂，采用双抗体夹心酶联免疫测定方法，测定了神经生长因子的含量。
发明内容
本发明要解决的问题是提供一种NGF的蛋白含量测定方法，该方法包括(1)用抗体稀释液稀释包被抗体，并将所述抗体包被在聚苯乙烯微孔板上作为固相化抗体，其中所述的包被抗体用包被液配制使得其浓度为1～50μg/ml，每孔加10～360μl，0～10℃密封过夜；(2)弃去孔内液体，用洗涤液洗1～10次，除尽孔内残液；(3)每孔加入封闭液50～360μl，室温孵育30分钟～3小时；(4)弃去孔内液体，用洗涤液洗1～10次，除尽孔内残液；(5)每孔各加入10～360μl样品或系列稀释的标准品，室温孵育30分钟～5小时；(6)弃去孔内液体，用洗涤液洗1～10次，除尽孔内残液；(7)每孔各加入10～360μl溶液抗体(0.1～10μg/ml)，室温孵育30分钟～5小时；(8)弃去孔内液体，用洗涤液洗1～10次，除尽孔内残液；(9)每孔各加入10～360μl酶标抗体(1∶2000～1∶5000稀释)，室温孵育30分钟～3小时；(10)每孔各加入10～360μl底物混合液，避光处静置5～60min；(11)弃去孔内液体，用洗涤液洗1～10次，除尽孔内残液；(12)每孔各加入5～360μl终止液，3～60min后利用酶联仪在450nm的波长下测定该标准品的吸收值(OD450值)。
在本发明的一个优选实施方案中，该测定方法是双抗体夹心酶联免疫测定方法。
在本发明的一个优选实施方案中，该测定方法是一种mNGF的双抗体夹心酶联免疫测定方法。
在本发明的一个优选实施方案中，该测定方法中包被抗体是抗人神经生长因子单克隆抗体；溶液抗体是抗小鼠神经生长因子多克隆抗体。
在本发明的一个优选实施方案中，包被液浓度配制成含包被抗体5～50μg/ml，每孔加入量为100～360μl。
在本发明的一个优选实施方案中，洗涤液的用量为200～300μl/孔，每次洗涤分3～5次进行，以除尽孔内残液。
在本发明的一个优选实施方案中，封闭液的加入量为200～360μl/孔，室温孵育60分钟～3小时。
在本发明的一个优选实施方案中，样品或系列稀释的标准品的加入量为100～360μl/孔，室温孵育60～120分钟。
在本发明的一个优选实施方案中，溶液抗体的浓度为1～10μg/ml，其加入量为100～360μl/孔，室温孵育60～120分钟。
在本发明的一个优选实施方案中，酶标抗体以1∶2000～1∶5000倍稀释，每孔各加入100～360μl，室温孵育30～60分钟。
在本发明的一个优选实施方案中，每孔各加入100～360μl底物混合液，避光处静置5～10min。
在本发明的一个优选实施方案中，每孔各加入50～360μl终止液，5～60min后测定OD450。
该测定方法可用来定性或定量检测NGF的存在与否及其含量。
具体实施例方式
下面通过具体实施方式
描述本发明的方法，其用于说明本发明的内容，而非限制其范围。
本发明方法中所用试剂、材料及设备如下所述包被抗体抗人神经生长因子单克隆抗体(anti hNGF monoclonalantibody)，进口；溶液抗体抗小鼠神经生长因子多克隆抗体(anti mNGF polyclonalantibody)，进口；酶标抗体辣根酶标记山羊抗兔IgG(H+L)，进口分装；标准品mNGF应用国家药检所提供的标准品mNGF标定的工作标准，准确配制所需的各标准品浓度溶液；包被液PBS，pH7.4；封闭液1-3％BSA，5％sucrose，0.05％NaN3in PBS；洗涤液0.1～0.3％Tween20 in PBS，pH7.4；抗体稀释液0.1％BSA，0.1～0.3％Tween20 in TBS，pH7.3(20mMTrizma base，150mM NaCl)；底物显色液用前等体积混合底物显色液A液和B液；终止液1M H2SO4；仪器与设备微孔板可拆卸96孔酶联板，Costar产品；酶标仪、多道移液器等仪器设备使用前校准。
样品准备样品为注射用冻干粉，测定前每支安瓿准确用注射用生理盐水1ml溶解，再用抗体稀释液根据需要稀释。
实施例11.先用抗体稀释液稀释包被抗体后，用包被液配制5μg/ml包被抗体，并将其包被在聚苯乙烯微孔板上，作为固相化抗体，以3个孔做平行实验，每孔加100μl，4℃密封过夜；2.弃去孔内液体，用洗涤液200-300μl/孔洗3-5次，除尽孔内残液；3.每孔加入封闭液200μl，室温孵育60min；4.重复步骤2，300μl/孔洗5次，除尽孔内残液；5.每孔各加入100μl浓度为12.5ng/ml的标准品，室温孵育60～120min；6.重复步骤4；7.每孔各加入100μl溶液抗体(1μg/ml)，室温孵育60～120min；8.重复步骤4；9.每孔各加入100μl酶标抗体(1∶2000～1∶5000稀释)，室温孵育30～60min；10.重复步骤4；11.每孔各加入100μl底物混合液，避光处静置5～10min；12.每孔各加入50μl终止液，5min后利用酶联仪在450nm的波长下测定该标准品的吸收值(OD450值)。
实施例2-5重复实施例1的操作步骤进行实施例2-5，只是标准品的浓度分别为0ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml。根据各个浓度下标准品所测得的数据计算其平均值，根据得到的平均值绘制标准曲线。
实施例6-8重复实施例1的操作步骤进行实施例6-8，只是将其中的标准品分别替换为所测样品1-3。利用得到的标准曲线，根据所测结果可以得出样品中神经生长因子的测定结果。
样品含量可以通过公式y(样品浓度)＝a(截距)+b(斜率)×(OD450值)进行计算。实际样品浓度需要乘以样品稀释倍数获得。样品1-3中的含量测定结果见下表1。
表1三批样品测定结果
以上参考具体实施方式
描述了本发明内容，其只用于说明本发明的内容，而非用于限制本发明的范围。本发明的范围应当以所附权利要求书为准。本领域的普通技术人员根据本发明的描述进行的多种修改和变动都将落入本发明的精神和范围内。
权利要求
1.一种神经生长因子的含量测定方法，所述方法包括将一种包被抗体定量包被在微孔板上，作为固相化抗体；向其中加入一定量样品孵育后，洗去没有结合的组分；再加入匹配量溶液抗体孵育；洗去没有结合的组分后，利用酶标抗体与底物的显色反应显色；测定样品吸收值，利用标准曲线，得出样品含量。
2.一种神经生长因子的含量测定方法，该方法包括下述顺序的步骤(1)用抗体稀释液稀释包被抗体，并将所述抗体包被在微孔板上作为固相化抗体，其中所述的包被抗体的浓度配制为1～50μg/ml，每孔加10～360μl，0～10℃密封过夜；(2)弃去孔内液体，用洗涤液洗1～10次，除尽孔内残液；(3)每孔加入封闭液50～360μl，室温孵育30分钟～3小时；(4)弃去孔内液体，用洗涤液洗1～10次，除尽孔内残液；(5)每孔各加入10～360μl样品或系列稀释的标准品，室温孵育30分钟～5小时；(6)弃去孔内液体，用洗涤液洗1～10次，除尽孔内残液；(7)每孔各加入10～500μl浓度为0.1～10μg/ml的溶液抗体，室温孵育30分钟～5小时；(8)弃去孔内液体，用洗涤液洗1～10次，除尽孔内残液；(9)每孔各加入10～360μl以1∶2000～1∶5000稀释的酶标抗体，室温孵育30分钟～3小时；(10)每孔各加入10～360μl底物混合液，避光处静置5～60min；(11)弃去孔内液体，用洗涤液洗1～10次，除尽孔内残液；(12)每孔各加入5～360μl终止液，3～60min后测定吸收值，根据该吸收值得到样品含量。
3.权利要求2的测定方法，其特征在于所述NGF是mNGF。
4.权利要求2的测定方法其特征在于包被抗体是抗人神经生长因子单克隆抗体；溶液抗体是抗小鼠神经生长因子多克隆抗体。
5.权利要求2的测定方法，其特征在于用包被液配制的包被抗体的溶液中含有5～50μg/ml的包被抗体，每孔加入100～360μl，4～10℃密封过夜。
6.权利要求2的测定方法，其特征在于每孔加入封闭液200～360μl，室温孵育60分钟～3小时。
7.权利要求2的测定方法，其特征在每孔各加入100～360μl待测品，室温孵育60～120分钟。
8.权利要求2的测定方法，其特征在每孔各加入浓度为1～10μg/ml的溶液抗体100～360μl，室温孵育60～120分钟。
9.权利要求2的测定方法，其特征在于每孔各加入100～360μl以1∶2000～1∶5000倍稀释的酶标抗体，室温孵育30～60分钟。
10.权利要求2的测定方法，其特征在于每孔各加入100～360μl底物混合液，避光处静置5～10min。
全文摘要
本发明涉及神经生长因子的蛋白含量测定方法，具体地说，涉及小鼠神经生长因子的双抗体夹心酶联免疫测定方法。该测定方法可用来定性或定量检测NGF的存在与否及其含量。
文档编号G01N33/52GK1790024SQ20041010147
公开日2006年6月21日 申请日期2004年12月16日 优先权日2004年12月16日
发明者陆仙芸, 林德君 申请人:浙江永宁制药厂